МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Исследованы две группы акантоцефалов. Акантоцефалы первой группы были извлечены из толстощеков, инвазированных естественным путем или экспериментально. Два эксперимента с 23 толстощеками были проведены в лабораторных условиях в сентябре–ноябре 2012 г. Подопытные рыбы были отловлены в окрестностях г. Магадан на участке, контрольные обловы которого показали отсутствие естественной инвазии. Для заражения использовали около 100 коринозом из бельдюг и толстощеков, инвазированных естественным путем. Вскрытие производили через 3, 14, 30 и 50 сут со дня заражения. В результате инвазированными оказались 16 толстощеков, причем наибольшее количество скребней локализовалось на брыжейке кишечника, тогда как на брюшной стенке, печени и гонадах были обнаружены единичные паразиты. Электронно-микроскопически были изучены два скребня через 3 сут после инвазии, один скребень через 14 сут и по два скребня через 30 и 50 сут после заражения (подробное описание экспериментов опубликовано ранее (Скоробрехова, Никишин, 2021б).

Акантоцефалы второй группы были извлечены из палтуса, инвазированного естественным образом. Гельминтов фиксировали в 2% глутаровом альдегиде на 0.1 М фосфатном буфере, постфиксировали в 1% тетраоксиде осмия на 0.2 М фосфатном буфере, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заключали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие срезы, полученные на ультрамикротоме LKB IV, окрашивали смесью кристаллического фиолетового и метиленового синего и изучали в световом микроскопе Olympus CX 41. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме PT-PC, контрастировали 1% раствором уранилацетата в 70% спирте и изучали в электронном микроскопе JEM 1400 PLUS. Всего было изучено 35 коринозом из толстощеков и 12 коринозом из палтуса, инвазированных естественным образом, а также 58 коринозом из толстощеков, инвазированных в эксперименте.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В толстощеках, инвазированных естественным путем, коринозомы были окружены трехслойными лейкоцитарными капсулами из клеток хозяина. Внутренний слой капсул состоял из дегенерирующих клеток, в среднем и наружном слоях преобладали макрофаги и лейкоциты при небольшом количестве фибробластов (рис. 1а). В среднем слое клеточные элементы располагались плотно, а в наружном – рыхло. Более полное описание капсулы, окружавшей коринозом в толстощеке, инвазированном естественным образом, опубликовано ранее (Скоробрехова, Никишин, 2021а).

Поверхность всех исследованных акантоцефалов, инвазировавших толстощеков, была покрыта толстым (0.6–2.4 мкм) слоем гликокаликса, образованным плотно расположенными филаментами и мелкими гранулами умеренной электронной плотности (рис. 1а, 1б). Узкий внутренний слой гликокаликса с волнистой поверхностью характеризовался повышенной электронной плотностью. С поверхностью гликокаликса контактировали дегенерирующие клетки внутреннего слоя капсулы.

На 3-и сут после экспериментального заражения толстощеков все коринозомы были окружены прерывистым или почти сплошным слоем макрофагов и лейкоцитов хозяина (рис. 2а). На поверхности скребней располагался слой гликокаликса толщиной 1.5–2.1 мкм. В некоторых участках гликокаликс был отделен от поверхности тегумента, но сохранял непрерывность (рис. 2б, 2в). В этих случаях в пространстве между слоем гликокаликса и поверхностью тегумента иногда наблюдались фрагменты дегенерирующих клеток хозяина.

Наружная поверхность гликокаликса была неровной (рис. 2в), в него часто внедрялись псевдоподии макрофагов хозяина, которые, однако, не достигали тегумента паразита. В толще слоя гликокаликса часто наблюдались скопления мелких везикул и трубчатых образований диаметром 18–26 нм, внешне и по размерам напоминающих микротрубочки (рис. 2г). На 14-е сут и позже, а также у коринозом, инвазировавших толстощеков естественным образом, отделение слоя гликокаликса от тегумента не наблюдалось.

Детальное описание тегумента и окружающей капсулы коринозом, извлеченных из палтуса, опубликовано ранее (Скоробрехова, Никишин, 2017). Обнаружены две модификации коринозом, по-разному воспринимавшие гистологические красители. Менее интенсивно окрашивающиеся скребни были окружены однослойными капсулами, образованными преимущественно крупными плотно расположенными макрофагами с включением небольшого числа нейтрофилов и плазмоцитов, а также фибробластов в наружной части капсул. Толщина этих капсул составляла 80–265 мкм (рис. 3а). Более интенсивно окрашивающиеся коринозомы были заключены в относительно менее толстую (33–101 мкм) двухслойную капсулу, внутренний слой которой был образован преимущественно макрофагами, а наружный – преимущественно фибробластами. Поверхность тегумента этих скребней, в отличие от тегумента коринозом из толстощека, была покрыта тонким (не более 0.1 мкм) слоем гликокаликса, поэтому при наблюдении на небольшом увеличении создавалось впечатление, что клетки капсулы вплотную прилегают к наружной мембране тегумента (рис. 3б).

Во внутренней части капсул, окружавших двух коринозом в палтусе, обнаружен слой гомогенного плотного материала толщиной 0.7–2.5 мкм (рис. 4а, 4б, 4в) с включением светлых везикул диаметром 0.04–0.2 мкм (рис. 4г). В основании слоя отмечены мембранные профили разной формы, напоминавшие фрагменты наружной мембраны тегумента (рис. 4г). В некоторых участках этот слой соприкасался с поверхностью тегумента (рис. 4б), в других участках он был прерывистым, не был связан с тегументом, а его отдельные фрагменты были обнаружены в толще капсулы (рис. 4а, 4б), однако на большем своем протяжении он сохранял непрерывность и был ориентирован параллельно поверхности тегумента (рис. 4в). В участках, где слой находился вблизи тегумента, между ними наблюдались мембранные профили, сходные с отмеченными в основании слоя. Иногда мембранные профили продолжались в наружную мембрану тегумента; в этих случаях между этой мембраной и остальной частью тегумента наблюдалось светлое пространство, а на поверхности тегумента выявлялась ненарушенная мембрана, предположительно сформированная заново (рис. 4г). Гомогенный характер материала, образующего слой, его тесная связь с тегументом во многих участках и расположение вокруг паразита позволяют рассматривать этот слой как модифицированный гликокаликс, отделенный от тегумента вместе с наружной мембраной.

ОБСУЖДЕНИЕ

Прежде, чем интерпретировать описанные феномены, напомним, что в промежуточных хозяевах эмбриональные личинки акантоцефалов (аканторы) развиваются в цистакантов, которые у многих видов окружаются неклеточной цистой и покрываются толстым слоем гликокаликса (Никишин, 2018). При попадании в организм паратенического хозяина гликокаликс цистакантов, вероятно, должен быть разрушен ферментами желудочно-кишечного тракта. Это предположение основано на результатах гистохимических исследований, свидетельствующих о том, что основу гликокаликса составляют кислые и нейтральные мукополисахариды (Lumsden, 1975). Таким образом, гликокаликс, покрывающий скребней в паратеническом хозяине, по всей вероятности, является новообразованием (Никишин, 2018).

Необходимо отметить, что цистаканты Corynosoma strumosum, извлеченные из гаммаруса Spinulogammarus ochotensis (Brandt, 1851), хотя и были заключены в неклеточную цисту, но не покрывались развитым слоем гликокаликса (Skorobrekhova, Nikishin, 2019). Возможно, рачки этого вида не являются специфичными промежуточными хозяевами C. strumosum, поэтому гликокаликс на поверхности цистакантов не формируется. В пользу данной версии свидетельствует тот факт, что все обнаруженные цистаканты были в разной степени инкапсулированы клетками хозяина и находились в угнетенном состоянии или были погибшими (Skorobrekhova, Nikishin, 2019). Это, однако, не противоречит выводу о новообразовании гликокаликса на поверхности коринозом в паратенических хозяевах определенных видов, включая толстощека, а, напротив, свидетельствует в его пользу. Другие описания цистакантов данного вида в литературе отсутствуют.

Отношения коринозомы и толстощека соответствуют первой стратегии взаимоотношений скребней с паратеническими хозяевами, которая подразумевает обязательное образование на поверхности паразита толстого слоя гликокаликса, а также разрушение и меланизацию внутреннего слоя капсулы (лейкоцитарной или фибробластической) (Никишин, Скоробрехова, 2018).

Отделение слоя гликокаликса от тегумента коринозом, инвазирующих толстощека, наблюдалось только в экспериментальных условиях на 3 сут эксперимента, т.е. на начальном этапе инвазии. На 14 сут и последующие дни эксперимента, а также при естественной инвазии толстощека коринозомами, слой гликокаликса имел обычный вид и на всем протяжении был связан с тегументом червей. Подчеркнем, что во всех случаях, включая ранние сроки эксперимента, коринозомы были инкапсулированы лейкоцитарными капсулами, внутренний слой которых, прилегающий к поверхности гликокаликса, состоял из дегенерирующих клеток, подвергающихся меланизации. Эти данные в совокупности с вероятной защитной ролью гликокаликса позволяют предположить, что смена гликокаликса у коринозом в толстощеке обусловлена накоплением в нем факторов, возникших при взаимодействии клеток хозяина с только что внедрившимся паразитом.

Отношения коринозомы с палтусом, как и с другими камбаловыми рыбами, относятся ко второй стратегии взаимоотношений скребней с паратеническими хозяевами, при которой толстый слой гликокаликса на поверхности тегумента паразита не формируется и не происходят дегенерация и меланизация клеток внутренней части капсулы (Никишин, Скоробрехова, 2018). В наших исследованиях этой схеме соответствовали взаимоотношения большинства коринозом с палтусом. Описанный феномен был обнаружен только у двух паразитов. Можно предположить, что у скребней, попавших в палтуса, на первом этапе инвазии гликокаликс все-таки формируется, однако по мере инкапсуляции паразита и накопления в нем антигенов он сбрасывается вместе с наружной мембраной тегумента, разрушается и в дальнейшем замещается “обычным” тонким слоем. Различия между двумя модификациями коринозом из палтуса по толщине окружающей их капсулы и способности к окрашиванию, возможно, также связаны с разным по длительности периодом паразитирования, но для более точной интерпретации этого факта необходимы дальнейшие исследования.

Обнаруженный феномен утраты гликокаликса одновременно с наружной мембраной тегумента паразитического червя не уникален. Подобное явление отмечено у церкарий шистосоматид в процессе инвазии ими теплокровного позвоночного (окончательного хозяина) и трансформации их в шистосомулы (Horak et al., 1998; Řimnáčová et al., 2017). У церкарии Trichobilharzia szidati сбрасываемые элементы (наружная мембрана тегумента и толстый слой гликокаликса) заменяются мембраной с тонким слоем гликокаликса, формируемыми de novo; эти факты расцениваются как стратегия уклонения от иммунного ответа хозяина (Horak et al., 1998). Отметим, что сбрасывание гликокаликса может быть инициировано и в экспериментальных условиях в культуре (Samuelson, Caulfild, 1982; Lammas, Duffus, 1983). Принимая во внимание, что и церкарии шистосом, проникающие в хозяина, и шистосомулы, паразитирующие в нем, и коринозомы, паразитирующие в паратенических хозяевах, являются тканевыми паразитами, мы рассматриваем феномен обновления поверхностной части тегумента коринозом как одну из защитных стратегий. По аналогии с трематодами эта стратегия реализуется на начальном этапе тканевого паразитизма и включает обновление слоя иммуноаттрактивного гликокаликса, а в некоторых случаях (не исключено, что во всех) и наружной мембраны тегумента. Данный феномен имеет место только на начальном этапе инвазии паратенического хозяина, что подтверждено упомянутыми результатами экспериментального заражения толстощеков. В случае с палтусом мы, вероятно, также наблюдали начальный этап инвазии, поскольку тегумент большинства других коринозом в этом хозяине был покрыт обычным тонким слоем гликокаликса и не имел признаков смены или изменения наружной мембраны.

Стратегия уклонения от иммунного ответа хозяина путем сбрасывания поверхностных элементов оболочек или покровов характерна не только для многоклеточных паразитов. Внеклеточные формы малярийных плазмодиев преодолевают негативную реакцию антител хозяина на спорозоитов, сбрасывая молекулы поверхностных белков, что нивелирует эффективность этих антител (Zambrano-Vila et al., 2002). Иной процесс, приводящий к сходному результату, описан у лейшманий, метациклические промастиготы которых могут нейтрализовать действие комплемента, сбрасывая мембраноатакующий комплекс (Puentes et al., 1990). Не вдаваясь в обсуждение молекулярных механизмов уклонения от реакции хозяина, отметим, что эти примеры иллюстрируют, в сущности, общее явление, характеризующее отношения паразита и хозяина на организменном уровне. Можно предположить, что стратегия уклонения тканевых паразитов от иммунного ответа хозяина путем смены/обновления поверхностной части их организма носит общий характер и используется паразитическими организмами, принадлежащими к разным таксономическим группам. Для проверки этого предположения необходимы дальнейшие исследования.