БИОХИМИЯ, 2023, том 88, вып. 11, с. 2308 - 2313

УДК 577.12

ФУНКЦИЯ КОНСЕРВАТИВНЫХ

«НЕФУНКЦИОНАЛЬНЫХ» ОСТАТКОВ В АПОМИОГЛОБИНЕ -

ОБЕСПЕЧИТЬ И СОХРАНИТЬ ПРАВИЛЬНУЮ ТОПОЛОГИЮ БЕЛКА

Мини-обзор

¹ Институт белка РАН,

142290 Пущино, Московская обл., Россия; электронная почта: balobanov@phys.protres.ru

² Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117871 Москва, Россия

Поступила в редакцию 18.07.2023

После доработки 18.07.2023

Принята к публикации 31.08.2023

В предлагаемой работе на основании анализа работ трёх лабораторий получен ответ на вопрос

О.Б. Птицына: какова роль консервативных нефункциональных остатков в апомиоглобине. Выяв-

лена решающая роль консервативных нефункциональных остатков в апомиоглобине в образова-

нии нативной топологии в состоянии расплавленной глобулы этого белка. Это позволяет предпо-

ложить, что нефункциональные консервативные остатки в этом белке необходимы для фиксации

и сохранения правильной топологии основных элементов его вторичной структуры в промежуточ-

ном состоянии. Правильная топология является нативным элементом в этом состоянии.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: апомиоглобин, консервативные остатки, стабильность белка, сворачивание белка,

нативная топология.

DOI: 10.31857/S0320972523110192, EDN: MNCECS

Посвящается памяти О.Б. Птицына

ВВЕДЕНИЕ

только некоторого [8] или даже довольно боль-

шого [9] числа нативо-подобных контактов,

Предлагаемая вашему вниманию работа

и специфического, зависящего от чётко опре-

является небольшим обзором литературных

делённого ядра сворачивания [6, 10]. В 1996 г.

данных с целью получения однозначного отве-

был предложен метод определения такого ядра

та на вопрос, заданный почти 30 лет назад.

сворачивания, использующий эволюционно

В 90-х гг. прошлого столетия широко об-

консервативные остатки и предполагающий их

суждалось сворачивание белков, особенно бел-

участие в образовании ядра сворачивания [11].

ков с промежуточными состояниями [1, 2].

В том же 1996 г. О.Б. Птицын обнаружил,

Был предложен ряд моделей для механизма

что в ряде глобинов наблюдаются консерватив-

сворачивания белка, включая неспецифиче-

ные остатки, не участвующие в связывании

ский коллапс [3], иерархическую модель [1, 2, 4],

гема, т.е. нефункциональные. Этот факт был

модель диффузии-столкновения [5] и меха-

позднее подтверждён для 728 глобиновых пос-

низм нуклеации-роста, вовлекающий образо-

ледовательностей [12]. Важной особенностью

вание переходного состояния [6, 7]. Последний

данных остатков было их расположение внут-

механизм включает две модели переходного

ри гидрофобного ядра белковой глобулы. Та-

состояния - неспецифического, требующего кое расположение разом отметает варианты

Принятые сокращения: A, G и H - основные альфа-спирали апомиоглобина; apoMb - апомиоглобин; MG - со-

стояние расплавленной глобулы; SW apoMb - апомиоглобин кашалота.

* Адресат для корреспонденции.

2308

НАТИВНАЯ ТОПОЛОГИЯ И РОЛЬ НЕФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСТАТКОВ

2309

консервативности остатков, связанные с меж-

сти от условий эксперимента при равновес-

белковыми взаимодействиями и посттрансля-

ном разворачивании SW apoMb наблюдались

ционными модификациями. Таким образом,

один [15, 16] или два [17] интермедиата. За по-

выявленные остатки, казалось бы, не участву-

следующие годы техника эксперимента была

ют ни в каких функциях белка. Как итог, явная

существенно усовершенствована, позволяя из-

консервативность и неясная важность для бел-

мерять всё более быструю кинетику сворачи-

ка сформировали вопрос о роли этих амино-

вания белков [18-20].

кислотных остатков. Для ответа на этот вопрос

С использованием микросекундной кине-

потребовалось много лет работы трёх круп-

тики было предпринято исследование равно-

ных лабораторий: лаборатории физики бел-

весного и кинетического сворачивания/раз-

ка, организованной О.Б. Птицыным, лаборато-

ворачивания SW apoMb дикого типа [20] и MG

рии П. Райта в Сан-Диего (США) и лаборато-

мутантных белков с заменами как консерва-

рии Х. Родера (Филадельфия, США). Теперь,

тивных, так и неконсервативных остатков в

опираясь на исследования этих лабораторий,

лаборатории Х. Родера** [21]. В результате этих

мы можем провести анализ и однозначно от-

работ было показано, что сворачивание SW

ветить на вопрос о роли консервативных не-

apoMb при рН 4,2 проходит через один или два

функциональных аминокислотных остатков

промежуточных состояния в зависимости от

апомиоглобина (apoMb).

растворителя. При этом замена консерватив-

К 1996 г. в лаборатории П. Райта (Сан-

ных остатков слабо сказывается в переходе U →

Диего)* был сконструирован ген апомиогло-

→ интермедиат L (U - развёрнутое состояние),

бина кашалота (SW apoMb), самого стабиль-

но начинает сильно влиять на стабильность

ного из миоглобинов [13], для получения белка

конечного структурного состояния MG при

в прокариотических экспрессионных системах.

рН 4,2.

Таким образом, появилась возможность мани-

пуляций с его аминокислотной последователь-

ностью и экспериментальной проверки того,

РОЛЬ НЕФУНКЦИОНАЛЬНЫХ

на что влияет замена консервативных нефунк-

КОНСЕРВАТИВНЫХ ОСТАТКОВ

циональных остатков - на скорость свора-

чивания белка, на его стабильность или на

Таким образом, изучение равновесного и

что-то другое. Было предположено, что эти

кинетического сворачивания/разворачивания

остатки важны для быстрого и правильного

SW apoMb при рН 4,2 [21] показало, что за-

сворачивания белка [12]. Используя совмест-

мена консервативных остатков сильнее всего

ный с П. Райтом грант, одним из нас (Д.Д.)

сказывается на стабильности состояния рас-

были сконструированы плазмиды мутантных

плавленной глобулы (apoMb MG) при рН 4,2,

apoMb, включавшие замены всех консерва-

а также на стабильности нативного состояния

тивных остатков на Ala, а также некоторых из

этого белка, как это было показано ранее [14].

них на Trp и Met. В дополнение к ним были

Замена консервативных остатков не оказала

сконструированы плазмиды и для нескольких

существенного влияния на скорость сворачи-

замен неконсервативных остатков, которые

вания SW apoMb ни при нейтральном рН, ни

могли быть важны для перехода из состояния

при рН 4,2 в состоянии MG. Особенно важно,

расплавленной глобулы (MG) в нативное (N)

что состояние L отделено от состояния MG

состояние или для кинетического сворачива-

конформационным переходом. Оба этих со-

ния и разворачивания полученных мутантных

стояния имеют сходную вторичную структуру,

белков. Интенсивное исследование в натив-

но в состоянии MG элементы этой структуры

ных условиях при pH 6,2 показало, что замена

взаимно ориентированы и образуют нативо-

консервативных остатков на Ala сильно сказы-

подобную топологию. Такой результат указал

вается на стабильности структуры SW apoMb

на важность консервативных остатков для ста-

относительно разворачивания, особенно на

билизации состояния MG и взаимной ориен-

его стабильности в промежуточном состоя-

тации элементов вторичной структуры в нём.

нии, и заметно слабее - на кинетике его сво-

Дополнительный анализ эксперименталь-

рачивания [14]. Следует отметить, что измере-

ных данных в работе Mizukami et al. [21] чётко

ния кинетики в то время ограничивались

показал, что роль консервативных остатков

миллисекундным интервалом (мёртвое время

резко возрастает при переходе из интермедиа-

прибора - доли миллисекунды). В зависимо-

та L в состояние MG при рН 4,2. В работах

* P. Wright, The Scripss Research Institute, La Jolla, CA 92037, USA.

** H. Roder, Fox Chase Cancer Center, 333 Cottman Ave, Philadelphia, PA 19111.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 11 2023

2310

БЫЧКОВА и др.

Nishimura et al. и Aoto et al. [22, 23] показано,

собен связываться с отрицательно заряженной

что в этом же переходе происходит образова-

поверхностью мембран [25]. Таким образом,

ние связей между консервативными остат-

условие рН ~4, казавшееся сначала трудновы-

ками. Это позволяет удерживать положение

полнимым, становится реальностью при ана-

А-спирали в комплексе с G- и H-спиралями.

лизе условий биосинтеза apoMb в клетке.

Для SW apoMb было показано наличие кон-

Теперь следует вспомнить, в чём главное

тактов между A-, G- и H-спиралями в состоя-

отличие нативного состояния белка от состоя-

нии MG. В лаборатории П. Райта методом ЯМР

ния MG. Для нативной формы белка характер-

было обнаружено, что в процессе сворачива-

на плотная упаковка боковых групп и нативная

ния apoMb в промежуточном состоянии сна-

топология, т.е. нативное расположение основ-

чала возникает ненативный контакт между

ных элементов вторичной структуры. Для со-

консервативными остатками на спирали H

стояния MG характерно отсутствие плотной

(Leu135) и спирали G (Leu115), а при формиро-

упаковки боковых групп, но в нём сохраняется

вании нативного состояния - уже между пра-

нативная топология - нативное расположение

вильными остатками Leu135 и Ile111 [22, 23].

основных элементов вторичной структуры.

С другой стороны, в работе итальянских иссле-

У SW apoMb в состоянии MG отсутствует плот-

дователей было показано, что замена Trp14 в

ная упаковка боковых групп, но сохраняется

спирали А на Met в миоглобине (Mb) из Aplysia

нативная топология (взаимное расположение)

limacina ведёт к одновременной замене Met130

основных A-, G- и H-спиралей. Возникает

в спирали H (аналога остатка 131 в SW apoMb)

вопрос: что позволяет сохранять нативное вза-

на Trp [24], т.е. сохраняется тот же контакт ме-

имное расположение спиралей в этом состоя-

жду спиралями A и H. Следует отметить, что

нии при отсутствии плотной упаковки боко-

Trp130 в этом белке образует четыре из шести

вых групп? Разумно было бы предположить,

консервативных нефункциональных связей с

что спирали должны быть каким-то образом

другими остатками [24].

скреплены. В этом случае наличие консерва-

Консерватизм аминокислотных остатков в

тивных остатков, попарно расположенных на

последовательности говорит об их биологиче-

A-, G- и H-спиралях и взаимодействующих

ской значимости. Для определения этой значи-

между собой, как раз и было бы той скрепкой,

мости необходимо выяснить, насколько важна

которая позволила бы удерживать их правиль-

стабильность состояния MG в клетке и в каких

ное расположение в состоянии MG.

процессах белок может переходить в такое со-

Как было показано нами [26], SW apoMb

стояние. Образование MG при рН 4,2 ставит

обладает высокой аффинностью к мембране.

вопрос о том, где же в клетке можно наблюдать

Его нативная и развёрнутая в мочевине формы

сходные условия. Напомним путь биосинтеза

в присутствии мембран связываются с ними,

apoMb в клетке. Он синтезируется на рибо-

приобретая состояние, которое по спектраль-

сомах вблизи мембраны эндоплазматического

ным и флуоресцентным свойствам сходно с

ретикулума (ER), рН около которой составля-

apoMb в состоянии MG. Поэтому изучение

ет 5-6, и связывается с ней. Затем полипеп-

структуры белков, связанных с мембранами,

тидная цепь apoMb перемещается (движется)

представляет особый интерес, особенно в слу-

вдоль мембраны ER и достигает места соеди-

чае SW apoMb, когда есть возможность изучить

нения мембраны ER и внешней митохондри-

влияние замен нефункциональных консер-

альной мембраны, поверхность которой уже

вативных остатков на изменение структуры

заряжена отрицательно. Таким образом, рН ~4

белка в мембране, вызванное этими заменами.

может наблюдаться около внешней мембраны

Таким образом, любые данные о структуре

митохондрии, а это - условия образования MG!

apoMb, связанного с мембраной, будут инте-

Образовавшаяся структура apoMb, связанная

ресны с точки зрения неизвестной структуры

с мембраной, способна связывать гем, синте-

MG apoMb и тех изменений, которые вносят

зируемый только в митохондрии.

замены нефункциональных консервативных

Однако после связывания гема образо-

остатков. Экспериментально доказать правиль-

вавшийся холо-Mb уже не имеет сродства к

ную топологию apoMb и его мутантных форм

мембране, выходит в цитоплазму и никогда не

с заменами нефункциональных консерватив-

возвращается во внешнюю мембрану мито-

ных остатков в состоянии типа MG, по-ви-

хондрии. Таким образом, рН ~4 необходим как

димому, можно, изучив структуру белка, свя-

для связывания апобелка с внешней мембра-

занного с мембраной, с использованием но-

ной митохондрии, так и для связывания гема.

вейших методов ЯМР.

Ранее нами было показано, что apoMb в его

Таким образом, основываясь на резуль-

нативном состоянии и в состоянии MG спо-

татах работ Mizukami et al., Nishimura et al.,

БИОХИМИЯ том 88 вып. 11 2023

НАТИВНАЯ ТОПОЛОГИЯ И РОЛЬ НЕФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСТАТКОВ

2311

Aoto et al. и Musto et al. [21, 22-24], на примере

Возможно ли проецировать выявленные

apoMb можно впервые сделать чёткое пред-

нами закономерности на сворачивание дру-

положение: «Нефункциональные консерватив-

гих белков? Да! Принципы самоорганизации

ные остатки в белках необходимы для фик-

одинаковы для всех белков - пусть пока не

сации и сохранения правильной топологии

до конца нами поняты и детально описаны,

основных элементов вторичной структуры

но одинаковы! Как мы утверждаем, наличие

белка в промежуточном состоянии типа MG.

консервативных остатков в гидрофобном ядре

Правильная топология является нативным

белка и отсутствие явной их функциональной

элементом в этом состоянии». Для apoMb это

значимости являются достаточно чёткими

означает сохранение AGH-комплекса, воз-

критериями для биоинформатического поиска

можно, дополненного близлежащими некон-

остатков, важных в процессе сворачивания.

сервативными остатками B- и E-спиралей.

При этом, как нами показано в данной статье,

Насколько нам известно, в работе Mizukami

одна из возможных ролей таких остатков -

et al. [21] впервые показано, что наблюдается

формирование правильной топологии поли-

переход между интермедиатом с топологией

пептидной цепи на промежуточных этапах

и интермедиатом с просто подобной вторич-

сворачивания. Значимость промежуточных со-

ной структурой. В этой же работе показано в

стояний белков для жизни клетки позволяет

первый раз, что нативная топология может

таким остаткам законсервироваться в после-

быть «расплавлена» изменением рН, так как

довательности.

образование нативной топологии наблюдается

в переходе рН 2 - рН 4,2.

Вклад авторов. В.Е. Бычковой и Д.А. Дол-

Сходная ситуация наблюдается и для ци-

гих проведён дополнительный анализ экспери-

тохрома c [27], для которого обнаружено четы-

ментальных данных; В.Е. Бычкова, Д.А. Дол-

ре консервативных остатка, расположенных по

гих и В.А. Балобанов участвовали в написании

два на N- и C-спиралях, что позволяет удер-

статьи.

живать их в комплексе на поверхности мито-

Благодарности. Авторы выражают свою

хондрии.

глубокую благодарность П.Е. Райту за его по-

По-видимому, для фиксации правильной

мощь и поддержку, а также структурные дан-

топологии в белках природа использует не

ные, Х. Родеру за полученные важные резуль-

только связи между нефункциональными кон-

таты и их обсуждение, Е.В. Серебровой за по-

сервативными остатками. Возможно, ту же

мощь в подготовке статьи, а также всем иссле-

роль выполняют консервативные изгибы пе-

дователям, принимавшим участие в изучении

тель, что наблюдается для клеточного белка,

апомиоглобина.

связывающего ретиноловую кислоту [28-30],

Конфликт интересов. Авторы заявляют об

или же это обеспечивает правильное образо-

отсутствии конфликта интересов.

вание S-S-связей, что наблюдается в семей-

Соблюдение этических норм. Настоящая

стве лактальбумин/лизоцимов [31], где кон-

статья не содержит описания каких-либо ис-

сервативные остатки располагаются близко

следований с участием людей или животных

к S-S-связям.

в качестве объектов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Kim, P. S., and Baldwin, R. L. (1990) Intermediates

5. Karplus, M., and Weaver, D. L. (1994) Protein folding

in the folding reactions of small proteins, Ann.

dynamics: the diffusion-collision model and exper-

Rev. Biochem., 59, 631-660, doi: 10.1146/annurev.

imental data, Protein Sci., 3, 650-668, doi: 10.1002/

bi.59.070190.003215.

pro.5560030413.

2. Ptitsyn, O. B. (1991) How does protein synthesis give

6. Abkevich, V. I., Gutin, A. M., and Shakhnovich,

rise to the 3D-structure? FEBS Lett., 285, 176-181,

E. I. (1994) Specific nucleus as the transition state

doi: 10.1016/0014-5793(91)80799-9.

for protein folding: evidence from the lattice model,

3. Dill, K. A., Fiebig, K. M., and Chan, H. S. (1993) Co-

Biochemistry,

33,

10026-10036, doi:

10.1021/

operativity in protein folding kinetics, Proc. Natl. Acad.

bi00199a029.

Sci. USA, 90, 1942-1946, doi: 10.1073/pnas.90.5.1942.

7. Guo, Z., and Thirumalai, D. (1995) Kinetics of pro-

4. Ptitsyn, O. B. (1973) Stages in the mechanism of self-

tein folding: nucleation mechanism, time scales, and

organisation of protein molecules, Dokl. Akad. Nauk

pathways, Biopolymers,

36,

83-102, doi:

10.1002/

SSSR, 210, 1213-1215.

bip.360360108.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 11 2023

2312

БЫЧКОВА и др.

Wolynes, P. G., Onuchic, J. N., and Thirumalai, D.

at acidic pH, J. Phys. Chem. B, 116, 7014-7025, doi:

(1995) Navigating the folding routes, Science, 267,

10.1021/jp3012365.

1619-1620, doi: 10.1126/science.7886447.

21.

Mizukami, T., Xu, M., Fazlieva, R., Bychkova, V. E.,

Finkelstein, A. V., and Badretdinov, A. Y. (1997) Rate

and Roder, H. (2018) Complex folding landscape of

of protein folding near the point of thermodynamic

apomyoglobin at acidic pH revealed by ultrafast kinetic

equilibrium between the coil and the most stable

analysis of core mutants, J. Phys. Chem. B, 122, 11228-

chain fold, Fold. Des., 2, 115-121, doi: 10.1016/s1359-

11239, doi: 10.1021/acs.jpcb.8b06895.

0278(97)00016-3.

22.

Nishimura, C., Dyson, H. J., and Wright, P. E. (2006)

10.

Fersht, A. R. (1995) Optimization of rates of protein

Identification of native and non-native structure in

folding: The nucleation-condensation mechanism and

kinetic folding intermediates of apomyoglobin, J. Mol.

its implications, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 10869-

Biol., 355, 139-156, doi: 10.1016/j.jmb.2005.10.047.

10873, doi: 10.1073/pnas.92.24.10869.

23.

Aoto, P. C., Nishimura, C., Dyson, H. J., and

11.

Shakhnovich, E. I., Abkevich, V., and Ptitsyn, O. B.

Wright, P. E. (2014) Probing the non-native H he-

(1996) Conserved residues and the mechanism of

lix translocation in apomyoglobin folding interme-

protein folding, Nature, 379, 96-98, doi: 10.1038/

diates, Biochemistry, 53, 3767-3780, doi: 10.1021/

379096a0.

bi500478m.

12.

Ptitsyn, O. B., and Ting, K. L. (1999) Non-functional

24.

Musto, R., Bigotti, M. G., Travaglini-Allocatelli, C.,

conserved residues in globins and their possible role

Brunori, M., and Cutruzzola, F. (2004) Folding of

as a folding nucleus, J. Mol. Biol., 291, 671-682,

Aplysia limacina apomyoglobin involves an interme-

doi: 10.1006/jmbi.1999.2920.

diate in common with other evolutionarily distant

13.

Jennings, P., and Wright, P. E. (1993) Formation of

globins, Biochemistry,

43,

230-236, doi:

10.1021/

a molten globule intermediate early in the kinetic

bi035319l.

folding pathway of myoglobin, Science, 262, 892-896,

25.

Балобанов В. А., Ильина Н. Б., Катина Н. С.,

doi: 10.1126/science.8235610.

Кашпаров И. А., Долгих Д. А., Бычкова В. Е.

14.

Samatova, E. N., Melnik, B. S., Balobanov, V. A.,

(2010) Кинетика взаимодействия между апомио-

Katina, N. S., Dolgikh, D. A., Semisotnov, G. V.,

глобином и фосфолипидными мембранами, Мол.

Finkelstein, A. V., and Bychkova, V. E. (2010) Folding

Биол. (Москва), 44, 708-711.

intermediate and folding nucleus for I-N and U-I-N

26.

Bychkova, V. E., Basova, L. V., and Balobanov, V. A.

transitions in apomyoglobin: Contributions by con-

(2014) How membrane surface affects protein struc-

served and non-conserved residues, Biophys. J., 98,

ture, Biochemistry (Moscow),

79,

1483-1514, doi:

1694-1702, doi: 10.1016/j.bpj.2009.12.4326.

10.1134/S0006297914130045.

15.

Elieser, D., Jennings, P. A., Wright, P. E., Doniach, S.,

27.

Ptitsyn, O. B. (1998) Protein folding and protein

Hodgson, K. O., and Tsuruta, H. (1995) The radius

evolution: common folding nucleus in different

of gyration of an apomyoglobin folding intermedi-

subfamily of c-type cytochromes? J. Mol. Biol., 278,

ate, Science, 270, 487-488, doi: 10.1126/science.270.

655-666, doi: 10.1006/jmbi.1997.1620.

5235.487.

28.

Rotondi, K. S., and Gierasch, L. M. (2003) Local

16.

Hughson, F. M., Wright, P. E., and Baldwin, R. L.

sequence information in cellular retinoic acid-

(1990) Structural characterization of a partly folded

binding protein I: specific residue roles in beta-turns,

apomyoglobin intermediate, Science, 249, 1544-1548,

Biopolymers, 71, 638-651, doi: 10.1002/bip.10592.

doi: 10.1126/science.2218495.

29.

Rotondi, K. S., and Gierasch, L. M. (2003) Role of

17.

Jamin, M., and Baldwin, R. L. (1998) Two forms of the

local sequence in the folding of cellular retinoic acid-

pH 4 folding intermediate of apomyoglobin, J. Mol.

binding protein I: structural propensities of reverse

Biol., 276, 491-504, doi: 10.1006/jmbi.1997.1543.

turns, Biochemistry,

42,

7976-7985, doi:

10.1021/

18.

Shastry, M. C. R., and Roder, H. (2004) Evidence

bi034304k.

for barrier-limited protein folding kinetics on the

30.

Gunasekaran, K., Haqler, A. T., and Gierasch, L. M.

microsecond time scale, Nat. Struct. Biol., 5, 385-392,

(2004) Sequence and structural analysis of cellular

doi: 10.1038/nsb0598-385.

retinoic acid-binding proteins reveal a network of

19.

Roder, H., Maki, K., and Cheng, H. (2006) Early

conserved hydrophobic interactions, Proteins,

54,

events in protein folding explored by rapid mixing

179-194, doi: 10.1002/prot.10520.

methods, Chem. Rev., 106, 1836-1861, doi: 10.1021/

31.

Ting, K.-L. H., and Jernigan, R. L. (2002) Identifiing

cr040430y.

a folding nucleus for the lysozyme/alfa-lactalbumin

20.

Xu, M., Beresneva, O., Rosario, R., and Roder, H.

family from sequence conservation clusters, J. Mol.

(2012) Microsecond folding dynamics of apomyoglobin

Evol., 54, 425-436, doi: 10.1007/s00239-001-0033-x.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 11 2023