БИОХИМИЯ, 2023, том 88, вып. 6, с. 962 - 972

УДК 547.857.7; 576.32/.36; 577.152.2

ПРИРОДНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ГУАНИНА ОКАЗЫВАЮТ

PARP-ИНГИБИТОРНОЕ И ЦИТОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ

НА МОДЕЛИ ПОВРЕЖДЕНИЯ КАРДИОМИОЦИТОВ

ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

А.С. Ефремова⁴, М.С. Смирновская⁵, В.Н. Сильников³, В.К. Швядас^2,6, Д.К. Нилов²*

¹ Институт молекулярной генетики

Национального исследовательского центра «Курчатовский институт»,

123182 Москва, Россия; электронная почта: shram-si.img@yandex.ru

² Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского,

119992 Москва, Россия; электронная почта: nilovdm@gmail.com

³ Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН,

630090 Новосибирск, Россия

⁴ Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова, 115522 Москва, Россия

⁵ Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

химический факультет, 119991 Москва, Россия

⁶ Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова,

факультет биоинженерии и биоинформатики, 119234 Москва, Россия

Поступила в редакцию 13.12.2022

После доработки 27.03.2023

Принята к публикации 27.03.2023

Ингибиторы поли(ADP-рибозо)полимеразы (PARP) человека рассматриваются в качестве пер-

спективных агентов для лечения сердечно-сосудистых, неврологических и других заболеваний, со-

провождающихся воспалением и окислительным стрессом. Ранее была продемонстрирована спо-

собность природных соединений 7-метилгуанина (7mGua) и 8-гидрокси-7-метилгуанина (8h7mGua)

подавлять активность рекомбинантного белка PARP. В представленной работе мы исследовали

возможность PARP-ингибиторного и цитопротекторного действия 7mGua и 8h7mGua в отноше-

нии культур недифференцированных и дифференцированных кардиомиобластов крысы Н9с2.

Установлено, что 7mGua и 8h7mGua быстро проникают в клетки и эффективно подавляют сти-

мулированную H2O2 активацию PARP (IC50 = 270 и 55 мкМ соответственно). Выраженное цито-

протекторное действие 7mGua и 8h7mGua показано на клеточной модели окислительного стресса,

причём 8h7mGua превзошёл по эффективности классический ингибитор PARP 3-аминобензамид.

Полученные данные свидетельствуют о перспективности разработки ингибиторов PARP на основе

производных гуанина и их тестирования в отношении моделей ишемия-реперфузионного повреж-

дения тканей.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: 7-метилгуанин, 8-гидрокси-7-метилгуанин, поли(ADP-рибозо)полимераза, инги-

битор, кардиомиоциты, окислительный стресс, цитопротекторное действие.

DOI: 10.31857/S0320972523060064, EDN: EFCJHN

ВВЕДЕНИЕ

крови и моче человека [1-6]. 7mGua образу-

ется при деградации ДНК и матричной РНК,

Природные соединения

7-метилгуанин

8h7mGua является продуктом окисления

(7mGua) и 8-гидрокси-7-метилгуанин (8h7mGua,

7mGua [7-10]. Ранее мы показали, что данные

рис. 1) являются метаболитами нуклеиновых

метаболиты ингибируют фермент поли(ADP-

кислот и в малом количестве обнаружены в рибозо)полимеразу (PARP), взаимодействуя

Принятые сокращения: 3-AB - 3-аминобензамид; 7mGua - 7-метилгуанин; 8h7mGua - 8-гидрокси-7-метилгуанин;

PAR - поли(ADP-рибоза); PARP - поли(ADP-рибозо)полимераза.

* Адресат для корреспонденции.

962

PARP-ИНГИБИТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ГУАНИНА

963

с остатками глицина и тирозина на участке

низма [30-34]. Патогенез этих заболеваний,

связывания субстрата NAD⁺. Ингибиторная

как правило, связан с развитием острого или

способность была продемонстрирована в раз-

хронического окислительного стресса и вос-

личных экспериментах с очищенным реком-

паления. На различных моделях in vivo про-

бинантным ферментом, а также с помощью

демонстрировано терапевтическое действие

молекулярного моделирования [11-14].

ингибиторов PARP при ишемия-реперфузи-

PARP активируется при воздействии на

онном повреждении тканей, при осложнениях

клетку стрессовых факторов, вызывающих

сахарного диабета, травмах головного мозга,

повреждение ДНК, и осуществляет синтез

артритах, воспалительных заболеваниях ки-

отрицательно заряженной поли(ADP-рибо-

шечника и септическом шоке [35-37].

зы) (PAR), выполняющей сигнальные функ-

Широкое использование синтетических

ции [15-19]. PARP играет важную роль в под-

ингибиторов PARP затруднено ввиду вызывае-

держании стабильности генома и регуляции

мых ими серьёзных побочных эффектов [38-

экспрессии генов, однако её повышенная ак-

40], поэтому в данном контексте значительный

тивность может иметь негативные послед-

интерес могут представлять природные соеди-

ствия [20-22]. Так, при ишемии/реперфузии

нения, такие как 7mGua и 8h7mGua. В част-

тканей наблюдается массированное повреж-

ности, проведённое нами токсикологическое

дение ДНК, сопровождающееся сверхактива-

исследование 7mGua продемонстрировало его

цией PARP. Это приводит к резкому падению

безопасность при пероральном введении мы-

уровня NAD⁺ и ATP, индукции экспрессии

шам в дозе 50 мг/кг, а также отсутствие кан-

провоспалительных генов и запуску механиз-

церогенного действия в ряде доклинических

мов клеточной гибели [23-26].

тестов [41]. В представленной работе впервые

Синтетические ингибиторы PARP ола-

изучены PARP-ингибиторные и цитопротек-

париб, рукапариб и нирапариб применяются

торные свойства природных пуринов 7mGua

для подавления репарации ДНК в терапии

и 8h7mGua на клеточной модели повреждения

онкологических заболеваний [27-29], однако

кардиомиоцитов.

область возможного применения ингибито-

ров PARP гораздо шире. Известно, что PARP

вовлечена в механизмы клеточной гибели при

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

заболеваниях сердечно-сосудистой, нервной,

иммунной, дыхательной и других систем орга-

В работе использовали ингибиторы PARP

3-аминобензамид (3-AB) и 7mGua, приобре-

тённые в компании «Sigma-Aldrich» (США),

а также 8h7mGua, который синтезировали по

описанной ранее методике [13]. Также исполь-

зовали среды и реагенты для культивирования

клеток («ПанЭко», Россия), эмбриональную сы-

воротку телёнка («HyClone», США), трансрети-

ноевую кислоту («ICN», США), флуоресцен-

тные красители Хёхст 33258 («Sigma-Aldrich»),

Кальцеин АМ и Гомодимер этидия III («Bio-

tium», США). Кардиомиобласты эмбриона

крысы Н9с2 были получены из коллекции кле-

точных культур ATCC («LGC Standards», Вели-

кобритания).

Клетки Н9с2 культивировали в среде

DMEM, содержащей эмбриональную сыворот-

ку телёнка (10%, v/v), L-глутамин (2 мМ) и

смесь антибиотиков пенициллин/стрептоми-

цин, при 37 °С в атмосфере 5% СО₂. При про-

ведении исследований на недифференцирован-

ных кардиомиобластах культуры растили в тече-

ние 24-48 ч в среде с 10% сыворотки. В экс-

периментах с дифференцированными клетками

культуры растили 48 ч в среде с 10% сыворотки,

а затем 72 ч в среде, содержащей 1% (v/v) сыво-

Рис. 1. Химические структуры природных пуринов 7mGua

и 8h7mGua

ротки и транс-ретиноевую кислоту (45 нг/мл),

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

964

ШРАМ и др.

для стимуляции дифференцировки в миоци-

Heart FX («Biotek», США) и конфокального

ты. Все эксперименты с клеточными культу-

микроскопа LSM 900 («Carl Zeiss», Германия).

рами проводили в 4- или 24-луночных пласти-

Статистическую обработку данных проводили

ковых планшетах («SPL», Республика Корея),

с использованием программного обеспече-

поверхность которых предварительно покры-

ния SigmaPlot («Systat Software Inc.», США) и

вали желатином.

Statistica («StatSoft Inc.», США).

Анализ степени ингибирования PARP ис-

следуемыми веществами в живых клетках про-

водили по описанной ранее методике [42].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки Н9с2 (недифференцированные или

дифференцированные) преинкубировали с

Эксперименты проводили на культурах как

исследуемым веществом в течение определён-

недифференцированных, так и дифференци-

ного времени в среде DMEM с 1% сыворотки,

рованных клеток - кардиомиобластов и кар-

затем вносили H₂O₂ до конечной концентра-

диомиоцитов крысы H9c2 (рис. 2). В процессе

ции 1 мМ, и через 5 или 10 мин клетки фик-

дифференцировки клеток H9c2 наблюдали об-

сировали охлаждённым до

0 °С метанолом.

разование многоядерных синцитий-подобных

Содержание PAR в клетках определяли им-

структур (рис. 2, г) и увеличение уровня ткане-

мунофлуоресцентным анализом с использо-

специфического маркерного белка тропони-

ванием первичных моноклональных анти-

на Т (рис. 2, е). Проведённые предварительные

тел к PAR (клон 10-H) («Santa Cruz Biotech.»,

исследования не выявили какого-либо влия-

США) и вторичных антител, конъюгирован-

ния длительной инкубации (120 ч) с 7mGua

ных с Alexa 488 («Abcam», Великобритания).

или 8h7mGua в концентрации 300 мкМ на мор-

Ядра клеток контрастировали Хёхстом 33258.

фологию и показатели жизнеспособности кле-

Для детектирования сердечного тропонина Т

ток (рис. S1, рис, S2, таблица S1 Приложения),

использовали антитела, конъюгированные с

что свидетельствует о низкой цитотоксичности

Alexa 555 («Хайтест», Россия).

данных соединений.

Для анализа цитопротекторного действия

Исследование на недифференцированных

веществ в условиях острого окислительного

клетках Н9с2 показало, что 7mGua и 8h7mGua

стресса клетки H9c2 (недифференцированные

подавляют активность PARP, но 8h7mGua обла-

или дифференцированные) преинкубировали

дает более выраженным действием, сопостави-

с тестируемым веществом в среде DMEM с 1%

мым с классическим ингибитором PARP 3-AB

сыворотки в течение 1 ч, затем вносили H₂O₂

(рис. 3). В концентрации 450 мкМ 8h7mGua

до конечной концентрации 1 мМ и помещали

практически полностью подавляет фермента-

в CO₂-инкубатор. Через 30 мин клетки отмы-

тивную активность, в то время как 7mGua -

вали от H₂O₂ и продолжали инкубировать в

примерно на 70% (рис. 3, в). Анализ дозовых

среде с тестируемым веществом ещё 24 ч, по-

зависимостей также демонстрирует более вы-

сле чего производили прижизненное окраши-

сокую эффективность 8h7mGua в сравнении

вание клеток Гомодимером этидия III, Каль-

с 7mGua: расчётные значения IC50 для этих

цеином АМ и Хёхстом 33258.

соединений оказались равными 55 и 270 мкМ

Во всех экспериментах получали и анали-

соответственно (рис. 3, г). Полученные данные

зировали образцы из 3-5 независимо выра-

хорошо согласуются с результатами экспери-

щенных культур. При определении остаточной

ментов с рекомбинантной PARP человека [13],

активности PARP анализировали 400-800 ядер

в которых 7mGua и 8h7mGua проявляли инги-

в 4-5 случайно выбранных полях лунки план-

биторное действие в диапазоне концентраций

шета (объектив 4×), а при определении плот-

10^-5-10^-4 М, и значения IC₅₀ для 8h7mGua были

ности культуры и конфлюентности - от 40

в среднем в 4 раза ниже значений для 7mGua.

до 80% общей площади лунки (объектив 2,5×).

В аналогичном исследовании на диффе-

При проведении попарного сравнения ис-

ренцированных клетках H9c2 показано, что

пользовали t-критерий Стьюдента, а в случае

эффективность PARP-ингибиторного действия

множественного сравнения - однофакторный

8h7mGua близка к наблюдаемой с недиффе-

дисперсионный анализ ANOVA и апостериор-

ренцированными клетками: расчётное зна-

ный анализ Бонферрони. Полученные количе-

чение IC₅₀ оказалось равным 43 мкМ (рис. 4).

ственные данные представлены в виде «сред-

Можно предположить, что рассматриваемые

нее значение ± стандартное отклонение».

варианты фенотипа клеток Н9с2 существенно

Анализ интенсивности флуоресценции в

не отличаются как по внутриклеточной кон-

препаратах живых и фиксированных клеток

центрации NAD⁺, так и по проницаемости

проводили с использованием имиджера Lion-

плазматической мембраны для 8h7mGua.

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

PARP-ИНГИБИТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ГУАНИНА

965

Рис. 2. Изменение морфологии и экспрессии сердечного маркера при дифференцировке клеток H9c2. а-в - Культу-

ры недифференцированных клеток. г-е - Культуры дифференцированных клеток. а, г - Клетки после прижизнен-

ного окрашивания Кальцеином АМ (зелёный цвет). б, д - Морфология клеток при съёмке в режиме светлого поля.

в, е - Иммунофлуоресцентный анализ сердечного тропонина Т (красный цвет). Длина масштабной планки соответ-

ствует 250 мкм (а, г) или 50 мкм (б, в, д, е)

При сравнении 1- и 4-часовой преинкуба-

данные были получены и для классического

ции клеток Н9с2 с производными гуанина не

ингибитора PARP 3-AB (рис. 5, г).

было выявлено существенных различий в ин-

Для моделирования острого окислитель-

гибировании PARP (рис. 3, в). Однако при бо-

ного стресса культуры клеток Н9с2 подвергали

лее детальном исследовании было обнаружено

30-минутной инкубации в среде с Н₂О₂ (1 мМ)

наличие чёткой и хорошо воспроизводимой

и через 24 ч оценивали показатели, характери-

зависимости степени ингибирования PARP от

зующие степень повреждения клеток (рис. S3

времени преинкубации с 7mGua в интервале

Приложения). При этом предварительно было

0,5-4 ч (рис. 5, а и б). В диапазоне времени

установлено, что PARP-ингибиторный эффект

0,5-3 ч наблюдали некоторое снижение сте-

7mGua, 8h7mGua и 3-AB на клетки сохра-

пени ингибирования PARP, а при увеличении

няется вплоть до 24 ч после их однократного

времени преинкубации до 4 ч - небольшое

внесения в среду (таблица S2 Приложения).

усиление ингибирования. Наблюдаемый вид

В исследовании на культуре недифференци-

зависимости может быть обусловлен такими

рованных клеток H9c2 после воздействия H₂O₂

факторами, как наличие механизмов обратно-

наблюдали катастрофическое снижение чис-

го транспорта 7mGua (ослабление действия) и

ла живых клеток (таблица). Внесение в среду

превращение 7mGua в более активный метабо-

культивирования 7mGua и 8h7mGua в концен-

лит 8h7mGua (усиление действия). Получен-

трации 300 мкМ приводило к значительному

ные данные также указывают на то, что 7mGua

увеличению числа выживших клеток. Оказа-

достаточно быстро проникает в клетку и выхо-

лось, что наиболее сильным цитопротекторным

дит из неё. Эксперимент с отмывкой клеток

действием обладает 8h7mGua (увеличение чис-

от 7mGua показал, что для полного его уда-

ла живых клеток более чем в 3 раза). Интересно,

ления из клетки достаточно не более 10 мин

что 3-АВ, взятый в концентрации 1000 мкМ,

(рис. 5, в). Полное восстановление активности

обеспечивающей полное подавление актив-

PARP в клетках после их отмывки от 7mGua

ности PARP, уступает по эффективности цито-

указывает на обратимый характер ингиби-

протекторного действия 8h7mGua и соизмерим

рования данным соединением. Аналогичные

с 7mGua (таблица). Можно предположить, что

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

966

ШРАМ и др.

Рис. 3. Ингибирование PARP в присутствии 7mGua и 8h7mGua в недифференцированных клетках Н9с2. а - Схема

эксперимента. б - Выборочные микрофлуоресцентные снимки, полученные в ходе анализа. В качестве положитель-

ного контроля использован 3-AB. Длина масштабной планки соответствует 50 мкм. в - PARP-Ингибиторное действие

тестируемых веществ в концентрации 450 мкМ при 1- и 4-часовой преинкубации. г - Сравнение дозовых зависимо-

стей для 7mGua и 8h7mGua (длительность преинкубации клеток с веществами - 1 ч; инкубация с 1 мМ H2O2 - 5 мин).

*** р < 0,001 относительно контроля (инкубация без тестируемых веществ). ^### p < 0,001 относительно 1-часовой

преинкубации клеток с 7mGua. ^§§§ p < 0,001 относительно 4-часовой преинкубации клеток с 7mGua

в данной модели действие производных гуанина

обусловлено, наряду с ингибированием PARP,

некоторыми дополнительными механизмами.

Дифференцированные клетки оказались

более устойчивыми к повреждающему воздей-

ствию Н₂О₂ по сравнению с недифференциро-

ванными, однако и в данном случае 7mGua и

8h7mGua увеличивали выживаемость клеток.

При этом производные гуанина и 3-AB демон-

стрировали соизмеримое цитопротекторное

действие (таблица). В культуре дифферен-

цированных клеток невозможно произвести

морфометрический анализ ввиду слияния кле-

ток и многоядерности (см. рис. 2, г), поэтому

в качестве количественного показателя для

оценки выживаемости использовали конфлю-

Рис. 4. Сравнение эффективности PARP-ингибиторного

ентность

- степень покрытия поверхности

действия

8h7mGua в культурах дифференцированных

роста живыми клетками.

и недифференцированных клеток Н9с2

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

PARP-ИНГИБИТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ГУАНИНА

967

Рис. 5. Динамика PARP-ингибиторного действия 7mGua в недифференцированных клетках Н9с2 при его внесении

и удалении из среды культивирования. а - Схема экспериментов. б - Влияние длительности преинкубации клеток

с 7mGua на степень ингибирования PARP. в, г - Восстановление активности PARP в клетках после отмывки от 7mGua

и 3-AB; клетки предварительно выдерживали в среде с ингибиторами в течение 1 ч. * p < 0,05 относительно контроля.

*** р < 0,001 относительно контроля. ^§§ p < 0,01 относительно длительности преинкубации 0,5 ч. ^### p < 0,001 относи-

тельно клеток без отмывки от ингибиторов (длительность отмывки 0 мин)

Влияние 7mGua и 8h7mGua на выживаемость клеток H9с2 в модели сильного окислительного стресса, вызванного

воздействием H2O2

Содержание живых клеток в культуре

Тестируемое вещество

H2O2

Недифференцированные клетки

Дифференцированные клетки

N/см²

Конфлюентность, %

– (Контроль 1)

13 204 ± 1862

< 0,001

81,3 ± 2,0

< 0,001

– (Контроль 2)

240 ± 55

47,4 ± 2,2

7mGua (300 мкМ)

617 ± 193

0,003

52,5 ± 1,8

0,003

8h7mGua (300 мкМ)

807 ± 159

< 0,001

57,7 ± 2,3

< 0,001

3-АВ (1000 мкМ)

660 ± 182

0,002

56,1 ± 1,8

< 0,001

* Значения р относительно контроля 2.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

форма 1), причём более сильным ингибитором

является 8h7mGua [13]. Хотя было известно о

Ранее нами было установлено, что 7mGua

наличии PARP-ингибиторной активности у

и его метаболит 8h7mGua конкурентно инги-

некоторых пуринов (преимущественно у мети-

бируют рекомбинантную PARP человека (изо-

лированных производных ксантина) [43, 44],

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

968

ШРАМ и др.

мы показали, что 7mGua существенно превос-

тканей), так и умеренной и перманентной

ходит по активности ближайший аналог 7-ме-

(например, при осложнениях сахарного диа-

тилксантин [11].

бета). Ингибиторы PARP способны оказывать

Поскольку PARP имеет чёткую ядерную

цитопротекторное действие на животных и

локализацию, её эффективные ингибиторы

клеточных моделях таких заболеваний [33, 37,

должны проникать через плазматическую мем-

51-53]. Для оценки цитопротекторной актив-

брану и диффундировать в ядро, не подвер-

ности производных гуанина мы рассмотрели

гаясь при этом превращению в неактивные

модель повреждения кардиомиоцитов в усло-

метаболиты. В представленной работе мы

виях острого окислительного стресса, имею-

попытались выяснить, способны ли 7mGua и

щую отношение к ишемия-реперфузион-

8h7mGua подавлять активность PARP в жи-

ному повреждению миокарда. Полученные

вых клетках и проявлять цитопротекторные

данные свидетельствуют о способности 7mGua

эффекты, свойственные ингибиторам PARP.

и 8h7mGua предотвращать гибель клеток при

В качестве объекта исследований была вы-

повреждающем воздействии. Интересно, что

брана линия кардиомиобластов крысы Н9с2.

по наблюдаемому цитопротекторному эффекту

Особенностью данных клеток является воз-

8h7mGua превосходит классический ингиби-

можность дифференцировки в кардиомиоци-

тор PARP 3-АВ, что может свидетельствовать

топодобный фенотип. Дифференцированные

о влиянии производных гуанина на дополни-

клетки Н9с2 по многим морфологическим,

тельные белковые мишени [54].

биохимическим и функциональным характери-

Таким образом, впервые на клеточном уров-

стикам сходны с кардиомиоцитами миокарда,

не исследованы PARP-ингибиторные и цито-

хотя и не тождественны им (в частности, отсут-

протекторные свойства производных гуанина

ствует способность к сокращению) [45-47].

7mGua и 8h7mGua. Эксперименты проведены

Для оценки ингибиторного действия про-

на культурах недифференцированных и диф-

изводных гуанина использовали предложенный

ференцированных клеток линии H9c2. Пока-

ранее протокол, основанный на иммунофлуо-

зано, что оба соединения подавляют стимули-

ресцентном анализе PAR после кратковре-

рованную H₂O₂ активацию PARP в клетке в

менной обработки клеток высокими дозами

диапазоне 10^-5-10^-4 М. При этом 8h7mGua

H₂O₂ [42]. Пероксид водорода быстро проника-

оказался в несколько раз более эффектив-

ет в клетку и при взаимодействии с Fe²⁺ превра-

ным ингибитором по сравнению с 7mGua.

щается в гидроксильный радикал, способный

При моделировании острого окислительного

вызывать повреждения ДНК (в частности, од-

стресса, индуцированного 30-минутной обра-

ноцепочечные разрывы, с которыми связыва-

боткой клеток H₂O₂, 8h7mGua в концентрации

ется PARP). Это приводит к быстрой активации

300 мкМ продемонстрировал цитопротектор-

PARP и синтезу PAR из клеточного NAD⁺.

ное действие, превосходящее по эффектив-

В результате было подтверждено ингиби-

ности классический ингибитор PARP 3-AB.

торное действие 7mGua и 8h7mGua на кле-

Полученные данные свидетельствуют о воз-

точном уровне, а также обнаружена сложная

можности разработки новых лекарствен-

зависимость степени ингибирования PARP от

ных препаратов на основе 8h7mGua и других

времени преинкубации, которая может быть

производных гуанина для лечения заболева-

обусловлена сочетанием процессов обратного

ний, ассоциированных с воспалением, окис-

транспорта и превращением 7mGua в более

лительным стрессом и повышенной актив-

сильный ингибитор 8h7mGua. Известно, что

ностью PARP.

частичное превращение 7mGua в 8h7mGua

происходит под действием фермента ксантин-

Вклад авторов. С.И. Шрам и Д.К. Нилов -

оксидазы [10]. Вопросы транспорта 7mGua

концепция и руководство работой, написание

через плазматическую мембрану пока не изу-

текста; С.И. Шрам, Т.А. Щербакова, Т.В. Аб-

чались. В качестве возможных механизмов,

рамова, Э.Ц. Барадиева, А.С. Ефремова,

наряду с пассивной диффузией, следует рас-

М.С. Смирновская - проведение эксперимен-

сматривать белок-опосредованный транспорт

тов; В.Н. Сильников и В.К. Швядас - обсу-

с участием транспортёров нуклеозидов и азо-

ждение результатов исследования и редакти-

тистых оснований [48-50].

рование текста статьи.

Патогенез заболеваний сердечно-сосуди-

Финансирование. Исследование выпол-

стой, нервной, иммунной, дыхательной и дру-

нено при финансовой поддержке Российского

гих систем сопряжён с активацией PARP, при-

фонда фундаментальных исследований (грант

чём как сильной и транзиентной (например,

№ 20-08-01161 А) за исключением указанных

при ишемия-реперфузионном повреждении

далее работ. Синтез 8-гидрокси-7-метилгуа-

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

PARP-ИНГИБИТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ГУАНИНА

969

нина выполнен при поддержке Российского

ных гуанина для подавления ферментативной

научного фонда (грант № 19-74-10072).

активности PARP.

Благодарности. В работе использовано

Соблюдение этических норм. Настоящая

оборудование ЦКП «Центр клеточных и ген-

статья не содержит описания выполненных ав-

ных технологий» (НИЦ «Курчатовский инсти-

торами исследований с участием людей или ис-

тут» - ИМГ).

пользованием животных в качестве объектов.

Конфликт интересов. Д.К. Нилов, С.И. Шрам,

Дополнительные материалы. Приложе-

Т.А. Щербакова и В.К. Швядас являются авто-

ние к статье опубликовано на сайте журнала

рами патентов на использование производ-

«Биохимия» (https://biochemistrymoscow.com).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Weissmann, B., Bromberg, P. A., and Gutman, A. B.

Litwack, M. D., and Weissmann, B. (1966) Source

(1957) The purine bases of human urine. I. Separation

of urinary

8-hydroxy-7-methylguanine in man,

and identification, J. Biol. Chem., 224, 407-422,

Biochemistry, 5, 3007-3012, doi: 10.1021/bi00873a033.

doi: 10.1016/S0021-9258(18)65040-9.

10.

Skupp, S., and Ayvazian, J. H. (1969) Oxidation of

Weissmann, B., Bromberg, P. A., and Gutman,

7-methylguanine by human xanthine oxidase, J. Lab.

A. B. (1957) The purine bases of human urine. II.

Clin. Med., 73, 909-916.

Semiquantitative estimation and isotope incorporation,

11.

Нилов Д. К., Тараров В. И., Куликов А. В.,

J. Biol. Chem.,

224,

423-434, doi:

10.1016/

Захаренко А. Л., Гущина И. В., Михайлов С. Н.,

S0021-9258(18)65041-0.

Лаврик О. И., Швядас В. К. (2016) Ингибиро-

Weissmann, B., and Gutman, A. B. (1957) The iden-

вание поли(ADP-рибозо)полимеразы метабо-

tification of

6-succinoaminopurine and of

8-hy-

литом нуклеиновых кислот

7-метилгуанином,

droxy-7-methylguanine as normal human urinary con-

Acta Naturae, 8, 120-128, doi: 10.32607/20758251-

stituents, J. Biol. Chem., 229, 239-250, doi: 10.1016/

2016-8-2-108-115.

S0021-9258(18)70612-1.

12.

Nilov, D., Maluchenko, N., Kurgina, T., Pushkarev, S.,

Topp, H., Sander, G., Heller-Schöch, G., and

Lys, A., Kutuzov, M., Gerasimova, N., Feofanov, A.,

Schöch, G. (1987) Determination of 7-methylgua-

Švedas, V., Lavrik, O., and Studitsky, V. M. (2020)

nine, N²,N²-dimethylguanosine, and pseudouridine

Molecular mechanisms of PARP-1 inhibitor 7-methyl-

in ultrafiltrated serum of healthy adults by high-per-

guanine, Int. J. Mol. Sci., 21, 2159, doi: 10.3390/

formance liquid chromatography, Anal. Biochem., 161,

ijms21062159.

49-56, doi: 10.1016/0003-2697(87)90650-6.

13.

Кургина Т. А., Шрам С. И., Кутузов М. М.,

Svoboda, P., and Kasai, H. (2004) Simultaneous

Абрамова Т. В., Щербакова Т. А., Мальцева Е. А.,

HPLC analysis of

8-hydroxydeoxyguanosine and

Поройков В. В., Лаврик О. И., Швядас В. К.,

7-methylguanine in urine from humans and rodents,

Нилов Д. К. (2022) Ингибиторное действие 7-ме-

Anal. Biochem.,

334,

239-250, doi:

10.1016/j.ab.

тилгуанина и его метаболита 8-гидрокси-7-ме-

2004.08.021.

тилгуанина на поли(ADP-рибозо)полимеразу 1

Raćkowska, E., Bobrowska-Korczak, B., and

человека, Биохимия, 87, 794-803, doi: 10.31857/

Giebułtowicz, J. (2019) Development and validation

S0320972522060070.

of a rapid LC-MS/MS method for determination of

14.

Manasaryan, G., Suplatov, D., Pushkarev, S.,

methylated nucleosides and nucleobases in urine,

Drobot, V., Kuimov, A., Švedas, V., and Nilov, D.

J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.,

(2021) Bioinformatic analysis of the nicotinamide

1128, 121775, doi: 10.1016/j.jchromb.2019.121775.

binding site in poly(ADP-ribose) polymerase family

Sander, G., Hülsemann, J., Topp, H., Heller-Schöch, G.,

proteins, Cancers (Basel), 13, 1201, doi: 10.3390/

and Schöch, G. (1986) Protein and RNA turnover in

cancers13061201.

preterm infants and adults: a comparison based on

15.

Шиловский Г. А., Хохлов А. Н., Шрам С. И. (2013)

urinary excretion of 3-methylhistidine and of modified

Cистема поли(ADP-рибозил)ирования белков: роль

one-way RNA catabolites, Ann. Nutr. Metab., 30, 137-

в поддержании стабильности генома и детерминации

142, doi: 10.1159/000177186.

продолжительности жизни, Биохимия, 78, 473-487.

Tamae, K., Kawai, K., Yamasaki, S., Kawanami, K.,

16.

Gupte, R., Liu, Z., and Kraus, W. L. (2017) PARPs

Ikeda, M., Takahashi, K., Miyamoto, T., Kato, N.,

and ADP-ribosylation: recent advances linking

and Kasai, H. (2009) Effect of age, smoking and

molecular functions to biological outcomes, Genes

other lifestyle factors on urinary 7-methylguanine and

Dev., 31, 101-126, doi: 10.1101/gad.291518.116.

8-hydroxydeoxyguanosine, Cancer Sci., 100, 715-721,

17.

Alemasova, E. E., and Lavrik, O. I. (2019) Poly(ADP-

doi: 10.1111/j.1349-7006.2009.01088.x.

ribosyl)ation by PARP1: reaction mechanism and

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

970

ШРАМ и др.

regulatory proteins, Nucleic Acids Res., 47, 3811-3827,

30.

Virág, L., Robaszkiewicz, A., Rodriguez-Vargas, J. M.,

doi: 10.1093/nar/gkz120.

and Oliver, F. J. (2013) Poly(ADP-ribose) signaling

18.

Kamaletdinova, T., Fanaei-Kahrani, Z., and Wang,

in cell death, Mol. Aspects Med.,

34,

1153-1167,

Z. Q. (2019) The enigmatic function of PARP1: from

doi: 10.1016/j.mam.2013.01.007.

PARylation activity to PAR readers, Cells, 8, 1625,

31.

Curtin, N. J., and Szabo, C. (2013) Therapeutic

doi: 10.3390/cells8121625.

applications of PARP inhibitors: anticancer therapy

19.

Нилов Д. К., Пушкарев С. В., Гущина И. В., Мана-

and beyond, Mol. Aspects Med.,

34,

1217-1256,

сарян Г. А., Кирсанов К. И., Швядас В. К. (2020)

doi: 10.1016/j.mam.2013.01.006.

Моделирование фермент-субстратных комплексов

32.

Henning, R. J., Bourgeois, M., and Harbison, R. D.

поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 человека, Биохи-

(2018) Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) and

мия, 85, 116-125, doi: 10.31857/S0320972520010091.

PARP inhibitors: Mechanisms of action and role in

20.

Narne, P., Pandey, V., Simhadri, P. K., and Phanithi,

cardiovascular disorders, Cardiovasc. Toxicol.,

18,

P. B. (2017) Poly(ADP-ribose)polymerase-1 hyper-

493-506, doi: 10.1007/s12012-018-9462-2.

activation in neurodegenerative diseases: the death

33.

Berger, N. A., Besson, V. C., Boulares, A. H.,

knell tolls for neurons, Semin. Cell Dev. Biol., 63, 154-

Bürkle, A., Chiarugi, A., Clark, R. S., Curtin, N. J.,

166, doi: 10.1016/j.semcdb.2016.11.007.

Cuzzocrea, S., Dawson, T. M., Dawson, V. L.,

21.

Ke, Y., Wang, C., Zhang, J., Zhong, X., Wang, R.,

Haskó, G., Liaudet, L., Moroni, F., Pacher, P.,

Zeng, X., and Ba, X. (2019) The role of PARPs in in-

Radermacher, P., Salzman, A. L., Snyder, S. H.,

flammation-and metabolic-related diseases: molecular

Soriano, F. G., Strosznajder, R. P., Sümegi, B.,

mechanisms and beyond, Cells, 8, 1047, doi: 10.3390/

Swanson, R. A., and Szabo, C. (2018) Opportunities

cells8091047.

for the repurposing of PARP inhibitors for the therapy

22.

Curtin, N. J., and Szabo, C. (2020) Poly(ADP-ribose)

of non-oncological diseases, Br. J. Pharmacol., 175,

polymerase inhibition: past, present and future,

192-222, doi: 10.1111/bph.13748.

Nat. Rev. Drug Discov., 19, 711-736, doi: 10.1038/

34.

Liu, S., Luo, W., and Wang, Y. (2022) Emerging role

s41573-020-0076-6.

of PARP-1 and PARthanatos in ischemic stroke,

23.

Szabó, G., Liaudet, L., Hagl, S., and Szabó, C.

J. Neurochem., 160, 74-87, doi: 10.1111/jnc.15464.

(2004) Poly(ADP-ribose) polymerase activation in

35.

Pacher, P., and Szabó, C. (2007) Role of poly(ADP-

the reperfused myocardium, Cardiovasc. Res., 61,

ribose) polymerase 1 (PARP-1) in cardiovascular

471-480, doi: 10.1016/j.cardiores.2003.09.029.

diseases: the therapeutic potential of PARP inhibitors,

24.

Woolley, S. M., Farivar, A. S., Naidu, B. V.,

Cardiovasc. Drug Rev., 25, 235-260, doi: 10.1111/

Salzman, A., Szabo, C., Thomas, R., Fraga, C.,

j.1527-3466.2007.00018.x.

and Mulligan, M. S. (2004) Role of poly (ADP) ri-

36.

Tao, R., Kim, S. H., Honbo, N., Karliner, J. S., and

bose synthetase in lung ischemia-reperfusion injury,

Alano, C. C. (2010) Minocycline protects cardiac

J. Heart Lung Transplant., 23, 1290-1296, doi: 10.1016/

myocytes against simulated ischemia-reperfusion in-

j.healun.2003.08.036.

jury by inhibiting poly(ADP-ribose) polymerase-1,

25.

Van Wijk, S. J., and Hageman, G. J. (2005) Poly-

J. Cardiovasc. Pharmacol., 56, 659-668, doi: 10.1097/

(ADP-ribose) polymerase-1 mediated caspase-in-

FJC.0b013e3181faeaf0.

dependent cell death after ischemia/reperfusion,

37.

Tiwari, P., Khan, H., Singh, T. G., and Grewal, A. K.

Free Radic. Biol. Med., 39, 81-90, doi: 10.1016/

(2022) Poly (ADP-ribose) polymerase: an overview of

j.freeradbiomed.2005.03.021.

mechanistic approaches and therapeutic opportunities

26.

Fujikawa, D. G. (2015) The role of excitotoxic pro-

in the management of stroke, Neurochem. Res., 47,

grammed necrosis in acute brain injury, Comput.

1830-1852, doi: 10.1007/s11064-022-03595-z.

Struct. Biotechnol. J.,

13,

212-221, doi:

10.1016/

38.

Ohmoto, A., and Yachida, S. (2017) Current status

j.csbj.2015.03.004.

of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors and

27.

Frampton, J. E. (2015) Olaparib: a review of its use

future directions, Onco Targets Ther., 10, 5195-5208,

as maintenance therapy in patients with ovarian

doi: 10.2147/OTT.S139336.

cancer, BioDrugs, 29, 143-150, doi: 10.1007/s40259-

39.

Walsh, C. (2018) Targeted therapy for ovarian can-

015-0125-6.

cer: the rapidly evolving landscape of PARP inhibi-

28.

Mittica, G., Ghisoni, E., Giannone, G., Genta, S.,

tor use, Minerva Ginecol., 70, 150-170, doi: 10.23736/

Aglietta, M., Sapino, A., and Valabrega, G. (2018)

S0026-4784.17.04152-1.

PARP inhibitors in ovarian cancer, Recent Pat. Anti-

40.

Jain, P. G., and Patel, B. D. (2019) Medicinal chem-

cancer Drug Discov.,

13,

392-410, doi:

10.2174/

istry approaches of poly ADP-Ribose polymerase 1

1574892813666180305165256.

(PARP1) inhibitors as anticancer agents - a recent up-

29.

Zimmer, A. S., Gillard, M., Lipkowitz, S., and

date, Eur. J. Med. Chem., 165, 198-215, doi: 10.1016/

Lee, J. M. (2018) Update on PARP inhibitors in

j.ejmech.2019.01.024.

breast cancer, Curr. Treat. Options Oncol., 19, 21,

41.

Kirsanov, K., Fetisov, T., Antoshina, E., Trukhanova, L.,

doi: 10.1007/s11864-018-0540-2.

Gor’kova, T., Vlasova, O., Khitrovo, I., Lesovaya, E.,

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023

PARP-ИНГИБИТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ГУАНИНА

971

Kulbachevskaya, N., Shcherbakova, T., Belitsky, G.,

follows form” model of differentiation, Mol. Omics,

Yakubovskaya, M., Švedas, V., and Nilov, D. (2022)

14, 181-196, doi: 10.1039/c8mo00036k.

Toxicological properties of 7-methylguanine, and pre-

48.

Pastor-Anglada, M., Cano-Soldado, P., Molina-

liminary data on its anticancer activity, Front. Pharma-

Arcas, M., Lostao, M. P., Larráyoz, I., Martínez-

col., 13, 842316, doi: 10.3389/fphar.2022.842316.

Picado, J., and Casado, F. J. (2005) Cell entry and

42.

Efremova, A. S., Zakharenko, A. L., Shram, S. I.,

export of nucleoside analogues, Virus Res., 107, 151-

Kulikova, I. V., Drenichev, M. S., Sukhanova,

164, doi: 10.1016/j.virusres.2004.11.005.

M. V., Khodyreva, S. N., Myasoedov, N. F., Lavrik,

49.

Cano-Soldado, P., and Pastor-Anglada, M. (2012)

O. I., and Mikhailov, S. N. (2013) Disaccharide py-

Transporters that translocate nucleosides and structur-

rimidine nucleosides and their derivatives: a novel

al similar drugs: structural requirements for substrate

group of cell-penetrating inhibitors of poly(ADP-ri-

recognition, Med. Res. Rev., 32, 428-457, doi: 10.1002/

bose) polymerase

1, Nucleosides Nucleotides Nu-

med.20221.

cleic Acids,

32,

510-528, doi:

10.1080/15257770.

50.

Inoue, K.

(2017) Molecular basis of nucleobase

2013.827793.

transport systems in mammals, Biol. Pharm. Bull., 40,

43.

Virág, L., and Szabó, C.

(2001) Purines inhibit

1130-1138, doi: 10.1248/bpb.b17-00374.

poly(ADP-ribose) polymerase activation and modu-

51.

Zingarelli, B., Cuzzocrea, S., Zsengellér, Z., Salzman,

late oxidant-induced cell death, FASEB J., 15, 99-107,

A. L., and Szabó, C. (1997) Protection against myo-

doi: 10.1096/fj.00-0299com.

cardial ischemia and reperfusion injury by 3-amino-

44.

Geraets, L., Moonen, H. J., Wouters, E. F., Bast, A.,

benzamide, an inhibitor of poly (ADP-ribose) syn-

and Hageman, G. J. (2006) Caffeine metabolites

thetase, Cardiovasc. Res., 36, 205-215, doi: 10.1016/

are inhibitors of the nuclear enzyme poly(ADP-

s0008-6363(97)00137-5.

ribose)polymerase-1 at physiological concentrations,

52.

Ilnytska, O., Lyzogubov, V. V., Stevens, M. J., Drel, V. R.,

Biochem. Pharmacol., 72, 902-910, doi: 10.1016/j.bcp.

Mashtalir, N., Pacher, P., Yorek, M. A., and Obrosova,

2006.06.023.

I. G. (2006) Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition

45.

Hescheler, J., Meyer, R., Plant, S., Krautwurst, D.,

alleviates experimental diabetic sensory neuropathy,

Rosenthal, W., and Schultz, G. (1991) Morphological,

Diabetes, 55, 1686-1694, doi: 10.2337/db06-0067.

biochemical, and electrophysiological characterization

53.

Tas Hekimoglu, A., Toprak, G., Akkoc, H.,

of a clonal cell (H9c2) line from rat heart, Circ. Res.,

Evliyaoglu, O., Tas, T., Kelle, I., and Colpan, L.

69, 1476-1486, doi: 10.1161/01.res.69.6.1476.

(2014) Protective effect of 3-aminobenzamide, an

46.

Branco, A. F., Pereira, S. P., Gonzalez, S., Gusev, O.,

inhibitor of poly (ADP-ribose) polymerase in distant

Rizvanov, A. A., and Oliveira, P. J. (2015) Gene

liver injury induced by renal ischemia-reperfusion in

expression profiling of H9c2 myoblast differentiation

rats, Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci., 18, 34-38.

towards a cardiac-like phenotype, PLoS One, 10,

54.

Пушкарев С. В., Винник В. A., Шаповалова И. В.,

e0129303, doi: 10.1371/journal.pone.0129303.

Швядас В. К., Нилов Д. К. (2022) Моделирование

47.

Kankeu, C., Clarke, K., Van Haver, D., Gevaert, K.,

структуры комплекса тРНК-гуанинтрансгликози-

Impens, F., Dittrich, A., Roderick, H. L., Passante, E.,

лазы человека с 7-метилгуанином и выявление фак-

and Huber, H. J. (2018) Quantitative proteomics and

торов, определяющих взаимодействие фермента с

systems analysis of cultured H9C2 cardiomyoblasts

ингибиторами, Биохимия, 87, 550-557, doi: 10.31857/

during differentiation over time supports a “function

S0320972522040078.

NATURAL GUANINE DERIVATIVES EXERT PARP-INHIBITORY

AND CYTOPROTECTIVE EFFECTS IN A MODEL

OF CARDIOMYOCYTE DAMAGE UNDER OXIDATIVE STRESS

S. I. Shram¹*, T. A. Shcherbakova², T. V. Abramova³, E. C. Baradieva¹, A. S. Efremova⁴,

M. S. Smirnovskaya⁵, V. N. Silnikov³, V. K. Švedas^2,6, and D. K. Nilov²*

¹Institute of Molecular Genetics, National Research Centre “Kurchatov Institute”,

123182 Moscow, Russia; e-mail: shram-si.img@yandex.ru

² Lomonosov Moscow State University, Belozersky Institute of Physicochemical Biology,

119992 Moscow, Russia; e-mail: nilovdm@gmail.com

³ Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Russian Academy of Sciences, Siberian Branch,

630090 Novosibirsk, Russia

⁴ Research Centre for Medical Genetics, 115522 Moscow, Russia

БИОХИМИЯ том 88 вып. 6 2023