БИОХИМИЯ, 2023, том 88, вып. 6, с. 900 - 912

УДК 577.151;579.01/08;571.27

РЕКОМБИНАНТНЫЕ ЭНДОПЕПТИДАЗЫ IdeS И IdeZ

И ВОЗМОЖНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Н.Б. Поляков¹, А.М. Лящук¹, С.В. Константинова¹, З.М. Галушкина¹, Е.В. Устенко¹

¹ Национальный исследовательский центр эпидемиологии

и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи,

123098 Москва, Россия; электронная почта: boksha_irina@mail.ru

² ФГБНУ «Научный центр психического здоровья», 115522 Москва, Россия

Поступила в редакцию 30.03.2023

После доработки 14.04.2023

Принята к публикации 15.04.2023

Эндопептидазы IdeS и IdeZ - факторы вирулентности стрептококков, специфически расщепляю-

щие тяжёлые цепи IgG, интересны с точки зрения биотехнологии, медицины и ветеринарии. Гены

ideS и ideZ (в случае ideS ген клонирован из коллекционного штамма Streptococcus pyogenes, в слу-

чае ideZ - синтетический из Streptococcus zooepidemicus) клонированы и экспрессированы в системе

гетерологичной экспрессии в Escherichia coli, в аминокислотную последовательность каждой эндо-

пептидазы введён аффинный домен 6His-tag. Ферменты IdeS и IdeZ выделены и очищены металл-

аффинной хроматографией. Полученные IdeS и IdeZ гомогенны при электрофорезе в полиакрил-

амидном геле и активны в отношении IgG человека и различных видов животных. Специфичность

расщепления IgG человека эндопептидазами IdeS и IdeZ подтверждена методом электрофореза

в полиакриламидном геле. Продемонстрировано применение рекомбинантной IdeZ для имму-

нологического анализа мыта лошадей (диагностики и определения титра специфических анти-

тел в крови). Таким образом, кроме применения в медицине и биотехнологии, IdeZ может при-

меняться в ветеринарии и санитарной микробиологии для диагностики инфекций, вызываемых

Streptococcus equi и S. zooepidemicus.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: рекомбинантные эндопептидазы, IdeS, IdeZ, расщепление IgG, мыт лошадей,

иммуноферментный анализ.

DOI: 10.31857/S0320972523060027, EDN: EDQMNB

ВВЕДЕНИЕ

ми будущего могут стать разработки новых

защитных вакцин, усилителей иммунитета

Наблюдаемое ныне широкое распростра-

организма-хозяина, а также поиск блокаторов

нение устойчивых к антибиотикам бактери-

факторов вирулентности. Поэтому иммунные

альных патогенов, вызванное зачастую не-

реакции организма-хозяина и соответствую-

оправданным и неправильным применением

щие стратегии, возникшие для уклонения от

антибиотиков в медицине и ветеринарии, а

них и «используемые» микроорганизмами для

также в производстве продуктов питания, ли-

избегания обнаружения и элиминации, пред-

шает нас возможности вести эффективную

ставляют собой важную и интересную область

борьбу с патогенами. Обычные инфекции те-

исследований.

перь всё чаще приводят к летальному исходу

Один из ярких примеров - секреция пато-

из-за неэффективности антибиотиков вслед-

генными стрептококками ряда протеолитиче-

ствие резистентности к ним микроорганиз-

ских ферментов, действие которых нарушает

мов. Лучшее понимание механизмов взаимо-

нормальное функционирование IgG. Так, па-

действия между бактериальными патогенами

тоген человека Streptococcus pyogenes секрети-

и организмами-хозяевами на молекулярном

рует ферменты EndoS, SpeB и IdeS. EndoS

уровне необходимо для разработки альтерна-

гидролизует консервативный N-концевой гли-

тивных стратегий лечения и профилактики

кан тяжёлых цепей IgG человека [1], что сни-

бактериальных инфекций. Этими стратегия-

жает их сродство к большинству рецепторов

IgG-Fc [2]. SpeB - неспецифическая протеа-

* Адресат для корреспонденции.

за, расщепляющая в числе других субстратов

900

ЭНДОПЕПТИДАЗЫ IdeS И IdeZ

901

также и IgG [3]. Кроме того, S. pyogenes секре-

патогенов животных - Streptococcus equi - ха-

тирует эндопептидазу IdeS, которая с высокой

рактеризуется узким спектром хозяев (поражает

специфичностью расщепляет все 4 подклас-

непарнокопытных), а второй - Streptococcus

са IgG человека в нижней части шарнир-

zooepidemicus - встречается у многих живот-

ной области тяжёлой цепи с образованием

ных, включая непарнокопытных, а также у чело-

F(ab)₂-фрагмента, полностью сохраняющего

века. Идентичность последовательностей ДНК

антигенсвязывающую активность, и димер-

штаммов S. equi, S. zooepidemicus и S. pyogenes

ного Fc-фрагмента [4, 5]. Как следствие, анти-

составляет около 80% [15].

тела IgG, расщепленные IdeS, оказываются

Актуальность изучения S. equi и S. zooepi-

лишёнными способности связываться с ре-

demicus обусловлена не только тем, что оба

цептором IgG-Fc и активировать систему ком-

эти вида вызывают «мыт» лошадей - остро

племента.

протекающее, часто с тяжёлым течением и

Среди всех перечисленных факторов виру-

гибелью, быстро распространяющееся заболе-

лентности S. pyogenes наиболее изучена IdeS,

вание, поражающее иногда более 80% молод-

поскольку она является важнейшим антифаго-

няка - жеребят и молодых лошадей. Важно,

цитарным фактором [5, 6]. Изучен механизм

что S. zooepidemicus, ранее считавшийся оппор-

расщепления этой эндопептидазой молекул

тунистическим комменсалом, оказался способ-

IgG [7]. Расщепление происходит в два эта-

ным вызывать острое инфекционное заболе-

па [8, 9]. Первый этап, значительно превос-

вание не только у лошадей, но также и у других

ходящий по скорости последующую стадию,

млекопитающих, включая людей [16].

приводит к эффективному расщеплению од-

У S. equi и S. zooepidemicus были идентифи-

ной из двух тяжёлых цепей с образованием

цированы и охарактеризованы эндопептидазы

иммуноглобулиновой молекулы (scIgG), сохра-

IdeZ и IdeE - гомологи IdeS S. pyogenes [17].

няющей целой одну из тяжёлых цепей. Такого

Оба эти фермента (IdeZ и IdeE) тоже эффек-

расщепления уже оказывается достаточно для

тивно расщепляют иммуноглобулины клас-

того, чтобы иммуноглобулин утратил свои

са IgG (включая IgG человека), содержащие

функции [9]. Молекула scIgG менее чувстви-

субстратный участок LLGGP, что свидетель-

тельна к расщеплению IdeS, чем молекула IgG

ствует о сходстве субстратной специфичности

с двумя целыми тяжёлыми цепями, и расщеп-

с IdeS. IdeE является гомологом IdeZ (сход-

ление молекулы scIgG происходит в 100 раз

ство достигает

86%) и EndoS S. pyogenes

медленнее, чем IgG, с образованием одного

(70% сходства). Кроме того, у S. equi обнару-

фрагмента F(ab′)₂ и одного фрагмента Fc [9].

жен ген ideE2, кодирующий дополнительную

Примечательно, что IdeS уже нашла приме-

внеклеточную эндопептидазу IdeE2, сходную

нение в качестве биофармацевтического сред-

по последовательности с IdeE и IdeZ и также рас-

ства. Биомедицинское применение эндопеп-

щепляющую IgG. Более того, у S. zooepidemicus

тидазы IdeS основано на высокоспецифичном

найден гомологичный белок IdeZ2.

расщеплении IgG при прямом введении IdeS

По механизму действия IdeS, IdeZ и IdeE

пациентам в кровь [4]. Например, её приме-

относятся к цистеиновым протеиназам [4].

няют для расщепления IgG при аутоиммунных

Среди других прокариотических цистеиновых

состояниях человека [10]. Также IdeS проходит

протеиназ IdeS уникальна тем, что, во-первых,

клинические испытания в области нефроло-

она секретируется в зрелой активной форме и

гии в качестве препарата, предотвращающего

не подвергается процессингу, во-вторых, она

гуморальную реакцию отторжения у больных

обладает высокой специфичностью к своему

после трансплантации почки [11, 12]. Такой

субстрату IgG и расщепляет его в единствен-

терапевтический подход уже нашёл примене-

ном месте - шарнирной области после остатка

ние при гломерулонефрите [13] и других забо-

глицина-236 обеих тяжёлых цепей, в-третьих,

леваниях почек [11]. В 2021 г. начата вторая

её активность не ингибируется типичным ин-

фаза клинических испытаний IdeS при транс-

гибитором цистеиновых протеиназ E-64 [5].

плантации почки у пациентов 18-70 лет [14],

Обе эндопептидазы - IdeS и IdeZ - расщеп-

это международное исследование проводится

ляют IgG человека [16].

США, Швецией и Францией.

Цели настоящей работы - получение ре-

В отличие от S. pyogenes, патогенного

комбинантных IdeS и IdeZ и оценка их фер-

стрептококка группы A, атакующего исклю-

ментативной активности в отношении IgG че-

чительно человека, патогенные стрептококки

ловека; выявление и определение титров

группы C поражают животных и иногда -

антител к IdeZ в крови лошадей, переболев-

человека. Первый из двух рассматриваемых

ших и не болевших мытом.

в нашей работе стрептококков группы С -

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

902

БОКША и др.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

отбирали и проводили электрофорез в 15%-ном

ПААГ для того, чтобы определить, в какой из

Все манипуляции генной инженерии (вы-

этих фракций содержится целевой белок.

деление гена, кодирующего IdeS, из штам-

Колоночную аффинную хроматографию

ма S. pyogenes Dochez NY 5 (тип 10), син-

проводили на сорбенте WorkBeads 40 Ni («Bio-

тез гена, кодирующего IdeZ, из S. equi subsp.

Works», Швеция), объём сорбента в колон-

zooepidemicus

[17], получение генетических

ке - 2 мл суспензии, перед проведением хро-

конструкций) проводили по стандартным про-

матографии белка колонка была уравновеше-

токолам, описанным ранее [18].

на 15 мМ раствором имидазол-HCl (рН 8,0).

Экспрессия генов и выращивание микроор-

Перед нанесением на колонку раствор белка

ганизма-продуцента. Клонирование, выращи-

разбавляли, добавляя к нему имидазол-HCl

вание и отбор трансгенных E. coli клонов-про-

(рН

8,0) до конечной концентрации ими-

дуцентов рекомбинантных белков проводили

дазола - 15 мМ. Градиент концентрации ими-

так же, как описано ранее [18].

дазола в элюирующем буферном растворе был

На рис. 1, а Приложения представлена элек-

от 15 мМ до 1 М, также в элюирующий рас-

трофоретическая картина экстрактов белков

твор был добавлен 0,5 М NaCl. Хроматогра-

клеток-продуцентов IdeS и IdeZ до и после

фию проводили, используя BioLogic LP («Bio-

индукции изопропилтиогалактозидом.

Rad», США).

Экстракт клеток, образцы которых нагру-

Оценку наличия ферментативной актив-

жали на дорожки 1 или 2, готовили следующим

ности - способности IdeS и IdeZ расщеп-

образом: суспензию клеток в среде культиви-

лять IgG человека - проводили с купленным

рования (1,5 мл) осаждали центрифугирова-

в аптеке фармпрепаратом «Иммуноглобулин

нием (при 5000 g), полученный осадок клеток

человека нормальный, раствор для внутримы-

суспендировали в 100 мкл раствора 8 М моче-

шечного введения, 100 мг/мл» («Микроген»,

вины в воде, добавляли к нему (1 : 1 по объё-

Россия).

му) 2-кратный буферный раствор Лэммли с

Иммунологические тесты. Образцы крови

дитиотреитолом (ДТТ) для нанесения образ-

лошадей, переболевших и не болевших мытом

цов на гель, на каждую дорожку полиакрил-

(со слов владельцев и ветеринаров, ставив-

амидного геля (ПААГ) наносили 8 мкл полу-

ших диагноз), были любезно предоставлены

ченного образца.

владельцами лошадей нескольких частных

Разрушение биомассы трансгенных микро-

конюшен Подмосковья. Всего было собрано

организмов-продуцентов, выделение и очистка

18 образцов крови лошадей в возрасте от 1 года

рекомбинантных белков из клеток продуцентов.

до 25 лет. Кровь (объёмом 5 мл) собирали летом

Ферменты IdeS и IdeZ выделяли однотипно.

2022 г. в дневное время после утренних прогу-

Биомассу бактериальных клеток, осаждён-

лок лошадей (в одно и то же время суток - как

ных центрифугированием из культуральной

от переболевших, так и от не болевших мытом)

среды, хранили при -20 °С. Разрушение био-

в вакутейнеры без добавок, отделяли сыворотки

массы проводили в «лизирующем буферном

после формирования тромба-сгустка при тем-

растворе»: 0,5 М NaCl, 1% (w/v) Triton Х-100,

пературе окружающей среды (30 °С), получен-

100 мМ Tris-HCl (pH

8,0),

10 мМ MgCl₂,

ные сыворотки замораживали при -20 °С и

10 Eд./мл раствора нуклеазы-бензоназы (вы-

хранили до анализа, размораживая непосред-

делена и очищена в лаборатории Биологиче-

ственно перед постановкой экспериментов.

ски активных наноструктур НИЦ ЭМ им. Га-

Для дальнейшего хранения при 4 °С и проведе-

малеи) и 100 мкг/мл лизоцима («Panreac-Appli-

ния повторных анализов в размороженные сы-

Chem», Германия). Соотношение клеточной

воротки добавляли азид натрия (до конечной

биомассы (мг) и

«лизирующего буферного

концентрации 0,04%).

раствора» (мл) составляло 1 : 10. Лизис клеток

Иммуноблоттинг проводили в стандарт-

проводили 25 мин при комнатной температуре

ных условиях, нагружая 2 мкг белка IdeZ на

на шейкере. Обработку ультразвуком суспен-

каждую дорожку при электрофорезе, перед про-

зии лизированных клеток проводили в тече-

ведением которого проводилась обработка IdeZ

ние 5 мин при амплитуде 60% (по 2 с, с 2-се-

прогреванием при 95 °С в течение 5 мин в

кундными интервалами) на льду, используя

2-кратном

«буферном растворе для образ-

установку Bandelin Sonopuls (HD2070) с мик-

цов» по Лэммли с восстановителем ДТТ. По-

ронасадкой («Bandelin», Германия). Центри-

сле процедуры электроблоттинга белка IdeZ

фугировали суспензию при

22 000 g

15 мин

на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C

при 4 °С, пробы белка из полученных после

Extra («Amersham», Швеция) её окрашивали для

центрифугирования «осадка» и «супернатанта»

контроля качества и равномерности переноса

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

ЭНДОПЕПТИДАЗЫ IdeS И IdeZ

903

раствором Красного Понсо, блокировали

максимального времени (120 мин), отбирая

раствором

0,5 мг/мл бычьего сывороточ-

пробы через определённые промежутки вре-

ного альбумина (Bovine Serum Albumin Frac-

мени. Отобранные пробы смешивали с холод-

tion V, «Panreac-AppliСhem») в 20 мМ Tris-HCl,

ным буфером для образцов по Лэммли без

(pH 7,5), содержащем 0,025% (v/v) Tween-20 и

восстанавливающих агентов и немедленно

0,15 М NaCl, в течение ночи. После этого мем-

помещали на лед для остановки реакции. Пе-

брану разрезали на полоски (в направлении

ред проведением электрофореза (нанесением

вдоль дорожек геля), и каждую полоску обра-

проб в карманы геля) их прогревали 5 мин

батывали отдельно сыворотками от разных

при 95 °С. Изображения ПААГ, окрашенных

лошадей (все в одинаковом разведении 1 : 100

Кумасси R250, обрабатывали в программе

в том же буфере) при комнатной температуре

GelAnalyzer 19.1. Плотность (интенсивность в

(25 °С) в течение 1 ч. Затем полоски промы-

пикселях), соответствующую каждой белковой

вали и обрабатывали вторичными антителами

зоне, делили на плотность (интенсивность)

кролика к IgG лошади (разведение 1 : 1000),

зоны, соответствующей IdeZ, присутствующей

конъюгированными с пероксидазой хрена

во всех образцах в одинаковом количестве в

(«ИМТЕК», Россия) в течение 1 ч, после чего

качестве стандарта.

проводили пероксидазную реакцию с субстра-

тами - диаминобензидином и перекисью во-

дорода.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При постановке твёрдофазного иммуно-

ферментного анализа (ИФА) использовали

Конструкция плазмиды, кодирующей эндо-

иммунологические планшеты («Costar», США).

пептидазу IdeS. Получена плазмида, содержа-

Все операции проводили в стандартных усло-

щая нуклеотидную последовательность гена,

виях постановки ИФА, кроме одной допол-

кодирующего белок IdeS S. pyogenes c 6His в

нительной - предварительной термоинакти-

N-концевой области. Аминокислотная после-

вации IdeZ. Для этого перед сорбцией на

довательность кодируемого плазмидой белка

иммунологический планшет раствор IdeZ про-

IdeS с 6His-tag на N-конце (5-10 a.о.) приведе-

гревали 15 мин при 60 °С. Сорбцию IdeZ из рас-

на в табл. 1.

твора в концентрации 5 или 10 мкг/мл в 0,1 М

Расчётная молекулярная масса реком-

карбонат-бикарбонатном буфере (рН 9,5) на

бинантного белка составляет 37,01 кДа, рас-

иммунологический планшет проводили в те-

чётный коэффициент молярной экстинкции

чение ночи при 4 °С (или 1 ч при комнатной

ε_molar(M^-1·см^-1) равен

370, предсказанное

температуре).

поглощение при 280 нм раствора с концентра-

Места неспецифической сорбции блоки-

цией 1 мг/мл равно 1,42. На основе этого ко-

ровали раствором (1 мг/мл) бычьего сыворо-

эффициента проводили оценку концентрации

точного альбумина (Albumin bovine RIA grade,

очищенного белка в растворе.

«Sigma», США) в

10 мМ K/Na-фосфатно-

Конструкция плазмиды, кодирующей эндо-

солевого буферного раствора, содержащего

пептидазу IdeZ. Получена плазмида, содержащая

0,137 М NaCl и 0,027 М KCl, (pH7,5), с добав-

нуклеотидную последовательность гена, коди-

лением 0,1% (v/v) Tween-20. В том же растворе

рующего белок IdeZ S. equi subsp. zooepidemicus

готовили разведения лошадиных сывороток,

c 6His в N-концевой области. Плазмида коди-

начиная от 1 : 250 или 1 : 500, исходя из раз-

рует белок с аминокислотной последовательно-

личий в интенсивности окраски зоны при им-

стью, приведённой в табл. 1: 6His-tag (5-10 a.о.)

муноблоттинге, с шагом 1/2 - 1 : 500, 1 : 1000,

и IdeZ (13-327 a.о.).

1 : 2000, 1 : 4000, 1 : 8000, 1 : 16 000, 1 : 32 000.

Расчётная молекулярная масса белка 6His-

В качестве вторичных антител использовали

IdeZ cоставляет 36,87 кДа, расчётный коэффи-

те же антитела кролика к IgG лошади, конъю-

циент экстинкции ε_molar(M^-1 · см^-1) равен 52 370,

гированные с пероксидазой хрена, что и в слу-

предсказанное поглощение раствора с кон-

чае иммуноблоттинга, в разведении 1 : 5000.

центрацией 1 мг/мл составляет 1,42. На основе

Для построения кривых титрования исполь-

этого коэффициента проводили оценку кон-

зовали онлайн-программу Arigo (https://www.

центрации очищенного белка в растворе.

arigobio.com/elisa-analysis), с её же помощью

Сравнение онлайн-программами BLAST

находили характеристики кривых титрования,

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=

т.е. титры сывороток.

Proteins&PROGRAM=blastp&BLAST_PROG

При исследовании кинетики гидролиза

RAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&

IgG человека эндопептидазой IdeZ реакцион-

BLAST_SPEC=blast2seq) и Needle (https://www.

ную смесь инкубировали при 37 °С в течение

ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/) аминокис-

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

904

БОКША и др.

Таблица 1. Последовательности рекомбинантных белков IdeS и IdeZ

Белок

Аминокислотные последовательности 5′-3′

MRGSHHHHHHGSDSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPAKFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITK

TFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKEKIEAYLKKHPDKQKIMFGDQELLDVRKVINTKGDQTN

IdeS

SELFNYFRDKAFPGLSARRIGVMPDLVLDMFINGYYLNVYKTQTTDVNRTYQEKDRRGGIFDAVFTRG

DQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVT

DSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTNKIL

MRGSHHHHHHGSDDYQRNAAEVYAKEVPHQITSVWTKGVTPLTPEQFRYNNEDVIHAPYLAHQGWY

DITKVFDGKDNLLCGAATAGNMLHWWFDQNKTEIEAYLSKHPEKQKIIFNNQELFDLKAAIDTKDSQ

IdeZ

TNSQLFNYFRDKAFPNLSARQLGVMPDLVLDMFINGYYLNVFKTQSTDVNRPYQDKDKRGGIFDAVF

TRGDQTTLLTARHDLKNKGLNDISTIIKQELTEGRALALSHTYANVSISHVINLWGADFNAEGNLEAIY

VTDSDANASIGMKKYFVGINAHGHVAISAKKIEGENIGAQVLGLFTLSSGKDIWQKLS

лотных последовательностей рекомбинантных

Полученные образцы IdeS и IdeZ диализо-

IdeS и IdeZ показало, что степень идентично-

вали против 50 мМ Tris-HCl (рН 7,5).

сти составляет 74% (BLAST) и 72,4% (Needle),

Концентрации очищенных IdeS и IdeZ опре-

а степень сходства (гомология) составляет

деляли спектрофотометрически по светопогло-

86% (BLAST) и 85,8% (Needle).

щению при 280 нм с учётом расчётных коэф-

Выделение и очистку рекомбинантных бел-

фициентов экстинкции, приведённых выше.

ков IdeS и IdeZ проводили в одинаковых усло-

Выход очищенного белка составил 7,95 мг -

виях, при этом в случае IdeS брали 900 мг био-

для IdeS из 900 мг биомассы продуцента и

массы продуцента IdeS, а в случае IdeZ брали

10,6 мг - для IdeZ из 525 мг биомассы проду-

525 мг биомассы продуцента IdeZ.

цента.

В случае IdeS биомассы брали исходно

Активность IdeS и IdeZ в отношении IgG

больше, чем в случае IdeZ, поскольку после

человека (см. «Материалы и методы») иссле-

разделения суспензии разрушенных клеток

довали в одинаковых условиях. В случае IdeS

центрифугированием на «супернатант» и «оса-

готовили инкубационные смеси в трёх раз-

док» в «супернатанте», который использова-

ных соотношениях фермента и субстрата,

ли далее для очистки целевых белков (IdeS и

для чего к 20 мкл IgG (1 мг/мл) добавля-

IdeZ), оказалась меньшая доля целевого бел-

ли 20 мкл IdeS в различных концентрациях:

ка (IdeS), чем в случае IdeZ, где целевой белок

0,085 мг/мл (смесь 1), 0,17 мг/мл (смесь 2),

распределился поровну между

«осадком» и

0,85 мг/мл (смесь 3). Инкубация продолжалась

«супернатантом» (данные электрофоретиче-

1 ч при 37 °С. Останавливали реакцию добав-

ских исследований не приведены).

лением равного объёма 2-кратного буферного

Биомассу в обоих случаях разрушали в

раствора для образцов по Лэммли с восстанав-

5 мл «лизирующего буфера» (состав см. в раз-

ливающим агентом ДТТ и инкубацией в тече-

деле «Материалы и методы»).

ние 4 мин при 95 °С.

Поскольку генетические конструкции IdeS

На рис. 3, а Приложения приведена кар-

и IdeZ были спланированы так, что рекомби-

тина электрофореза продуктов реакции сме-

нантные белки содержали 6His-tag, их аффин-

сей 1-3. Видно, что в случаях реакционных

ная хроматография на Ni-сорбенте позволила

смесей (1) и (2) произошёл частичный гидро-

практически за один этап получить гомоген-

лиз IgG, а в случае смеси (3), в которой соот-

ные препараты белков. Хроматографический

ношение концентраций субстрата IgG челове-

профиль в случае очистки IdeZ колоночной

ка и фермента IdeS составило ≈ 1,17 : 1, реакция

хроматографией, которая проводилась со ско-

протеолиза в данных условиях инкубации про-

ростью протока

0,4 мл/мин, приведён на

шла практически полностью.

рис. 2 Приложения.

В случае IdeZ готовили инкубацион-

В случае очистки IdeS была получена ана-

ные смеси в четырёх разных соотношениях

логичная картина хроматографической элю-

фермента и субстрата, для чего к 50 мкл IgG

ции (не приведена).

(1 мкг/мкл) добавляли 20 мкл IdeZ в различ-

На рис. 1, б Приложения показана картина

ных концентрациях: 0,55 мкг/мкл (смесь 1),

электрофоретического разделения в ПААГ ис-

0,055 мкг/мкл (смесь 2), 0,011 мкг/мкл (смесь 3)

ходного «супернатанта» и фракций белка IdeZ,

и 0,006 мкг/мкл (смесь 4).

не связавшегося с сорбентом, а также элюатов

Инкубацию смесей проводили в течение

с колонки WorkBeads 40Ni.

1 ч при 37 °С. Останавливали реакцию добав-

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

ЭНДОПЕПТИДАЗЫ IdeS И IdeZ

905

лением равного объёма

2-кратного буфер-

целям обнаружения специфичных к IdeZ ан-

ного раствора для образцов по Лэммли с

тител в крови лошадей и определения титров

восстанавливающим агентом ДТТ и нагре-

антител.

вом 4 мин при 95 °С. Картина электрофореза

Иммуноблоттинг позволил, во-первых, убе-

белковых продуктов реакции приведена на

диться в том, что антитела присутствуют в

рис. 3, б Приложения. Видно, что в смесях

крови обследованных лошадей и качественно

(2)-(4) произошёл частичный гидролиз IgG,

сравнить их титры в сыворотках. При оди-

и только при наиболее высокой концентрации

наковом разведении сывороток

(1 : 100) во

IdeZ - в случае смеси (1), в которой соотноше-

всех

18 случаях наблюдалось окрашивание

ние концентраций субстрата IgG и фермента

зоны IdeZ, но интенсивность окрашивания

IdeZ составило 4,5 : 1, в данных условиях ин-

белковых зон качественно различалась, следо-

кубации гидролиз IgG произошёл практиче-

вательно, титры сывороток были различными.

ски полностью.

Во-вторых, иммуноблоттинг позволил убе-

Исследована кинетика гидролиза IgG чело-

диться в том, что при обработке IdeZ нагре-

века эндопептидазой IdeZ в растворе. Концен-

ванием в течение 4 мин при 95 °С в буферном

трации IgG и IdeZ в реакционной среде соста-

растворе для образцов по Лэммли при элек-

вили 0,87 мг/мл и 0,26 мг/мл соответственно.

трофорезе в ПААГ ферментативная актив-

На рис. 4 Приложения приведено фото

ность IdeZ полностью подавляется, но такая

электрофоретического разделения в 10%-ном

обработка не мешает взаимодействию анти-

ПААГ, в карманы геля наносили пробы, ото-

гена (IdeZ) с антителами в сыворотке крови

бранные из реакционной смеси IgG и IdeZ,

лошадей и проведению иммуноблоттинга в

инкубированной в течение 0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 15,

стандартных условиях с первичными и вто-

30, 45, 60, 90 и 120 мин при температуре 37 °С.

ричными антителами (иммуноглобулинами

Все пробы обрабатывали буферным раствором

класса IgG, которые расщепляются актив-

для образцов без восстанавливающего агента.

ной IdeZ). Пример окрашивания (фотография

На дорожке 1 - IgG без IdeZ (контроль).

полосок нитроцеллюлозной мембраны) после

Как показано на рис. 4 Приложения, в

иммуноблоттинга приведён на рис. 5, а При-

первые

5-10 мин нарастание образования

ложения.

продукта (интенсивность нижней зоны) и ис-

Разработка твёрдофазного ИФА с исполь-

чезновение самой верхней зоны (нерасщеп-

зованием рекомбинантной IdeZ. В разработке

лённые молекулы IgG) происходят с большой

твёрдофазного ИФА с целью определения на-

скоростью, тогда как окончательное расщеп-

личия антител к IdeZ в лошадиных сыворот-

ление тяжёлых цепей молекул scIgG (вторая

ках существенный момент и узкое место - это

сверху зона) происходит лишь за последую-

наличие деградирующей IgG ферментативной

щие 1-2 ч.

активности IdeZ. Проведение ИФА с не инак-

Параллельно из той же реакционной сме-

тивированной заранее IdeZ оказалось невоз-

си отбирали пробы и смешивали их с буфер-

можным из-за расщепления ею иммуноглобу-

ным раствором для образцов с восстановите-

линов, использованных для анализа (данные

лем ДТТ, подвергали электрофорезу в 10%-ном

не приведены). Поскольку было установлено,

ПААГ, количественно обрабатывали изобра-

что при иммуноблоттинге IdeZ сохраняет ан-

жение, и при этом кинетика убыли тяжёлых

тигенные свойства, будучи термически обра-

цепей во времени была такого же характера,

ботанной 4 мин при 95 °С в буферном растворе

как представлено на рис. 4 Приложения с про-

для образцов по Лэммли, для твёрдофазного

бами, обработанными без ДТТ, и после 1 ч ин-

ИФА тоже была проведена термоинактива-

кубации тяжёлые цепи в геле практически не

ция IdeZ. В данном случае обработка 15 мин

обнаруживались (данные не приведены).

при 60 °С раствора IdeZ в 0,1 М карбонат-би-

Выделенные и очищенные IdeZ и IdeS

карбонатном буфере (рН 9,5) оказалась доста-

хранили в

50%-ном растворе глицерина в

точной для полной потери активности IdeZ с

50 мМ Tris-HCl (рН 7,5) при -20 °С. За 3 меся-

сохранением её антигенных свойств, и при

ца хранения снижение активности составило

этом белок IdeZ оставался в растворённом со-

не более 5%.

стоянии в этом буфере.

Иммуноблоттинг с рекомбинантной IdeZ

Пример кривой титрования для образца

и сыворотками крови лошадей. Иммуноблот-

сыворотки № 3 приведён на рис. 5, б Прило-

тинг с очищенным белком IdeZ в качестве

жения. Кривая построена программой Arigo

антигена был проведён с целью дальнейшего

онлайн, в которой также определены парамет-

подбора условий твёрдофазного ИФА. Оба

ры кривой: R² = 1,0; a = 1,593301; b = 1,105941;

анализа (иммуноблоттинг и ИФА) служили

c = 2599,286145; d = 0,066838.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

906

БОКША и др.

Таблица 2. Титры антител к IdeZ в сыворотках лошадей, переболевших и не болевших мытом

Информация о животных

Шифр

Титр

животного

(разведение сыворотки)

болели

не болели

№ 2

♂ 15 лет

1523

№ 3

♂ (Мерин), 16 лет

2599

№ 4

♀ 22 года

659

№ 5

♂ 10 лет

1270

№ 6

♂ (Мерин), 12 лет

1148

№ 7

♂ (Мерин), 7 лет

966

№ 8

♀, 13 лет

526

№ 9

♀, 10 лет

2253

♂, 2 года,

№ 10

8026

повышалась температура

♂ (Мерин), 4 года,

№ 11

1114

повышалась температура

№ 12

♀, 24 года

447

№ 13

♂, 8 лет

1852

№ 1A

♀, 2 года

634

№ 2A

♂ (Мерин), 12 лет

438

№ 3A

♀, 5 лет

536

№ 4A

♀, 1 год

1025

№ 5A

♀, 20 лет

803

№ 1

♂ (Мерин), 25 лет

Кривые титрования сывороток описыва-

вания, находились в диапазоне определения

ются формулой (1):

системы ИФА. У переболевших животных ти-

тры были выше, чем у не болевших, при этом у

a - d

y = d +

(1)

переболевших молодых лошадей титры оказа-

1 + (x ÷ c)^b

лись выше, чем у лошадей старше 20 лет.

где x - концентрация сыворотки; y - ответ

(оптическая плотность); a - теоретический

ответ при нулевой концентрации; b - коэффи-

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

циент наклона; c - точка перегиба (EC₅₀); d -

теоретический ответ при бесконечно большой

Полученные в нашей работе рекомбинант-

концентрации.

ные IdeS и IdeZ по свойствам и активности

Результаты определения титров антител к

сходны с описанными в литературе [9]. Кине-

IdeZ в сыворотках лошадей, переболевших и

тика расщепления IgG была описана ранее

не болевших мытом, приведены в табл. 2.

только для IdeS [9], а в нашей работе описана

Как видно по результатам, приведённым

кинетика расщепления IgG человека фер-

в табл. 2, титры сывороток практически всех

ментом IdeZ. Кинетика оказалась сходной:

лошадей, как болевших, так и не перенёсших

расщепление первой тяжёлой цепи в молеку-

зарегистрированного ветеринарами заболе-

ле IgG происходит быстро, в течение первых

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

ЭНДОПЕПТИДАЗЫ IdeS И IdeZ

907

минут инкубации, тогда как для полного рас-

анти-IdeS антитела могут увеличивать риск

щепления второй цепи требовалось 1-2 ч.

реакций, подобных гиперчувствительности.

Если рассматривать биотехнологическое

Фирма «Thermo Fisher Scientific» («Phadia»,

применение IdeS и IdeZ, то можно отметить,

Швеция) разработала специфическую тест-

что, по данным литературы, использование

систему in vitro (IdeS-ImmunoCAP) для коли-

гидролиза IdeS упрощает процедуру расши-

чественного определения анти-IdeS антител,

фровки аминокислотной последовательности

причём нижний порог чувствительности си-

моноклональных антител

[19]. Кроме того,

стемы в 7 раз ниже минимального уровня из-

из данных литературы известно, что расщеп-

меряемых в крови людей антител (2 мг/литр).

ление IdeZ иммуноглобулинов также было

Лица с уровнем антител >15 мг/литр, по дан-

успешно применено для облегчения иденти-

ным этой тест-системы, из клинических испы-

фикации белков с такой посттрансляционной

таний исключались.

модификацией, как O-GlcNAc [20]. Действи-

Логично было бы попытаться разработать

тельно, идентификация белков, имеющих мо-

системы экстракорпоральной гемокоррекции -

лекулярные массы в области 50 кДа и предва-

расщепления IgG крови вне тела больного -

рительно выделенных иммунопреципитацией

ферментами IdeS или IdeZ, иммобилизован-

с антителами, затруднена из-за близости их

ными на сорбентах. Данные нашей работы

молекулярной массы к массе полноразмерной

свидетельствуют о том, что расщепление

тяжёлой цепи иммуноглобулинов. Особенно

иммуноглобулинов происходит и в случае

затруднён масс-спектрометрический анализ

«иммобилизованной» IdeZ, т.е. связанной на

гликозилированных O-GlcNAc-белков, при-

поверхности лунки иммунологического план-

чём даже после электрофоретического разде-

шета. Сохранность ферментативной актив-

ления и вырезания белковых зон из геля ана-

ности в этом случае создала трудности в раз-

лиз сложен, поскольку иммуноглобулиновые

работке ИФА, которые удалось преодолеть

молекулы тоже гликозилированы, а области

посредством термоинактивации IdeZ. Мы так-

молекулярных масс (50 кДа) перекрываются с

же наблюдали проявление IgG-расщепляющей

тяжёлыми цепями иммуноглобулинов. Благо-

активности IdeZ, связанной с Workbeads 40Ni

даря

«укорачиванию» IdeZ тяжёлых цепей

за 6His-tag (данные не приведены). Всё это

иммуноглобулинов наложение и перекрытие

указывает на возможность применения сор-

с ними анализируемых белков в области моле-

бированных на носителе эндопептидаз IdeS

кулярной массы 50 кДа исключается.

или IdeZ для экстракорпоральной обработки

Другой важнейшей областью примене-

крови с целью частичного расщепления IgG.

ния протеолитических ферментов IdeS и IdeZ,

Применить сорбированную IdeS можно было

расщепляющих иммуноглобулины человека с

бы и для элиминации циркулирующих анти-

высокой специфичностью, является медици-

IdeS антител.

на [10]. Недавно было предложено применить

Продемонстрированная в нашей работе

IdeS (препарат «imlifidase») в лечении угрожа-

возможность получения больших количеств

ющих жизни гепарин-индуцированной тром-

рекомбинантных активных IdeS и IdeZ в си-

боцитопении (Heparin-induced thrombocytope-

стеме гетерологичной экспрессии в E. coli в бу-

nia, HIT) и сходных по механизму развития

дущем, возможно, позволит иммобилизовать

поствакцинальных осложнений после вакци-

эти ферменты и создать как аффинный сор-

нации от SARS-CoV-2: тромбоза и тромбоци-

бент для проведения гемосорбции и удаления

топении, связанных с наличием в крови

циркулирующих анти-IdeS антител из крови

пациентов антител к тромбоцитарному факто-

пациентов, так и обеспечить экстракорпораль-

ру 4 (PF-4) [21-23].

ное расщепление IgG.

Однако при внутривенном введении IdeS в

Другим подходом в преодолении про-

кровь в качестве терапевтического агента для

блем, возникающих при введении в кровь

удаления иммуноглобулинов

[24] возникает

пациентов IdeS, может быть использование

проблема наличия изначально циркулирую-

вместо неё IdeZ. Действительно, уже начала

щего пула антител к IdeS у тех пациентов, ко-

реализовываться идея использования IdeZ

торые ранее встречались со стрептококковой

на пути развития такого направления в меди-

инфекцией [25]. Действительно, известно, что

цине, как применение векторов рекомбинант-

большая доля взрослых людей в популяции об-

ных аденоассоциированных вирусов (AAV)

ладает сформировавшимся пулом антител IgG

для генной терапии редких заболеваний. Так,

к IdeS вследствие ранее перенесённой инфек-

в моделях на мышах и нечеловекообразных

ции S. pyogenes [26]. При введении в кровь IdeS

приматах (макаках), пассивно иммунизиро-

с терапевтической целью эти циркулирующие

ванных человеческой антисывороткой, уже

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

908

БОКША и др.

оценён потенциал IdeZ для элиминирования

лен в самостоятельный вид S. zooepidemicus,

ранее выработанных и циркулирующих ней-

являющийся эволюционным предшественни-

трализующих антител (Nab) против реком-

ком S. equi [33]. Несмотря на пересмотр клас-

бинантных AAV

[27]. Продемонстрирована

сификации, во многих современных публи-

способность рекомбинантной GST-IdeZ и ком-

кациях встречается старая классификация

мерческой IdeZ («New England Biolabs», США)

S. zooepidemicus как подвида - S. equi ssp. zoo-

расщеплять человеческие иммуноглобулины,

epidemicus. По данным молекулярно-генетиче-

циркулирующие в крови различных лабора-

ских исследований [33], S. equi является био-

торных животных, в том числе при введении

варом S. zooepidemicus, причём ограничение

им AAV в печень и сердце, и тем самым смяг-

только непарнокопытными спектра хозяев

чать побочное действие генной терапии [27].

S. equi возникло вследствие полной утраты

Также представляется обширным потен-

S. equi локусов CRISPR (clustered regularly inter-

циал применения IdeZ в ветеринарии и сани-

spaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-

тарной микробиологии. В нашей работе с

associated), наделяющих микроорганизмы «адап-

помощью рекомбинантной IdeZ впервые про-

тивной иммунной системой», или способно-

ведён Вестерн-блоттинг и ИФА-анализ анти-

стью сохранять устойчивость генома при за-

тел к IdeZ в крови лошадей. Обнаружено нали-

селении широкого спектра хозяев. По микро-

чие высоких титров антител к IdeZ у лошадей

биологической классификации, оба вида (S. zoo-

как переболевших мытом с явными симпто-

epidemicus и S. equi) относятся к группе C по

мами, так и не болевших, но встречавшихся с

Лэнсфилд (Lancefield). К настоящему времени

инфекцией и/или перенёсших заболевание в

стало широко известно и общепризнано, что

лёгкой форме, не зарегистрированной вете-

S. zooepidemicus является не только комменса-

ринарами как острое заболевание. Поскольку

лом, но и способен давать патогенные штам-

известно, что IdeZ синтезируют оба стрепто-

мы [33, 34], вызывающие, кроме заболеваний

кокка - S. equi и S. zooepidemicus, полученные

лошадей [35], также вспышки геморрагиче-

нами данные свидетельствует о том, что забо-

ской пневмонии собак в питомниках [36] и мас-

левание обследованных лошадей могло быть

тита жвачных - на фермах [37]. Источником

вызвано не только S. equi, но и S. zooepidemicus.

эпидемической вспышки могут быть бессим-

Этот факт настораживает, если учесть высо-

птомные носители, включая животных, но из-

кую активность IdeZ с IgG человека и широ-

вестны также случаи заражения и заболевания

кий спектр хозяев S. zooepidemicus, и указывает

людей [28-32, 38]. Описан случай массового

на необходимость подключения генетических

заражения людей, носивший характер эпиде-

тестов (ПЦР-анализов) для дифференциаль-

мии. Так, эпидемиологические исследования,

ной диагностики этих стрептококков в слу-

проведённые в Бразилии в начале этого века,

чае вспышек заболевания среди лошадей и

выявили многочисленные случаи фарингита

других животных. Действительно, спектр орга-

и гломерулонефрита, вызванные заражением

низмов-хозяев у S. zooepidemicus значительно

S. zooepidemicus при употреблении сыра, при-

шире, чем у S. equi - специфического воз-

готовленного из сырого молока от болеющих

будителя мыта лошадей, и включает чело-

маститом коров [39], что привело к госпита-

века

[28-30], хотя в конюшнях, где были

лизации около сотни человек и гибели троих

собраны образцы крови для нашего исследо-

из них.

вания, не было отмечено случаев заражения и

Что касается исследований распростра-

заболевания среди людей. Поскольку описаны

нённости микроорганизмов S. equi и S. zooepi-

случаи передачи патогенного S. zooepidemicus

demicus в популяции лошадей, то опубли-

людям [31, 32], было бы интересно в будущем

кована американская [35] и индийская [40]

проверить наличие антител к IdeZ в сыворотке

работы. Американские исследователи приме-

крови людей, контактировавших с заражённы-

няли иммунохимические подходы, а индий-

ми животными. Разработанная в нашем иссле-

ские исследователи использовали метод ПЦР

довании тест-система твёрдофазного ИФА мо-

с праймерами генов SeM и SodA для иденти-

жет пригодиться в будущем для отслеживания

фикации S. equi ssp. equi и S. equi ssp. zooepi-

эпизоотий, вызванных вирулентными штам-

demicus соответственно (индийскими иссле-

мами S. equi или S. zooepidemicus.

дователями дана старая классификация этих

Следует, видимо, также повысить внима-

стрептококков, как подвидов). Большинство

ние к S. zooepidemicus. Благодаря молекуляр-

изолятов стрептококков, выделенных в Ин-

но-генетическим исследованиям пересмотрена

дии от сотни больных мытом и здоровых

классификация этого стрептококка: ранее он

лошадей, классифицировано как S. equi ssp.

считался подвидом S. equi, но теперь выде-

zooepidemicus, наряду с которым встречался

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

ЭНДОПЕПТИДАЗЫ IdeS И IdeZ

909

также и S. equi ssp. equi. Таким образом, хотя

complex (MAC) - IdeZ - защищала от экспе-

и не был оценён уровень антител к антигенам

риментальной инфекции S. zooepidemicus [41].

стрептококков (в том числе к IdeZ) в сыворот-

Также описаны разработки субъединичных

ках обследованных лошадей, индийскими учё-

вакцин с протективными свойствами в отно-

ными была зарегистрирована высокая частота

шении инфекции S. equi ssp. equi и разрабо-

встречаемости у лошадей стрептококков, тео-

танных на основе нескольких расщепляющих

ретически способных продуцировать IdeZ.

иммуноглобулины эндопептидаз в качестве

Результаты нашей работы не противоречат

антигенов [28]. Кажется перспективным под-

данным американских и индийских учёных:

ход к разработке универсальной субъединич-

почти у всех обследованных лошадей мы обна-

ной вакцины, включающей антиген IdeZ,

ружили антитела к IdeZ. То, что у переболев-

синтезируемый обоими видами - S. equi и

ших молодых лошадей титры оказались выше,

S. zooepidemicus. В заключение отметим важ-

чем у лошадей старшего возраста, может сви-

ный факт: наличие высоких титров антител

детельствовать о снижении иммунного ответа

к IdeZ у лошадей, перенёсших стрептокок-

с возрастом животных. Так, в сыворотке од-

ковую инфекцию, служит основанием для

ной не болевшей мытом лошади (№ 1, мерин,

того, чтобы предположить, что субъединичная

25 лет) титр антител к IdeZ оказался, по срав-

вакцина, включающая IdeZ в качестве анти-

нению с другими лошадьми, аномально низ-

гена, может оказаться эффективной и, воз-

ким. Это, возможно, указывает на ослаблен-

можно, будет защищать от заболевания как

ный иммунитет старого животного, либо на

лошадей, подверженных инфекции и S. equi, и

отсутствие недавних контактов с патогенными

S. zooepidemicus, так и других животных, зара-

стрептококками, и, вероятно, стрептококковая

жающихся S. zooepidemicus.

инфекция для этой лошади представляет потен-

циальную опасность. Напротив, у одного моло-

Вклад авторов. В.Г. Лунин - концепция и

дого жеребца (2 года) наблюдался чрезвычайно

руководство работой; И.С. Бокша, М.С. Попо-

высокий титр антител, вышедший за верхний

нова, А.М. Лящук, З.М. Галушкина, Е.В. Устен-

предел диапазона нашей системы ИФА и сви-

ко - проведение экспериментов; Т.А. Дани-

детельствующий о сильной иммунной реакции.

лова, Н.Б. Поляков - обсуждение результатов

Относительно защиты от стрептококковой

исследования; И.С. Бокша, С.В. Константино-

инфекции можно, к сожалению, констатиро-

ва - написание текста; Т.А. Данилова - редак-

вать, что на сегодняшний день пока не удаётся

тирование текста статьи.

создать субъединичную вакцину, защищаю-

Благодарности. Авторы глубоко благодар-

щую от S. pyogenes, относящегося к группе А,

ны всем владельцам лошадей за предоставлен-

однако ведутся обнадёживающие разработки

ные образцы крови животных и информацию

по созданию вакцин против стрептококков

о них.

группы С. Известно, что животные, перебо-

Конфликт интересов. Авторы заявляют о том,

левшие инфекциями, вызванными как S. equi,

что не имеют никаких конфликтов интересов.

так и S. zooepidemicus, повторно не заражаются

Соблюдение этических норм. Настоящая

и вырабатывают устойчивый иммунитет, но

статья не содержит описания выполненных

известно и об отсутствии перекрёстной защит-

авторами исследований с участием людей или

ной реакции. Что касается опубликованных

использованием животных в качестве объ-

подходов к разработке субъединичных вак-

ектов. Образцы крови лошадей были взяты

цин против стрептококков группы С, то на

с соблюдением биоэтических норм в рамках

экспериментальной мышиной модели было

плановой оценки состояния здоровья домаш-

показано, что вакцинация с использованием

них животных и любезно предоставлены нам

IdeE или IdeE2 в качестве антигенов индуци-

для исследований ветеринарными врачами.

ровала защиту от экспериментальной инфек-

Дополнительные материалы. Приложение

ции S. equi ssp. equi [16], тогда как вакцина-

к статье опубликовано на сайте журнала «Био-

ция рекомбинантным белком membrane attack

химия» (https://biochemistrymoscow.com).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Collin, M. (2001) EndoS, a novel secreted protein

2. Allhorn, M., Olin, A. I., Nimmerjahn, F., and Collin,

from Streptococcus pyogenes with endoglycosidase

M. (2008) Human IgG/FcγR interactions are mod-

activity on human IgG, EMBO J., 20, 3046-3055,

ulated by streptococcal IgG glycan hydrolysis, PLoS

doi: 10.1093/emboj/20.12.3046.

One, 3, e1413, doi: 10.1371/journal.pone.0001413.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

910

БОКША и др.

Collin, M., Svensson, M. D., Sjöholm, A. G.,

Louie, S., Kang, A., Haas, M., Nast, C., Vo, A., and

Jensenius, J. C., Sjöbring, U., and Olsén, A. (2002)

Tufveson, G. (2017) IgG Endopeptidase in Highly

EndoS and SpeB from Streptococcus pyogenes in-

Sensitized Patients Undergoing Transplantation,

hibit immunoglobulin-mediated opsonophagocytosis,

N. Engl. J. Med.,

377,

442-453, doi:

10.1056/

Infect. Immun.,

70,

6646-6651, doi:

10.1128/IAI.

NEJMoa1612567.

70.12.6646-6651.2002.

13.

Yang, R., Otten, M. A., Hellmark, T., Collin, M.,

Wenig, K., Chatwell, L., von Pawel-Rammingen, U.,

Bjorck, L., Zhao, M.-H., Daha, M. R., and

Björck, L., Huber, R., and Sondermann, P. (2004)

Segelmark, M.

(2010) Successful treatment of

Structure of the streptococcal endopeptidase IdeS, a

experimental glomerulonephritis with IdeS and EndoS,

cysteine proteinase with strict specificity for IgG, Proc.

IgG-degrading streptococcal enzymes, Nephrol. Dial.

Natl. Acad. Ssi. USA, 101, 17371-17376, doi: 10.1073/

Transplant., 25, 2479-2486, doi: 10.1093/ndt/gfq115.

pnas.0407965101.

14.

Hansa Biopharma AB.

(2021) NCT number:

Von Pawel-Rammingen, U., Johansson, B. P.,

NCT02790437. In: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/

Tapper, H., and Björck, L.

(2002) Streptococcus

NCT02790437.

pyogenes and phagocytic killing, Nat. Med.,

15.

Holden, M. T. G., Heather, Z., Paillot, R., Steward,

1044-1045, doi: 10.1038/nm1002-1044.

K. F., Webb, K., Ainslie, F., Jourdan, T., Bason,

Von Pawel-Rammingen, U.

(2012) Streptococcal

N. C., Holroyd, N. E., Mungall, K., Quail, M. A.,

IdeS and its impact on immune response and inflam-

Sanders, M., Simmonds, M., Willey, D., Brooks, K.,

mation, J. Innate Immun., 4, 132-140, doi: 10.1159/

Aanensen, D. M., Spratt, B. G., Jolley, K. A.,

000332940.

Maiden, M. C., Kehoe, M., Chanter, N., Bentley,

Spoerry, Ch. (2017) Streptococcal immunoglobulin

S. D., Robinson, C., Maskell, D. J., Parkhill, J.,

degrading enzymes of the IdeS and IgdE family, Umeå

and Waller, A. S. (2009) Genomic evidence for the

University, Thesis for: PhD Advisor: von Pawel-Ram-

evolution of Streptococcus equi: host restriction,

mingen, Ulrich, Associate Prof., URL: https://www.

increased virulence, and genetic exchange with human

researchgate.net/publication/320078854_Streptococcal_

pathogens, PLoS Pathog., 5, e1000346, doi: 10.1371/

Immunoglobulin_degrading_Enzymes_of_the_IdeS_

journal.ppat.1000346.

and_IgdE_Family.

16.

Hulting, G., Flock, M., Frykberg, L., Lannergård, J.,

Ryan, M. H., Petrone, D., Nemeth, J. F.,

Flock, J.-I., and Guss, B. (2009) Two novel IgG

Barnathan, E., Björck, L., and Jordan, R. E.

endopeptidases of Streptococcus equi, FEMS Micro-

(2008) Proteolysis of purified IgGs by human and

biol. Lett.,

298,

44-50, doi:

10.1111/j.1574-6968.

bacterial enzymes in vitro and the detection of

2009.01698.x.

specific proteolytic fragments of endogenous IgG

17.

Lannergård, J., and Guss, B.

(2006) IdeE, an

in rheumatoid synovial fluid, Mol. Immunol., 45,

IgG-endopeptidase of Streptococcus equi ssp. equi,

1837-1846, doi: 10.1016/j.molimm.2007.10.043.

FEMS Microbiol. Lett., 262, 230-235, doi: 10.1111/

Vindebro, R., Spoerry, C., and von Pawel-

j.1574-6968.2006.00404.x.

Rammingen, U. (2013) Rapid IgG heavy chain cleav-

18.

Boksha, I. S., Lavrova, N. V., Grishin, A. V.,

age by the streptococcal IgG endopeptidase IdeS is

Demidenko, A. V., Lyashchuk, A. M., Galushkina,

mediated by IdeS monomers and is not due to en-

Z. M., Ovchinnikov, R. S., Umyarov, A. M., Avetisian,

zyme dimerization, FEBS Lett.,

587,

1818-1822,

L. R., Chernukha, M. Iu., Shaginian, I. A., Lunin,

doi: 10.1016/j.febslet.2013.04.039.

V. G., and Karyagina, A. S. (2016) Staphylococcus sim-

10.

Collin, M., and Björck, L. (2017) Toward clinical use

ulans recombinant lysostaphin: production, purifica-

of the IgG specific enzymes IdeS and EndoS against

tion, and determination of antistaphylococcal activi-

antibody-mediated diseases, Methods Mol. Biol., 1535,

ty, Biochemistry (Moscow), 81, 502-510, doi: 10.1134/

339-351, doi: 10.1007/978-1-4939-6673-8_23.

S0006297916050072.

11.

Winstedt, L., Järnum, S., Nordahl, E. A., Olsson, A.,

19.

An, Y., Zhang, Y., Mueller, H.-M., Shameem, M.,

Runström, A., Bockermann, R., Karlsson, C.,

and Chen, X. (2014) A new tool for monoclonal

Malmström, J., Palmgren, G. S., Malmqvist, U.,

antibody analysis, MAbs, 6, 879-893, doi: 10.4161/

Björck, L., and Kjellman, C. (2015) Complete removal

mabs.28762.

of extracellular IgG antibodies in a randomized dose-

20.

Machacek, M., Fields, P. E., and Slawson, C. (2020)

escalation phase I study with the bacterial enzyme

A proteolytic method for evaluating O-GlcNAcy-

IdeS - a novel therapeutic opportunity, PLoS One, 10,

lation on proteins of similar molecular weight

e0132011, doi: 10.1371/journal.pone.0132011.

to antibody heavy chain after immunoprecipita-

12.

Jordan, S. C., Lorant, T., Choi, J., Kjellman, C.,

tion, Anal. Biochem.,

611,

114001, doi:

10.1016/

Winstedt, L., Bengtsson, M., Zhang, X., Eich, T.,

j.ab.2020.114001.

Toyoda, M., Eriksson, B.-M., Ge, S., Peng, A.,

21.

Kizlik-Masson, C., Deveuve, Q., Zhou, Y., Vayne, C.,

Järnum, S., Wood, K. J., Lundgren, T., Wennberg, L.,

Thibault, G., McKenzie, S. E., Pouplard, C., Loyau, S.,

Bäckman, L., Larsson, E., Villicana, R., Kahwaji, J.,

Gruel, Y., and Rollin, J. (2019) Cleavage of anti-PF4/

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

ЭНДОПЕПТИДАЗЫ IdeS И IdeZ

911

heparin IgG by a bacterial protease and potential

31.

Downar, J., Willey, B. M., Sutherland, J. W.,

benefit in heparin-induced thrombocytopenia, Blood,

Mathew, K., and Low, D. E. (2001) Streptococcal

133, 2427-2435, doi: 10.1182/blood.2019000437.

meningitis resulting from contact with an infected

22.

Gruel, Y., Vayne, C., Rollin, J., and Pouplard, C.

horse, J. Clin. Microbiol., 39, 2358-2359, doi: 10.1128/

(2021) Reply to the letter entitled “Suggested treatment

JCM.39.6.2358-2359.2001.

of serious complications to Covid-19 vaccination

32.

Abbott, Y., Acke, E., Khan, S., Muldoon, E. G.,

with IdeS, a bacterial antibody-cleaving enzyme”,

Markey, B. K., Pinilla, M., Leonard, F. C., Steward, K.,

J. Thromb. Haemost., 19, 2632, doi: 10.1111/jth.15465.

and Waller, A. (2010) Zoonotic transmission of Strep-

23.

Kahn, F., Shannon, O., and Björck, L. (2021) Suggest-

tococcus equi subsp. zooepidemicus from a dog to a

ed treatment of serious complications to COVID-19

handler, J. Med. Microbiol., 59, 120-123, doi: 10.1099/

vaccination with IdeS, a bacterial antibody-cleaving

jmm.0.012930-0.

enzyme, J. Thromb. Haemost.,

19,

2363-2364,

33.

Waller, A. S., and Robinson, C. (2013) Streptococcus

doi: 10.1111/jth.15433.

zooepidemicus and Streptococcus equi evolution: the

24.

Lonze, B. E., Tatapudi, V. S., Weldon, E. P.,

role of CRISPRs, Biochem. Soc. Trans., 41, 1437-

Min, E. S., Ali, N. M., Deterville, C. L., Gelb, B. E.,

1443, doi: 10.1042/BST20130165.

Benstein, J. A., Dagher, N. N., Wu, M., and Mont-

34.

Björnsdóttir, S., Holden, M. T. G., Svansson, V.,

gomery, R. A. (2018) IdeS (Imlifidase): A novel agent

Harris, S. R., Webb, K., Robinson, C., Steward, K. F.,

that cleaves human igg and permits successful kidney

Wright, N., Paillot, R., Newton, J. R., Gunnarsson, E.,

transplantation across high-strength donor-specific

and Waller, A. S. (2012) Streptococcus zooepidemicus:

antibody, Ann. Surg., 268, 488-496, doi: 10.1097/

more than just an opportunist? J. Equine Vet. Sci., 32,

SLA.0000000000002924.

S8, doi: 10.1016/j.jevs.2012.08.024.

25.

Runström, A., Järnum, S., Jordan, S., Winstedt, L.,

35.

De Negri, R. (2013) Equine Serum Antibody Responses

and Kjellman, C. (2018) Antibodies in IVIg and its

to Streptococcus Equi and Streptococcus Zooepidemicus,

effect on IdeS activity, American Transplant. Congr.,

Theses and Dissertations - Veterinary Science, 13,

A156, URL: https://atcmeetingabstracts.com/abstract/

University of Kentucky, URL: https://uknowledge.

anti-ides-antibodies-in-ivig-and-its-effect-on-ides-

uky.edu/gluck_etds/13.

activity/.

36.

Priestnall, S., and Erles, K.

(2011) Streptococcus

26.

Åkesson, P., Rasmussen, M., Mascini, E., von Pawel-

zooepidemicus: An emerging canine pathogen, Vet. J.,

Rammingen, U., Janulczyk, R., Collin, M., Olsen, A.,

188, 142-148, doi: 10.1016/j.tvjl.2010.04.028.

Mattsson, E., Olsson, M. L., Bjorck, L., and

37.

Pisoni, G., Zadoks, R. N., Vimercati, C., Locatelli, C.,

Christensson, B. (2004) Low antibody levels against

Zanoni, M. G., and Moroni, P. (2009) Epidemiologi-

cell wall-attached proteins of Streptococcus pyogenes

cal investigation of Streptococcus equi subspecies zooepi-

predispose for severe invasive disease, J. Infect. Dis.,

demicus involved in clinical mastitis in dairy goats,

189, 797-804, doi: 10.1086/381982.

J. Dairy Sci., 92, 943-951, doi: 10.3168/jds.2008-1548.

27.

Elmore, Z. C., Oh, D. K., Simon, K. E., Fanous,

38.

Pelkonen, S., Lindahl, S. B., Suomala, P., Karhukorpi, J.,

M. M., and Asokan, A. (2020) Rescuing AAV gene

Vuorinen, S., Koivula, I., Väisänen, T., Pentikäinen, J.,

transfer from neutralizing antibodies with an IgG-de-

Autio, T., and Tuuminen, T. (2013) Transmission of

grading enzyme, JCI Insight, 5, e139881, doi: 10.1172/

Streptococcus equi subspecies zooepidemicus infection

jci.insight.139881.

from horses to humans, Emerg. Infect. Dis., 19, 1041-

28.

Robinson, C., Frykberg, L., Flock, M., Guss, B.,

1048, doi: 10.3201/eid1907.121365.

Waller, A. S., and Flock, J.-I. (2018) Strangvac: a

39.

Baiter, S., Benin, A., Pinto, S. W. L., Teixeira, L. M.,

recombinant fusion protein vaccine that protects

Alvim, G. G., Luna, E., Jackson, D., LaClaire, L.,

against strangles, caused by Streptococcus equi, Vaccine,

Elliott, J., Facklam, R., and Schuchat, A.

(2000)

36, 1484-1490, doi: 10.1016/j.vaccine.2018.01.030.

Epidemic nephritis in Nova Serrana, Brazil, Lancet,

29.

Hashikawa, S., Iinuma, Y., Furushita, M., Ohkura, T.,

355, 1776-1780, doi: 10.1016/S0140-6736(00)02265-0.

Nada, T., Torii, K., Hasegawa, T., and Ohta, M.

40.

Javed, R., Taku, A. K., Gangil, R., and Sharma, R. K.

(2004) Characterization of group C and G streptococ-

(2016) Molecular characterization of virulence genes

cal strains that cause streptococcal toxic shock syn-

of Streptococcus equi subsp. equi and Streptococcus

drome, J. Clin. Microbiol., 42, 186-192, doi: 10.1128/

equi subsp. zooepidemicus in equines, Vet. World, 9,

JCM.42.1.186-192.2004.

875-881, doi: 10.14202/vetworld.2016.875-881.

30.

Bradley, S. F., Gordon, J. J., Baumgartner, D. D.,

41.

Velineni, S., and Timoney, J. F. (2013) Identification

Marasco, W. A., and Kauffman, C. A. (1991) Group C

of novel immunoreactive proteins of Streptococcus

streptococcal bacteremia: analysis of

88 cases,

zooepidemicus with potential as vaccine compo-

Clin. Infect. Diseases,

13,

270-280, doi:

10.1093/

nents, Vaccine, 31, 4129-4135, doi: 10.1016/j.vaccine.

clinids/13.2.270.

2013.06.100.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

912

БОКША и др.

RECOMBINANT ENDOPEPTIDASES IdeS AND IdeZ

AND THEIR POTENTIAL APPLICATIONS

I. S. Boksha^1,2*, V. G. Lunin¹, T. A. Danilova¹, M. S. Poponova¹, N. B. Polyakov¹,

A. M. Lyashchuk¹, S. V. Konstantinova¹, Z. M. Galushkina¹, and E. V. Ustenko¹

¹ The National Research Center for Epidemiology and Microbiology

named after Honorary Academician N. F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation,

123098 Moscow, Russia; e-mail: boksha_irina@mail.ru

² Mental Health Research Centre, 115522 Moscow, Russia

IdeS and IdeZ endopeptidases are streptococcal virulence factors that specifically cleave IgG heavy chains

and represent an interest from biotechnological, medical, and veterinary points of view. The genes encoding

IdeS and IdeZ endopeptidases (the ideS gene was cloned from a Streptococcus pyogenes collection strain,

and S. zooepidemicus ideZ gene was synthesized) were cloned and expressed in Escherichia coli heterolo-

gous expression system, and 6His-tag affinity domain was introduced into the amino acid sequence of

each endopeptidase. IdeS and IdeZ enzymes were isolated and purified by metal affinity chromatography.

The resulting IdeS and IdeZ are apparently homogeneous on polyacrylamide gel electrophoresis and are

active against human and animal IgG. The specificity of human IgG cleavage by endopeptidases IdeS and

IdeZ was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis. Application of recombinant IdeZ was demon-

strated for immunological analysis of equine “strangles” (diagnostics and specific antibodies’ titer deter-

mination in the blood). Thus, IdeZ can be used in veterinary medicine and sanitary microbiology for the

diagnosis of infections caused by S. equi and S. zooepidemicus in addition to their applications in medicine

and biotechnology.

Keywords: recombinant endopeptidases, IdeS, IdeZ, IgG cleavage, strangles, enzyme linked immunosorbent assay

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023