БИОХИМИЯ, 2023, том 88, вып. 1, с. 125 - 135

УДК 577.152.313

ВЛИЯНИЕ ДЕЛЕЦИИ ГЕНОВ,

КОДИРУЮЩИХ Pho3p И Bgl2p, НА УРОВЕНЬ ПОЛИФОСФАТОВ,

АДАПТАЦИЮ К СТРЕССУ И ЗАКРЕПЛЕНИЕ ЭТИХ БЕЛКОВ

В КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКЕ Saccharomyces cerevisiae

Р.Х. Зиганшин³, Н.В. Мармий⁴, Д.С. Есипов⁵, Т.В. Кулаковская²

¹Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

биологический факультет, кафедра молекулярной биологии,

119234 Москва, Россия; электронная почта: kalebina@gmail.com

²ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук»,

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290 Пущино, Россия

³ Институт биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997 Москва, Россия

⁴ «НИИ Митоинженерии МГУ», 119992 Москва, Россия

⁵Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

биологический факультет, кафедра биоорганической химии, 119234 Москва, Россия

Поступила в редакцию 25.07.2022

После доработки 07.11.2022

Принята к публикации 20.12.2022

Неорганические полифосфаты (полиР), согласно косвенным литературным данным, участвуют

в регуляторных процессах в молекулярном комплексе клеточной стенки (КС) дрожжей. Целью

работы было выявление взаимосвязи между полиР, кислой фосфатазой Pho3p и мажорным бел-

ком КС, глюканозилтрансгликозилазой Bgl2p - основным глюканремоделирующим ферментом

с амилоидными свойствами. Установлено, что клетки мутантного штамма с делецией гена PHO3

содержат больше высокополимерных щёлочерастворимых полиР, а также более устойчивы к щё-

лочи и ионам марганца по сравнению со штаммом дикого типа. Эти данные свидетельствуют в

пользу того, что Pho3p ответственна за гидролиз высокополимерных полиP на поверхности клеток

дрожжей, а эти полиР являются одним из факторов устойчивости к стрессам. Штамм с делеци-

ей гена BGL2 cхож со штаммом Δpho3 по содержанию высокомолекулярных щёлочерастворимых

полиР и устойчивости к щёлочи и марганцу. Сравнительный анализ белков КС демонстрировал

корреляцию между экстрагируемостью кислой фосфатазы и Bgl2р, а также выявил изменение спо-

соба закрепления Bgl2р в КС штамма, лишённого Pho3p. Предположено, что Bgl2p и Pho3p способ-

ны образовывать метаболон или его части, который объединяет биогенез основного структурного

полимера КС - глюкана и катаболизм важнейшего регуляторного полимера - полифосфатов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: дрожжи, клеточная стенка, полифосфаты, кислая фосфатаза, глюканозилтранс-

гликозилаза, Pho3p, Bgl2p, стресс.

DOI: 10.31857/S0320972523010098, EDN: PCQBXC

ВВЕДЕНИЕ

ции морфогенеза [5] и адгезии [6]. Структур-

ной основой КС является мегагликоконью-

Клеточная стенка (КС) дрожжей являет-

гат (мГК), покрывающий клетку дрожжей.

ся зоной непосредственного контакта клеток

Более чем наполовину мГК состоит из мало-

дрожжей с окружающей средой и играет важ-

разветвленных молекул высокополимерного

ную роль в адаптации этих микроорганизмов к

β-1,3-глюкана и разветвлённого β-1,6-глюка-

различным источникам углерода, в развитии и

на, на молекулах которых закреплены функ-

старении, в реакции на стресс [1-4], в регуля- ционально важные белки. За формирование

Принятые сокращения: КС - клеточная стенка; полиP - неорганические высокомолекулярные полифосфаты.

* Адресат для корреспонденции.

125

126

КАЛЕБИНА и др.

глюкановой сети и её постоянную перестройку

точной поверхности дрожжей практически не

в процессе роста и деления клеток ответствен-

изучены. На основании предварительных экс-

ны белки КС, в частности - те из них, кото-

периментов [30] и данных, полученных при из-

рые закреплены без формирования ковалент-

учении влияния делеции гена кислой фосфата-

ной связи с глюканом, среди которых можно

зы Pho3p на активность Bgl2p [11], нами было

выделить мажорный глюканремоделирую-

предположено, что оба фермента, входящих

щий фермент - глюканозилтрансгликозилазу

в состав пула белков, экстрагируемых из КС с

Bgl2p [7-9], и кислую фосфатазу Pho3p [10, 11].

помощью Tris [31], могут функционировать во

Основными молекулами, входящими в состав

взаимной корреляции, возможно, как метабо-

мГК и образующими КС дрожжей, являются

лон или его часть, оказывая взаимное влияние

полисахариды и белки, однако важным компо-

на закрепление и функциональную активность.

нентом КС являются также и высокомолеку-

В настоящее время такие данные в литературе

лярные полиР [12-16]. Существует корреляция

практически не представлены, в то же время

между накоплением фракции полиР4 и поли-

они имеют очень большое значение для по-

сахаридов КС у Saccharomyces cerevisiae [17-20].

нимания регуляции биогенеза КС дрожжей.

Функции полиР КС связаны со способ-

Важную роль в процессе их взаимодействия

ностью этих отрицательно заряженных поли-

могут играть регуляторные молекулы - поли-

меров взаимодействовать с полисахаридами

фосфаты. Данная работа посвящена проверке

и белками данного клеточного компартмен-

высказанного предположения и продолжению

та. ПолиР играют важную роль в структурной

исследований структурной и функциональ-

организации КС [21]. ПолиР отвечают за под-

ной взаимосвязи двух ключевых ферментов

держание отрицательного заряда на клеточной

КС дрожжей, обеспечивающих биогенез важ-

поверхности грибов [15, 16]. Предложена гипо-

нейших полимеров, входящих в состав этой

тетическая схема регуляции активности Bgl2p

органеллы: регуляторного - полифосфатов и

с участием полиР [11].

структурного - глюкана.

Суммируя, функции полиР в клеточной

Целью настоящего исследования явился

оболочке можно охарактеризовать как регуля-

анализ содержания полиР и адаптивных осо-

торные и защитные, поскольку эти полимеры

бенностей дрожжей с делецией генов PHO3 и

участвуют в регуляции активности ферментов,

BGL2, кодирующих кислую фосфатазу и глю-

а также в поддержании отрицательного заряда

канозилтрансгликозилазу КС S. cerevisiae.

на поверхности и нейтрализации токсичных

для клеток веществ путём образования с ними

комплексов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Кислые фосфатазы у S. cerevisiae участвуют

в системе гомеостаза фосфатов [22-25]. Два со-

Штаммы дрожжей и условия их выращи-

седних гена YBR092C и YBR093C кодируют кон-

вания. Дрожжи S. cerevisiae BY4742 Mat α his3Δ1

ститутивный фермент Pho3p и репрессируемый

leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 («Invitrogen», США), далее

фермент Pho5p соответственно (https://www.

«родительский штамм» или «WT», и его произ-

yeastgenome.org). Оба фермента локализованы

водные: «Δbgl2» Mat α his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0

в клеточной оболочке [22, 26, 27]. Pho5p син-

bgl2::URA3 и «Δpho3» Mat α his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0

тезируется при фосфатном голодании и обла-

ura3Δ0 pho3::LEU2, а также соответствующие

дает активностью нуклеозид-трифосфатазы и

контрольные штаммы со вставкой генов анало-

нуклеозид-трифосфатпирофосфатазы [22, 28].

гичных ауксотрофностей: «WT+URA3» Mat α

Очищенная Pho5p показала одинаковую ак-

his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0::URA3 и «WT+LEU2»

тивность с p-нитрофенилфосфатом, ATP, ADP,

Mat α his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0::LEU2 - были

глицерофосфатом и глюкозо-6-фосфатом, в то

получены как описано ниже в данной работе.

время как к гидролизу полиР она способна не

Указанные штаммы поддерживали на твёрдых

была [29]. Известно, что Pho3p гидролизует тиа-

средах YNB и YPD [32] и для получения экспе-

минфосфаты в периплазматическом простран-

риментальных результатов выращивали на жид-

стве, увеличивая поглощение тиамина [26, 27].

кой среде YPD при 28 °С и аэрации 200 об./мин

Данные об активности Pho3p с полиР отсутствуют.

до поздней логарифмической стадии.

Bgl2p, один из основных глюканремоде-

Конструкция штаммов. Штаммы S. cerevisiae

лирующих белков КС дрожжей со свойствами

Δbgl2, Δpho3, WT+URA3 и WT+LEU2 были

амилоида, устойчив к обработке детергентами

получены на основе штамма BY4742 в ре-

и протеиназами, после выделения из КС спо-

зультате гомологичной рекомбинации после

собен образовывать фибриллы [7, 8]. Условия

трансформации с помощью ацетата лития, одно-

формирования этим белком фибрилл на кле-

цепочечной ДНК и полиэтиленгликоля [33, 34].

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

НАКОПЛЕНИЕ ПОЛИФОСФАТОВ И УСТОЙЧИВОСТЬ ДРОЖЖЕЙ К СТРЕССУ

127

Последовательность нуклеотидов праймеров, использованных в данной работе

№

Последовательность нуклеотидов

5′-GTTTTTTTCAATATAAGTTTATTGAGATAGACAACTAACCA

AAAAGAAAAACGGTCAAAGAGCTTTTCAATTCATCTTTTTT-3′

5′-TATTCCTCACCTAAACAGAAGGAAAAAGCCATTCTTGTTTAA

AGAGTATTTTTAAAGCGTCGGGTAATAACTGATATAATTAAAT-3′

5′-TTTTCACTTCAAGTGACAATTTGAAATACTCCTTGGACT

GTGACTTTTCATGAGCTTTTCAATTCATCTTTTTTTTTT-3′

5′-TTTGCTGGATGGAAGTCAATTATGCCTTGATTATCATAAAAAAAATACTA

CAGTAAAGAAAGGGCCATTCCAAATTACCTAAATTCGATGACTGGAAATT-3′

5′-AAAGAAGATCAGAATCGATGGGTATTTATTTATATTTGC

AATATTATTTATTTATACAATTTAAGCAAGGATTTTCTTAA-3′

5′-ATACTACTCACTACAACGATACCCTATTAAAACAATA

AATTGTATAAATAAATAAAAATTCGATGACTGGAAATT-3′

Ауксотрофный маркер URA3 был амплифици-

ции кислоторастворимой фракции, добавляли

рован с использованием пар праймеров «1 и 2» и

2 г NaClO₄ и 0,5 мл 1 М HClO₄ (из расчёта на

«2 и 3» с плазмиды pJJ244 для получения штам-

1 г пробы) и инкубировали на холоде при пе-

мов Δbgl2 и WT+URA3 соответственно (таблица).

ремешивании в течение 15 мин, затем добав-

Ауксотрофный маркер LEU2 был амплифициро-

ляли 10 мл холодной дистиллированной воды и

ван с использованием пар праймеров «4 и 5» и

снова выдерживали на холоде в течение 15 мин

«5 и 6» с плазмиды pJJ282 для получения штам-

при перемешивании. Полученную суспензию

мов Δpho3 и WT+LEU2 соответственно (табли-

центрифугировали в течение 20 мин при 5000 g.

ца). Трансформанты были отобраны на твёрдых

Экстракцию повторяли дважды и полученные

селективных средах YNB без урацила для штам-

супернатанты объединяли.

мов Δbgl2 и WT+URA3 и без лейцина для штам-

Затем получали фракцию полиР3 (раство-

мов Δpho3 и WT+LEU2 соответственно [32].

римую в слабой щёлочи) экстракцией раство-

Экстракция полифосфатов. Клетки дрож-

ром NaOH, имеющим pH 9-10, при 0 °C дваж-

жей, выращенные как описано выше, собира-

ды по 15 мин при перемешивании. Полученную

ли центрифугированием при 5000 g в течение

суспензию центрифугировали в течение 20 мин

15 мин, дважды промывали дистиллированной

при 5000 g. Экстракцию повторяли дважды и

водой и замораживали при -20 °C. Из получен-

полученные супернатанты объединяли.

ной биомассы последовательной обработкой

Щёлочерастворимую фракцию (полиР4)

растворами кислот, солей и щелочей выделя-

экстрагировали 0,05 M NaOH при 0 °C 2 раза по

ли 4 фракции полифосфатов согласно ранее

15 мин, центрифугировали в течение 20 мин при

описанному методу [35]: кислоторастворимую

5000 g и полученные супернатанты объединяли.

(полиP1), солерастворимую (полиP2), две щё-

Количество полиР в полученных экстрак-

лочерастворимые (полиP3 и полиP4). Кисло-

тах определяли по содержанию образовавше-

торастворимую фракцию (полиР1) получали

гося при гидролизе ортофосфата (P_i), как опи-

обработкой пробы хлорной кислотой в течение

сано ранее [29].

15 мин при 0 °С и постоянном перемешивании

Получаемые фракции различаются по

(на 1 г пробы добавляли 1 мл 1 М HClO₄ и 9 мл

среднему количеству фосфатных остатков:

0,5 М HClO₄). После экстракции суспензию

полиР1 - 15, полиР2 - 25, полиР3 - 60-70,

центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин.

полиР4 - свыше 100 фосфатных остатков [36].

Экстракцию повторяли дважды и полученные

Анализ чувствительности дрожжей к стрессо-

супернатанты объединяли. Для удаления нукле-

вым факторам. Влияние Cd(CH₃COO)₂ × 2Н₂О

отидов, которые содержатся в данной фракции,

и KOH на рост дрожжей определяли путём по-

к супернатанту добавляли 0,1 г активированно-

сева образцов клеток (стандартизированных по

го угля Норит («Sigma-Aldrich») на 1 мл экстрак-

плотности культуры) в стерильный 96-луноч-

та и инкубировали на холоде в течение 30 мин.

ный иммунопланшет с крышкой, ячейки кото-

Для выделения солерастворимой фракции

рого содержали среду YPD и аликвоты стериль-

(полиР2) к осадку, полученному после экстрак-

ных растворов Cd(CH₃COO)₂ × 2Н₂О или KOH.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

128

КАЛЕБИНА и др.

Через 24 ч культивирования плотность куль-

2 ед. акт.), инкубировали при 37 °С в течение 1 ч.

тур измеряли на планшетном фотометре (МЗ

Полученные гидролизаты РНК прогревали в

«Сапфир», Россия) при длине волны 595 нм.

течение 2 мин при 90 °С с последующим отде-

Влияние марганца на рост определяли после

лением супернатанта для хроматографического

96 ч культивирования штаммов в жидкой среде

анализа путём центрифугирования при 12 000 g.

YPD с добавлением 1,75 мМ MnSO₄ путём под-

ВЭЖХ с электрохимической детекцией. Полу-

счёта клеток в камере Горяева.

ченные образцы анализировали с помощью об-

Выделение и частичная депротеинизация КС.

ращённо-фазовой ВЭЖХ (колонка Phenomenex

Клетки дрожжей, выращенные до поздней ло-

Luna C18(2), 250*4,6 мм) с использованием спек-

гарифмической фазы, разрушали и получен-

трофотометрической (260 нм) и амперометри-

ные КС депротеинизировали с использова-

ческой (0,4 В) детекции. Раствор А: 0,1 М ацетат

нием 1% SDS (m/V), как описано ранее [31].

аммония. Раствор Б: ацетонитрил. Изократиче-

Оптическую плотность КС в суспензии опреде-

ское элюирование. 4%-ный раствор ацетонитри-

ляли с помощью спектрофотометра Cary Eclipse

ла (v/v) в 0,1 М ацетате аммония. Скорость пото-

(«Varian Inc.», США) при длине волны 540 нм.

ка 1 мл/мин.

Получение белковых экстрактов из КС. Экс-

Статистическая обработка данных. Ста-

тракты из КС в 0,1 М Tris («Amresco», США),

тистическую значимость оценивали относи-

рН 9,8, и в 6 М гуанидингидрохлориде («Appli-

тельно данных для родительского штамма WT

Chem», Германия), рН 5,6, получали, как описа-

с помощью t-критерия Стьюдента, используя

но ранее [31] с модификациями.

стандартную программу Excel.

Электрофорез белков и вестерн-блот анализ.

Экстракты из КС анализировали с помощью

электрофореза в денатурирующих условиях в

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ПААГ [37]. Белки из геля переносили на ни-

троцеллюлозную мембрану Amersham Protran

К началу нашей работы в литературе отсут-

(0,45 мкм, «Sigma-Aldrich», США). Bgl2p вы-

ствовали убедительные данные, свидетельству-

являли с использованием антител [31] с помо-

ющие в пользу того, что, с одной стороны, кис-

щью системы ECL («Thermo Fisher Scientific»,

лая фосфатаза Pho3p способна гидролизовать

США) [38].

высокополимерные полифосфаты, а с другой

Подготовка проб для LC-MS/MS-анализа.

стороны, что эти полимеры локализованы на

К экстрактам из КС добавляли 0,1 М Tris-НСl,

поверхности клетки дрожжей, т.е. именно там,

рН 8,5, с 1%-ным дезоксихолатом (m/V) и 10 мМ

где, по многочисленным данным, локализован

дитиотреитолом до конечной концентрации.

этот фермент. Для верификации этих положе-

Затем кипятили в течение 10 мин и остужали

ний нами был получен штамм с делетирован-

при комнатной температуре. Экстракты хра-

ным геном PHO3 и проведён сравнительный

нили при 4 °С. Дальнейшая подготовка проб,

анализ содержания различных фракций поли-

жидкостная хроматография и масс-спектроме-

фосфатов в данном и в родительском штаммах

трический анализ были проведены, как описа-

дрожжей (рис. 1), который показал, что со-

но ранее [39].

держание фосфата (Рi) и трёх фракций полиР,

Метод определения 8-оксо-гуанозина. Клет-

различающихся длиной цепи (полиР1-3), в

ки дрожжей, выращенные до поздней логариф-

клетках обоих штаммов практически не изме-

мической фазы, собирали центрифугированием

нилось, в то время как содержание высокополи-

в течение 5 мин при 1650 g, дважды промыва-

мерных щёлочерастворимых полиР4 увеличи-

ли буфером ТЕ (10 мM Tris-HCl, 1 мM ЭДТА,

лось у штамма, лишённого кислой фосфатазы,

pH 8,0), после чего проводили выделение ну-

почти в два раза. Исследователи давно указы-

клеиновых кислот, как описано ранее [40], с

вали на то, что полиР4 с высокой степенью ве-

некоторыми модификациями. Полученные осадки

роятности могут быть отнесены к полимерам,

нуклеиновых кислот перерастворяли в 200 мкл

локализованным в КС [41]. Возрастание содер-

дистиллированной воды, добавляли 20 мкл

жания этой фракции полифосфатов в штамме

10-кратного 300 мМ натрий-ацетатного буфе-

с отсутствием фермента, осуществляющего их

ра, рН 4,6, с 2,8 М NaCl и 10 мМ ZnSO₄ и ин-

гидролиз, убедительно свидетельствует в поль-

кубировали с нуклеазой S1 («Sigma-Aldrich»,

зу правильности предположения И.С. Кулаева

2 ед.акт.) в течение 2 ч при 37 °С для гидроли-

о локализации полиР4 в КС.

за РНК. К инкубационной смеси добавляли

Отметим, что фракция полиР4 характери-

50 мкл 5-кратного буфера: 200 мМ Tris-HCl,

зуется несколькими особенностями по сравне-

200 мМ NaCl, 40 мМ MgCL₂, pH 9,5, и ще-

нию с другими фракциями полиР: это высоко-

лочную фосфатазу («Thermo Fisher Scientific»,

молекулярные полиР со средней длиной цепи

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

НАКОПЛЕНИЕ ПОЛИФОСФАТОВ И УСТОЙЧИВОСТЬ ДРОЖЖЕЙ К СТРЕССУ

129

Рис. 1. Содержание различных фракций неорганических полифосфатов в клетках дрожжей S. cerevisiae родительского

штамма WT и штаммов Δbgl2 и Δpho3. а - Содержание Рi, полифосфатов фракций полиР1, полиР2 и полиР3 (см. ма-

териалы и методы). б - Содержание фракции полиР4, согласно литературным данным, ассоциированной с КС. Пред-

ставлены средние значения из трёх опытов. Статистическую значимость оценивали относительно данных для ро-

дительского штамма WT с помощью t-критерия Стьюдента, используя стандартную программу Excel: * p < 0,01,

** p < 0,001, # разница статистически незначима

около 100 фосфатных остатков, эти полиР не

взаимодействии и взаимовлиянии этих фер-

проявляют, в отличие от других фракций, эф-

ментов друг на друга, иными словами, позво-

фекта гиперкомпенсации, т.е. многократного

ляет предположить, что они образуют метабо-

возрастания после фосфорного голодания, эта

лон или его часть. Данные экспериментов по

фракция также в наименьшей степени тратится

определению содержания этих ферментов в КС

при фосфорном голодании по сравнению с дру-

дрожжей отчасти подтверждают сказанное.

гими фракциями [36]. Гипотеза о том, что по-

Как уже указывалось ранее, Bgl2р и Pho3p

лиР4 локализованы в КС, связана с тем, что есть

являются белками КС дрожжей. В наших экс-

корреляция между накоплением фракции по-

периментах оба белка были достоверно опре-

лиР4 и полисахаридов КС у S. cerevisiae [17-20],

делены в изолированных КС родительского

а также между уровнем этой фракции и отри-

штамма дрожжей методом LC-MS/MS-анали-

цательным зарядом на клеточной поверхности

за во фракции белков, не закреплённых кова-

дрожжей [15, 16]. К сожалению, современные

лентно на полисахаридах КС, экстрагируемых

методы получения чистых препаратов КС дрож-

0,1 М Tris в щелочных условиях. В штамме с

жей приводят к разрушению и вымыванию из

делецией гена, кодирующего Bgl2p, этот белок

препаратов содержащихся в стенке полифосфа-

отсутствует, равно как и Pho3p отсутствует в

тов. Поэтому пока не удалось напрямую опре-

штамме с делетированным геном PHO3.

делить содержание и длину цепи полиР в пре-

Следует отметить, что число пептидов,

паратах КС. Наличие полиР в стенках хорошо

определяемых в экстрагируемых белках LC-MS/

фиксируется у многих видов дрожжей посред-

MS-анализом, в различных экспериментах не-

ством специальной окраски DAPI, который, в

сколько отличается, даже если при экстрак-

отличие от ДНК, даёт с полиР оранжевую или

ции использованы одинаковые количества КС.

зелёную окраску [21, 42, 43].

При этом анализ числа пептидов экстрагируемых

Итак, как и ожидалось, отсутствие Pho3p при-

ферментов Bgl2р и Pho3p из КС родительского

вело к увеличению содержания фракции полиР4,

штамма, проведённый в серии экспериментов,

что свидетельствует в пользу участия этого фер-

свидетельствует о наличии пропорциональной

мента в контроле содержания полиР в КС.

зависимости экстрагируемости кислой фосфата-

Интересно отметить, что увеличение коли-

зы от количества экстрагируемого Bgl2р (рис. 2).

чества полифосфатов полиР4 наблюдается не

Другие белки, например, глюканремоделирую-

только в случае штамма с делецией гена кис-

щие ферменты КС, не демонстрируют такой за-

лой фосфатазы, но и у штамма с делецией гена

кономерности (данные не приведены).

глюканозилтрансгликозилазы Bgl2 (рис. 1) при

Следует отметить, что нами обнаружена и

сохранении уровня анализируемых соедине-

обратная ситуация: мы наблюдали влияние от-

ний в контрольных штаммах WT, WT+URA3 и

сутствия кислой фосфатазы и, как следствие,

WT+LEU2, что свидетельствует о возможном

увеличения количества полифосфатов в КС этих

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

130

КАЛЕБИНА и др.

согласуется с выявленными нами ранее амило-

идными свойствами белка Bgl2p.

Поскольку полиР являются важным фак-

тором устойчивости клеток дрожжей к раз-

личным видам стресса, в первую очередь к

щелочному стрессу и стрессу, вызванному

токсической концентрацией тяжёлых метал-

лов [42, 44], мы сравнили устойчивость клеток

всех трёх штаммов к кадмию, щёлочи и мар-

ганцу. Оказалось, что оба мутанта более устой-

чивы к щёлочи и марганцу, чем родительский

штамм, хотя разницы в устойчивости к кад-

мию не отмечено (рис. 4). Итак, штамм Δbgl2

похож на штамм Δpho3 не только по уровню

полиР4, но и по увеличению устойчивости к

стрессовым воздействиям, для которой полиР

КС являются важным фактором.

Полученные данные позволяют сделать вы-

Рис. 2. Корреляционная зависимость числа определяемых

вод о том, что делеции генов, кодирующих белки

в 5 независимых экспериментах пептидов Bgl2p и Pho3p

Bgl2p и Pho3p, снижают чувствительность дрож-

в экстракте в 0,1 М Tris из КС дрожжей S. cerevisiae ро-

дительского штамма с помощью LC-MS/MS-анализа.

жей к некоторым стрессовым воздействиям.

Линия на графике отражает корреляцию, коэффициент

По-видимому, увеличенное количество полиР

корреляции - 0,94, p < 0,01

в случаях воздействия ионов тяжёлых металлов

позволяет клеткам сорбировать некоторое ко-

личество этих ионов на клеточной поверхности,

а в случае воздействия щёлочи полиР-стенки

могут экранировать клетки от отрицательно за-

ряженных гидроксил-ионов. Поскольку полиР в

КС участвуют в нескольких клеточных функци-

ях, возникает вопрос о регуляции уровня полиР

в этом компартменте. Мембрана эндоплазма-

тического ретикулюма формирует транспорт-

ные везикулы, несущие в КС белки и предше-

ственники полисахаридов, в этой мембране

присутствует VTC-комплекс, синтезирующий

полиР [45]. Это позволяет предполагать, что та-

кие транспортные везикулы могут доставлять в

Рис. 3. Вестерн-блот анализ экстрактов из КС дрожжей

КС также полиР.

S. cerevisiae: в буфер Лэммли - родительский штамм (до-

Следует отметить, что, несмотря на схо-

рожка 1), Δpho3 (дорожка 2); в 6 М гуанидингидрохлорид,

2 ч экстракции - Δpho3 (дорожка 3), родительского штам-

жесть ответа дрожжей на изучаемые делеции

ма (дорожка 4) и 4 ч экстракции - Δpho3 (дорожка 5), ро-

генов BGL2 и РHO3 (увеличение в их КС ко-

дительский штамм (дорожка 6). Стрелками указаны оли-

личества полифосфатов), мы предполагали,

гомеры Bgl2p. Окрашивание антителами к Bgl2p

что указанное сходство тем не менее является

следствием различных процессов, идущих в

метаболических путях штаммов с изучаемыми

дрожжей на закрепление Bgl2p. Из рис. 3 видно,

делециями, в том числе - наличия или отсут-

что фракция гуанидингидрохлорид-экстрагируе-

ствия окислительного стресса, вызванного у

мого из КС пула мономера Bgl2p практически

дрожжей повышением содержания полифос-

полностью отсутствует в КС Δpho3 при исполь-

фатов в КС.

зовании условий экстракции, применяемых

Свидетельством верности нашего предпо-

нами в экспериментах, позволивших выявить

ложения могло бы явиться различное содержа-

данный пул ранее [31], но появляются димерные

ние 8-оксогуанозина - продукта окислитель-

и, возможно, тетрамерные формы молекул это-

ного повреждения гуанинового основания в

го белка, экстракция которых наблюдается при

препаратах РНК, полученных из родительско-

увеличении длительности обработки КС таким

го штамма и мутантных штаммов с делециями.

же экстрагентом - нейтральным 6 М гуанидин-

Исследователи сравнительно давно и устойчи-

гидрохлоридом. Обнаруженный факт хорошо

во используют данное соединение как маркер,

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

НАКОПЛЕНИЕ ПОЛИФОСФАТОВ И УСТОЙЧИВОСТЬ ДРОЖЖЕЙ К СТРЕССУ

131

Рис. 4. Сравнение чувствительности штаммов дрожжей S. cerevisiae родительского штамма WT и штаммов Δbgl2 и Δpho3

к стрессовым условиям: в присутствии различных концентраций Cd²⁺ (а), КОН (б) и Mn²⁺ в концентрации 1,75 мМ (в).

Представлены средние значения из 4 опытов. Статистическую значимость оценивали относительно данных для роди-

тельского штамма WT с помощью t-критерия Стьюдента, используя стандартную программу Excel: * p < 0,01, ** p < 0,001,

# - разница статистически незначима

определяющий уровень развития окислитель-

ма и штамма Δbgl2 и составляет 238,5 ± 70,26,

ного стресса у различных организмов, в том

178,11 ± 70,4 и 194,69 ± 46,54 соответственно.

числе у высших эукариот и человека [46-48].

8-оксогуанин образуется при воздействии

Работы такого направления на клетках дрож-

активных форм кислорода (гидроксил-радика-

жей практически неизвестны, однако есть ос-

ла [53], супероксид-анион радикала [54] и т.п.)

нования предполагать, что и у низших эукари-

и органических перекисей (окисленных липи-

от указанная закономерность присутствует.

дов) [55] на гуанин в составе РНК. Активные

Появление 8-оксогуанина в составе РНК

формы кислорода появляются в клетке в каче-

может привести к дефектам синтеза белка,

стве побочных продуктов электрон-транспорт-

например, снижению скорости синтеза белка

ных цепей митохондрий и работы пероксидаз,

и продукции агрегированных или укорочен-

в результате реакций перекиси водорода с кати-

ных пептидов [49, 50], что у высших эукариот

онами тяжёлых металлов [56], а также под дей-

имеет важные последствия при старении, ней-

ствием некоторых факторов внешней среды,

родегенеративных заболеваниях [51] и атеро-

таких как ионизирующее излучение. В свою

склерозе [52].

очередь, работа специфических ферментов ан-

Учитывая сказанное, нам представлялось

тиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы,

необходимым определить содержание 8-оксо-

каталазы и т.п.), а также низкомолекулярных

гуанина в составе РНК изучаемых штаммов,

антиоксидантов снижает содержание активных

чтобы выявить реакцию дрожжей на повы-

форм кислорода в клетке [57].

шенное содержание полифосфатов в их КС.

Наши результаты можно расценивать как

Согласно нашим результатам, уровень 8-оксо-

свидетельство об отсутствии окислительно-

гуанозина по отношению к неокисленному гу-

го стресса у дрожжей, у которых содержание

анозину (нмоль/ммоль*10⁶) в РНК в штамме

полифосфатов в КС значительно превышает

Δpho3 не отличается от родительского штам-

норму, или же о высокоэффективной работе

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

132

КАЛЕБИНА и др.

указанных выше ферментных систем и/или ан-

получены данные, свидетельствующие о воз-

тиоксидантов. В дальнейшем мы продолжим ис-

можном наличии таких белковых посадочных

следование роли 8-оксогуанозина в ответе клеток

площадок в КС дрожжей [60]. Также в лите-

дрожжей на стресс различного происхождения.

ратуре есть данные о закреплении в КС с уча-

стием Bgl2p фермента трегалазы [61]. В свою

очередь, в отсутствии кислой фосфатазы на-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

блюдается изменение способа закрепления

Bgl2p в КС. Полученные результаты в совокуп-

Наши данные продемонстрировали влия-

ности позволяют с высокой степенью вероят-

ние изучаемых делеций на уровень высокомо-

ности предполагать, что в КС дрожжей Bgl2p и

лекулярных щёлочерастворимых полифосфа-

Pho3p способны образовывать метаболон или

тов (полиР4) в клетках дрожжей. Мы полагаем,

его часть, который объединяет биогенез основ-

что наблюдаемое нами увеличение содержания

ного структурного полимера КС - глюкана и

полиР4 у штамма с делецией PHO3 служит важ-

важнейшего регуляторного полимера - поли-

ным свидетельством в пользу гипотезы о лока-

фосфатов, поскольку незначительное количе-

лизации этих полиР именно в клеточной обо-

ство фермента кислой фосфатазы посредством

лочке, которая является зоной локализации

накопления в КС её субстрата (полифосфатов)

белков Pho3p и Bgl2p. В свою очередь, уровень

влияет на активность Bgl2p и, таким образом,

полифосфатов может влиять на устойчивость

на свойства КС.

дрожжей к различного рода воздействиям на их

Наличие такой взаимосвязи было предполо-

клетки соединений, вызывающих стресс.

жено И.С. Кулаевым с соавт. [17-20], в нашей ра-

Ранее было показано, что делеция гена кис-

боте данное предположение получило развитие.

лой фосфатазы приводит к изменению проч-

ности КС [58]. Авторы данного исследования

Вклад авторов. Т.С. Калебина и Т.В. Кула-

предположили, что Pho3p является структур-

ковская - концепция и руководство работой;

ным белком. Однако небольшое содержание

Е.В. Кулаковская, В.В. Рекстина, Л.В. Трилисен-

Pho3p в КС, показанное в настоящем исследо-

ко, Р.Х. Зиганшин, Н.В. Мармий - проведение

вании, позволяет говорить, скорее, о регулятор-

экспериментов; Т.С. Калебина, Е.В. Кулаков-

ной, нежели структурной роли кислой фосфа-

ская, В.В. Рекстина, Д.С. Есипов, Р.Х. Зиган-

тазы. В настоящем исследовании показано, что

шин, Л.В. Трилисенко, Н.В. Мармий, Т.В. Кула-

кислая фосфатаза Pho3p с очевидностью может

ковская - обсуждение результатов исследования;

влиять на содержание полифосфатов, гидроли-

Т.С. Калебина - написание текста; Т.С. Калеби-

зуя их молекулы с большей или меньшей ин-

на, В.В. Рекстина, Д.С. Есипов, Т.В. Кулаков-

тенсивностью. Кроме того, ранее было проде-

ская - редактирование текста статьи.

монстрировано, что полифосфаты значительно

Финансирование. Работа поддержана гран-

увеличивают ферментативную активность Bgl2p

том РФФИ 20-04-01144 А. Исследование вы-

in vitro [11, 59].

полнено в рамках научного проекта государ-

Глюканозилтрансгликозилаза Bgl2р, явля-

ственного задания МГУ № 121032300088-6.

ясь мажорным белком КС и обладая амилоид-

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

ными свойствами [7, 8], может служить «поса-

отсутствии конфликта интересов.

дочной площадкой» для кислой фосфатазы и,

Соблюдение этических норм. В данной ра-

таким образом, участвовать в её закреплении

боте не было исследований с использованием

и функционировании в КС. Ранее нами были

в качестве объектов людей или животных.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Sanz, A. B., García, R., Rodríguez-Peña, J. M., and

Biochem. Biophys. Res. Commun., 500, 603-608, doi:

Arroyo, J. (2017) The CWI Pathway: regulation of the

10.1016/j.bbrc.2018.04.113.

transcriptional adaptive response to cell wall stress in

3. Liu, L., and Levin, D. E. (2018) Intracellular mech-

yeast, J. Fungi (Basel), 4, 1, doi: 10.3390/jof4010001.

anism by which genotoxic stress activates yeast SAPK

2. Huang, C., Zhao, F., Lin, Y., Zheng, S., Liang, S.,

Mpk1, Mol. Biol. Cell, 29, 2898-2909, doi: 10.1091/

and Han, S. (2018) RNA-Seq analysis of global tran-

mbc.E18-07-0441.

scriptomic changes suggests a roles for the MAPK

4. Molon, M., Woznicka, O., and Zebrowski, J. (2018)

pathway and carbon metabolism in cell wall mainte-

Cell wall biosynthesis impairment affects the budding

nance in a Saccharomyces cerevisiae FKS1 mutant,

lifespan of the Saccharomyces cerevisiae yeast,

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

НАКОПЛЕНИЕ ПОЛИФОСФАТОВ И УСТОЙЧИВОСТЬ ДРОЖЖЕЙ К СТРЕССУ

133

Biogerontology, 19, 67-79, doi: 10.1007/s10522-017-

phosphates of cell envelope on the sensitivity of yeast

9740-6.

Saccharomyces carlsbergensis to the cytyl-3-methyl-

Davì, V., Chevalier, L., Guo, H., Tanimoto, H.,

ammonium bromide, Microbiologiia, 65, 611-616.

Barrett, K., Couturier, E., Boudaoud, A., and Minc,

17.

Кулаев И. С., Вагабов В. М., Циоменко А. Б. (1972)

N. (2019) Systematic mapping of cell wall mechanics

О корреляции накопления полисахаридов клеточ-

in the regulation of cell morphogenesis, Proc. Natl.

ной стенки и некоторых фракций высокомолеку-

Acad. Sci. USA, 116, 13833-13838, doi: 10.1073/

лярных полифосфатов у дрожжей, Докл. АН СССР,

pnas.1820455116.

204, 734-736.

Willaert, R. G. (2018) Adhesins of yeasts: protein

18.

Циоменко А. Б., Аугустин И., Вагабов В. М., Ку-

structure and interactions, J. Fungi (Basel), 4, 119, doi:

лаев И. С. (1974) О взаимосвязи обмена неоргани-

10.3390/jof4040119.

ческих полифосфатов и маннана у дрожжей, Докл.

Kalebina, T. S., Plotnikova, T. A., Gorkovskii, A. A.,

АН СССР, 215, 478-480.

Selyakh, I. O., Galzitskaya, O. V., Bezsonov, E. E.,

19.

Шабалин Ю. А., Вагабов В. М., Кулаев И. С.

Gellissen, G., and Kulaev, I. S. (2008) Amyloid-

(1979) О механизме сопряжения биосинтеза высо-

like properties of Saccharomyces cerevisiae cell wall

комолекулярных полифосфатов и маннана у дрож-

glucantransferase Bgl2p: prediction and experimental

жей Saccharomyces carlsbergensis, Докл. АН СССР,

evidences, Prion, 2, 91-96, doi: 10.4161/pri.2.2.6645.

249, 243-246.

Bezsonov, E. E., Groenning, M., Galzitskaya, O. V.,

20.

Шабалин Ю. А., Вагабов В. М., Кулаев И. С. (1985)

Gorkovskii, A. A., Semisotnov, G. V., Selyakh, I. O.,

Долихилдифосфатманноза: интермедиат биосин-

Ziganshin, R. H., Rekstina, V. V., Kudryashova, I. B.,

теза гликопротеинов у дрожжей? Докл. АН СССР,

Kuznetsov, S. A., Kulaev, I. S., and Kalebina, T. S.

283, 720-723.

(2013) Amyloidogenic peptides of yeast cell wall glu-

21.

Zvonarev, A. N., Crowley, D. E., Ryazanova, L. P.,

cantransferase Bgl2p as a model for the investigation of

Lichko, L. P., Rusakova, T. G., Kulakovskaya, T. V.,

its pH-dependent fibril formation, Prion, 7, 175-184,

and Dmitriev, V. V. (2017) Cell wall canals formed

doi: 10.4161/pri.22992.

upon growth of Candida maltosa in the presence of

Mouyna, I., Hartl, L., and Latgé, J. P. (2013) β-1,3-

hexadecane are associated with polyphosphates, FEMS

glucan modifying enzymes in Aspergillus fumigatus,

Yeast Res., 17, fox026, doi: 10.1093/femsyr/fox026.

Front. Microbiol., 4, 81, doi: 10.3389/fmicb.2013.00081.

22.

Oshima, Y. (1997) The phosphatase system in Saccha-

10.

Блинникова Е. И., Мирющенко Ф. Л., Шаба-

romyces cerevisiae, Gen. Genet. Syst., 72, 323-334, doi:

лин Ю. А., Егоров С. Н. (2002) Везикулярный

10.1266/ggs.72.323.

транспорт внеклеточных кислых фосфатаз у дрож-

23.

Secco, D., Wang, C., Shou, H., and Whelan, J. (2012)

жей Saccharomyces cerevisiae, Биохимия, 67, 580-586.

Phosphate homeostasis in the yeast Saccharomyces

11.

Калебина Т. С., Егоров С. Н., Арбатский Н. П.,

cerevisiae, the key role of the SPX domain-containing

Безсонов Е. Е., Горковский А. А., Кулаев И. С.

proteins, FEBS Lett., 586, 289-295, doi: 10.1016/

(2008) О роли высокомолекулярных полифосфа-

j.febslet.2012.01.036.

тов в активации глюкантрансферазы Bgl2p из кле-

24.

Yadav, K. K., Singh, N., and Rajasekharan, R. (2016)

точной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae,

Responses to phosphate deprivation in yeast cells, Curr.

Докл. Акад Наук, 420, 695-699.

Genet., 62, 301-307, doi: 10.1007/s00294-015-0544-4.

12.

Weimberg, R., and Orton, W. L. (1964) Evidence

25.

Eskes, E., Deprez, M. A., Wilms, T., and Winderickx, J.

for an exocellular site for the acid phosphatase of

(2018) pH homeostasis in yeast; the phosphate

Saccharomyces mellis, J. Bacteriol., 88, 1743-1152, doi:

perspective, Curr. Genet., 64, 155-161, doi: 10.1007/

10.1128/jb.88.6.1743-1754.1964.

s00294-017-0743-2.

13.

Кулаев И. С., Крашенинников И. А., Кокурина И. А.

26.

Nosaka, K., Kaneko, Y., Nishimura, H., and Iwashi-

(1966) О локализации неорганических полифос-

ma, A. (1989) A possible role for acid phosphatase

фатов и нуклеотидов у Neurospora crassa, Биохимия,

with thiamin-binding activity encoded by PHO3 in

31, 850-858.

yeast, FEMS Microbiol. Lett., 51, 55-59, doi: 10.1016/

14.

Tijssen, J. P. F., Beekes, H. W., and Van Steveninck, J.

0378-1097(89)90077-3.

(1982) Localization of polyphosphate in Saccharomyces

27.

Nosaka, K. (1990) High affinity of acid phosphatase

fragilis, as revealed by 4′6-diamidino-2-phenylindole

encoded by PHO3 gene in Saccharomyces cerevisiae

fluorescence, Biochem. Biophys. Acta, 721, 394-398.

for thiamin phosphates, Biochim. Biophys. Acta., 1037,

doi: 10.1016/0167-4889(82)90094-5.

147-54, doi: 10.1016/0167-4838(90)90160-h.

15.

Вагабов В. М., Чемоданова О. В., Кулаев И. С.

28.

Kennedy, E. J., Pillus, L., and Ghosh, G. (2005)

(1990) Влияние неорганических полифосфатов на

Pho5p and newly identified nucleotide pyrophos-

величину отрицательного заряда клеточной обо-

phatases/phosphodiesterases regulate extracellular

лочки дрожжей, Докл. АН СССР, 313, 989-992.

nucleotide phosphate metabolism in Saccharomyces

16.

Ivanov, A. J., Vagabov, V. M., Fomchenkov, V. M.,

cerevisiae, Eukaryot. Cell, 4, 1892-1901, doi: 10.1128/

and Kulaev, I. S. (1996) Study of the influence of poly-

EC.4.11.1892-1901.2005.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

134

КАЛЕБИНА и др.

29.

Andreeva, N., Ledova, L., Ryasanova, L., Kulakovska-

centration triggers changes in inorganic polyphos-

ya, T., and Eldarov, M. (2019) The acid phosphatase

phates, FEMS Yeast Res., 13, 463-470, doi: 10.1111/

Pho5 of Saccharomyces cerevisiae is not involved in

1567-1364.12049.

polyphosphate breakdown, Folia Microbiol. (Praha),

43.

Andreeva, N., Ryazanova, L., Dmitriev, V., Kula-

64, 867-873, doi: 10.1007/s12223-019-00702-6.

kovskaya, T., and Kulaev, I. (2014) Cytoplasmic in-

30.

Рекстина В. В., Безсонов Е. Е. (2012) Влияние неор-

organic polyphosphate participates in the heavy metal

ганических полифосфатов на конформацию пепти-

tolerance of Cryptococcus humicola, Folia Microbiol.

да АК187-196 глюкантрасферазы Bgl2p - амилоида

(Praha), 59, 381-389, doi: 10.1007/s12223-014-0310-x.

клеточной стенки Saccharomyces cerevisiae. «Ломо-

44.

Trilisenko, L. V., Kulakovskaya, E. V., and Kula-

носов-2012»: МАКС Пресс, Москва, с. 191.

kovskaya, T. V. (2017) The cadmium tolerance in Sac-

31.

Rekstina, V. V., Sabirzyanova, T. A., Sabirzyanov, F. A.,

charomyces cerevisiae depends on inorganic polyphos-

Adzhubei, A. A., Tkachev, Y. V., Kudryashova, I. B.,

phate, J. Basic Microbiol., 57, 982-986, doi: 10.1002/

Snalina, N. E., Bykova, A. A., Alessenko, A. V.,

jobm.201700257.

Ziganshin, R. H., Kuznetsov, S. A., and Kalebina, T. S.

45.

Gerasimaitė, R., and Mayer, A. (2016) Enzymes of

(2020) The post-translational modifications, local-

yeast polyphosphate metabolism: structure, enzymol-

ization, and mode of attachment of non-covalently

ogy and biological roles, Biochem. Soc. Trans., 44,

bound glucanosyltransglycosylases of yeast cell wall as

234-239, doi: 10.1042/BST20150213.

a key to understanding their functioning, Int. J. Mol.

46.

Mundt, J. M., Hah, S. S., Sumbad, R. A., Schramm,

Sci., 21, 8304, doi: 10.3390/ijms21218304.

V., and Henderson, P. T. (2008) Incorporation of ex-

32.

Sherman, F. (2002) Getting started with yeast, Methods

tracellular 8-oxodG into DNA and RNA requires pu-

Enzymol., 350, 3-41, doi: 10.1016/s0076-687950954-x.

rine nucleoside phosphorylase in MCF-7 cells, Nucleic

33.

Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., and

Acids Res., 36, 228-236, doi: 10.1093/nar/gkm1032.

Woods, R. A. (1995) Studies on the transformation of

47.

Doi, K., and Uetsuka, K. (2011) Mechanisms of

intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG proce-

mycotoxin-induced neurotoxicity through oxidative

dure, Yeast, 11, 355-360, doi: 10.1002/yea.320110408.

stress-associated pathways, Int. J. Mol. Sci., 12, 5213-

34.

Gietz, R. D., and Schiestl, R. H. (2007) High-

5237, doi: 10.3390/ijms12085213.

efficiency yeast transformation using the LiAc/SS

48.

Hajam, Y. A., Rani, R., Ganie, S. Y., Sheikh, T. A.,

carrier DNA/PEG method, Nat. Protoc., 2, 31-34,

Javaid, D., Qadri, S. S., Pramodh, S., Alsulimani, A.,

doi: 10.1038/nprot.2007.13.

Alkhanani, M. F., Harakeh, S., Hussain, A., Haque, S.,

35.

Вагабов В. М., Трилисенко Л. В., Кулаев И. С.

and Reshi, M. S. (2022) Oxidative stress in human

(2000) Зависимость длины цепи неорганических

pathology and aging: molecular mechanisms and per-

полифосфатов от содержания ортофосфата в сре-

spectives, Cells, 11, 552, doi: 10.3390/cells11030552.

де у дрожжей, Биохимия, 65, 414-420.

49.

Shan, X., Chang, Y., and Lin, C. G. (2007) Messenger

36.

Vagabov, V. M., Trilisenko, L. V., Kulakovskaya, T. V.,

RNA oxidation is an early event preceding cell death

and Kulaev, I. S. (2008) Effect of a carbon source

and causes reduced protein expression, FASEB J., 21,

on polyphosphate accumulation in Saccharomyces

2753-2764, doi: 10.1096/fj.07-8200com.

cerevisiae, FEMS Yeast Res., 8, 877-882, doi: 10.1111/

50.

Tanaka, M., Chock, P. B., and Stadtman, E. R. (2007)

j.1567-1364.2008.00420.x.

Oxidized messenger RNA induces translation errors,

37.

Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 66-71, doi: 10.1073/

during the assembly of the head of bacteriophage,

pnas.0609737104.

Nature, 227, 680-685, doi: 10.1038/227680a0.

51.

Nunomura, A., Honda, K., Takeda, A., Hirai, K.,

38.

Mruk, D. D., and Cheng, C. Y. (2011) Enhanced chemi-

Zhu, X., Smith, M. A., and Perry, G. (2006) Oxida-

luminescence (ECL) for routine immunoblotting, Sper-

tive damage to RNA in neurodegenerative diseas-

matogenesis, 1, 121-122, doi: 10.4161/spmg.1.2.16606.

es, J. Biomed. Biotechnol., 2006, 82323, doi: 10.1155/

39.

Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., and

JBB/2006/82323.

Mann, M. (2014) Minimal, encapsulated proteomic-

52.

Martinet, W., de Meyer, G. R. Y., Herman, A. G.,

sample processing applied to copy-number estimation

and Kockx, M. M. (2004) Reactive oxygen spe-

in eukaryotic cells, Nat. Methods, 3, 319-324, doi:

cies induce RNA damage in human atherosclero-

10.1038/nmeth.2834.

sis, Eur. J. Clin. Invest., 34, 323-327, doi: 10.1111/

40.

Sherman, F., Fink, G. R., and Hicks, J. B. (1986)

j.1365-2362.2004.01343.x.

Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor

53.

Liu, M., Gong, X., Alluri, R. K., Wu, J., Sablo, T.,

Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York.

and Li, Z. (2012) Characterization of RNA damage

41.

Kulaev, I. S. (1979) The Biochemistry of Inorganic

under oxidative stress in Escherichia coli, Biol. Chem.,

Polyphosphates, 1st Edn, Wiley.

393, 123-132, doi: 10.1515/hsz-2011-0247.

42.

Andreeva, N., Ryazanova, L., Dmitriev, V., Kula-

54.

Nakatsu, Y., and Sekiguchi, M. (2006) Oxidative

kovskaya, T., and Kulaev, I. (2013) Adaptation of

Damage to Nucleotide: Consequences and Preventive

Saccharomyces cerevisiae to toxic manganese con-

Mechanisms, in Oxidative Stress, Disease and Cancer

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023

НАКОПЛЕНИЕ ПОЛИФОСФАТОВ И УСТОЙЧИВОСТЬ ДРОЖЖЕЙ К СТРЕССУ

135

(Singh, K. K., ed.) Imperial College Press, London,

секрецию в среду культивирования, Микробиоло-

pp. 221-252.

гия (Москва), 69, 34-37.

55. Kanazawa, K., Sakamoto, M., Kanazawa, K., Ishigaki,

59. Горковский А.А. (2009) Выявление и частичная

Y., Aihara, Y., Hashimoto, T., and Mizuno, M. (2016)

характеристика белков клеточной стенки дрож-

Lipid peroxides as endogenous oxidants forming 8-oxo-

жей Saccharomyces cerevisiae, обладающих свой-

guanosine and lipid soluble antioxidants as suppressing

ствами амилоидов. Дис. канд. биол. наук. ИБФМ,

agents, J. Clin. Biochem. Nutr., 59, 16-24, doi: 10.3164/

Пущино.

jcbn.15-122.

60. Kalebina, T. S., Laurinavichiute, D. K., Packeiser,

56. Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A.,

A. N., Morenkov, O. S., Ter-Avanesyan, M. D., and

and Addepalli, B. (2021) Oxidative damage to RNA

Kulaev, I .S. (2002) Correct GPI-anchor synthesis is

is altered by the presence of interacting proteins or

required for the incorporation of endoglucanase/glu-

modified nucleosides, Front. Mol. Biosci., 8, 697149,

canosyltransferase Bgl2p into the Saccharomyces cere-

doi: 10.3389/fmolb.2021.697149.

visiae cell wall, FEMS Microbiol. Lett., 210, 81-85, doi:

57. Jones, D. P. (2008) Radical-free biology of oxidative

10.1111/j.1574-6968.2002.tb11163.x.

stress, Am. J. Physiol. Cell. Physiol., 295, C849-868,

61. Basu, A., Chaudhuri, P., Malakar, D., and Ghosh,

doi: 10.1152/ajpcell.00283.2008.

A. K.

(2007) Co-purification of glucanase with

58. Егоров С. Н., Семенова И. Н., Максимов В. Н.

acid trehalase-invertase aggregate in Saccharomyces

(2000) Взаимное влияние инвертазы и кислой

cerevisiae, Biotechnol. Lett., 30, 299-304, doi: 10.1007/

фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae на их

s10529-007-9535-y.

THE EFFECT OF DELETIONS OF GENES ENCODING Pho3p AND Bgl2p

ON THE POLYPHOSPHATE LEVEL, STRESS ADAPTATION

AND ATTACHMENT OF THESE PROTEINS

IN Saccharomyces cerevisiae CELL WALL

T. S. Kalebina¹*, E. V. Kulakovskaya², V. V. Rekstina¹, L. V. Trilisenko², R. H. Ziganshin³,

N. V. Marmiy⁴, D. S. Esipov⁵, and T. V. Kulakovskaya²

¹ Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, Department of Molecular Biology,

119234 Moscow, Russia; e-mail: kalebina@gmail.com

² Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”,

Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, 142290 Pushchino, Russia

³ Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences,

117997 Moscow, Russia

⁴ Institute of Mitoengineering, Lomonosov Moscow State University, 119992 Moscow, Russia

⁵ Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, Department of Bioorganic Chemistry,

119234 Moscow, Russia

Inorganic polyphosphates (polyP), according to literature data, are involved in the regulatory processes of molecular

complex of the Saccharomyces cerevisiae cell wall (CW). The aim of the work was to reveal relationship between polyP,

acid phosphatase Pho3p, and the major CW protein, glucanosyl transglycosylase Bgl2p, which is the main glucan-

remodelling enzyme with amyloid properties. It has been shown that the yeast cells with deletion of the PHO3 gene

contain more high molecular alkali-soluble polyP and are also more resistant to exposure to alkali and manganese

ions compared to the wild type strain. This suggests that Pho3p is responsible for hydrolysis of the high molecular

polyP on the surface of yeast cells, and these polyP belong to the stress resistance factors. The S. cerevisiae strain

with deletion of the BGL2 gene is similar to the Δpho3 strain both in the level of high molecular alkali-soluble polyP

and in the increased resistance to alkali and manganese. Comparative analysis of the CW proteins demonstrated

correlation between the extractability of the acid phosphatase and Bgl2p, and also revealed a change in the mode of

Bgl2p attachment to the CW of the strain lacking Pho3p. It has been suggested that Bgl2p and Pho3p are able to form

a metabolon or its parts that connects biogenesis of the main structural polymer of the CW, glucan, and catabolism

of an important regulatory polymer, polyphosphates.

Keywords: yeast, cell wall, polyphosphates, acid phosphatase, glucanosyltransglycosylase, Pho3p, Bgl2p, stress

БИОХИМИЯ том 88 вып. 1 2023