ШАПЕРОНЫ И АУТОФАГИЯ

Аутофагия – это эволюционно консервативный катаболический процесс, который поддерживает гомеостаз клетки, утилизируя долгоживущие белки и поврежденные органеллы. В настоящее время описаны три типа аутофагии: микроаутофагия, макроаутофагия, и опосредованная шаперонами аутофагия. Микроаутофагия имеет место, когда фрагменты клеточных мембран и макромолекул просто захватываются лизосомой. При аутофагии, опосредованной шаперонами, происходит направленный транспорт частично денатурированных белков из цитоплазмы непосредственно в лизосому (Margulis et al., 2020). Макроаутофагия является более сложным процессом, чем микроаутофагия, и ей мы уделили практически все внимание, поскольку именно она участвует в тех молекулярных событиях, которые мы описываем в обзоре.

Макроаутофагия – это такой процесс, при котором дефектные белки и органеллы окружаются двойной мембраной, и образующаяся таким образом аутофагосома в дальнейшем сливается с лизосомой. Содержимое аутофагосомы переваривается за счет лизосомальных ферментов, а образующиеся в результате аминокислоты используются в качестве материалов для поддержания жизнедеятельности и энергетики клетки (Mizushima, 2007). Аутофагия является механизмом выживания, поскольку утилизирует органеллы, дефектные белки и участки цитоплазмы и подвергает их переработке. В то же время, аутофагия является формой гибели клетки, когда ее процесс не ограничен, и разрушению подвергаются необходимые для жизни клеточные элементы.

Процессы аутофагии контролируются генами семейства Atg (autophagy-related gene) (Kametaka et al., 1998). Эти гены обеспечивают инициацию аутофагии, образование и созревание аутофагосом. Можно предположить, что в одноклеточном организме аутофагия отвечает за синтез и деградацию белков, а также регулирует численность органелл, например, таких, как митохондрии. Недаром митохондрии считаются симбиотическим организмом (Mehta et al., 2018). Когда появились многоклеточные организмы, функции генов семейства Atg расширились, теперь они осуществляют надзор за генетической стабильностью многоклеточного организма и поддерживают ткани в функциональном состоянии, то есть отвечают за тканевой гомеостаз.

Недавно было показано, что эти функции включают в себя участие в DDR-ответе (DNA damage response). Аутофагия оказывает положительный эффект на гомологичную рекомбинацию, играет позитивную роль в таких репарационных процессах, как эксцизионная репарация и репарация ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatch). При участии аутофагии деградируют такие протеины, как KAP1 (Kruppel associated box domain-associated protein 1), HP1 (heterochromatin protein 1) и SQSTM1/p62. Модуляция HP1 изменяет структуру хроматина таким образом, что становится возможной репарация двухцепочечных разрывов (Gomes et al., 2017). Таким образом, у многоклеточных организмов поддерживается стабильность ДНК, что предохраняет ткани от новообразований.

Шапероны принадлежат к семействам белков теплового шока (Hsp100, Hsp90, Hsp70 и Hsp27). Эти белки активируются в ответ на лекарственные препараты, радиацию и другие стресс-факторы. Они поддерживают баланс белков в клетке, способствуют выживанию клетки, участвуя в адаптивных реакциях. Шапероны поддерживают гомеостаз и предотвращают токсичность неправильно сложенных и денатурированных белков. Это особенно важно для опухолевых клеток, которые избыточно экспрессируют белки теплового шока и выживают даже при наличии высоких уровней белков с неправильной укладкой (Sannino et al., 2021). Шапероны нековалентно присоединяются к белкам и восстанавливают их третичную или четвертичную структуру. Шапероны отвечают также за образование и диссоциацию белковых комплексов. Шапероны предоставляют опухоли селективные преимущества, подавляя апоптозные пути, некроз, помогая преодолеть старение, промотируя ангиогенез и стимулируя метастазирование. Таким образом, шапероны способствуют прогрессии опухолей. Шапероны предохраняют клетки от анойкиса и обеспечивают жизнеспособность клеток, утративших контакт с экстраклеточным матриксом. Таким способом, шапероны способствуют метастазированию (Albakova et al., 2020).

Белки теплового шока (Hsp) обеспечивают репарацию ДНК и стабильность генома. Известно, что Hsp быстро активируются в ответ на повреждающие ДНК агенты. Они обнаруживаются в фокусах репарации ДНК и активируются фосфорилированием такими факторами и стражами генома, как ATM, ATR и ДНК-зависимая протеинкиназа (ДНК-ПК) (Dubrez et al., 2020). Делеция транскрипционного фактора 1 теплового шока (HSF1), который контролирует экспрессию белков теплового шока, основательно повреждает способность фибробластов крысы репарировать DSB (Dubrez et al., 2020). Белки теплового шока ассоциированы с протеинами, вовлеченными в DDR-сигнальный путь (Sottile, Nadin, 2018).

Применение терапевтических воздействий – цитостатиков и облучения – служит стресс-фактором для опухолевых клеток. Несомненно, стрессовое действие на опухолевые клетки оказывают и гипоксия, и закисление окружающей среды, и активность иммунной системы. Но мы в данном обзоре ограничимся рассмотрением влияния на опухоль цитостатиков и облучения, поскольку описание именно их действия на химиорезистентность и стабильность ДНК входит в задачи обзора. За счет своих цитопротективных свойств аутофагия и белки теплового шока способствуют устойчивости опухолевых клеток к проводимой терапии. (Das et al., 2018а).

На основании последних данных из литературы можно предположить, что подавление реакции клеток на стресс, а именно супрессия активности аутофагии и шаперонов увеличит чувствительность к цитостатикам, радиотерапии, увеличит апоптоз опухолевых клеток, приведет к генетической нестабильности опухолей, а также гибели старых клеток и поврежденных опухолевых клеток. Аутофагия рассматривается как двуликий Янус в процессах выживания и гибели клеток, но все больше данных свидетельствует о том, что при стрессовой ситуации, вызванной терапией опухолей, аутофагия действует как механизм выживания опухолевых клеток (Das et al., 2018а).

ИНТЕГРИРОВАННЫЙ ОТВЕТ КЛЕТКИ НА СТРЕСС

Фактически все виды стресса приводят к активации четырех специфических сенсорных киназ (PERK, HRI, GCN2 и PKR). Эти киназы отвечают на такие внешние стрессы как, например, истощение аминокислот, вирусная инфекция, недостаток глюкозы, гипоксия, окислительный стресс и повреждение ДНК. Активация каждой из этих четырех киназ от любого вида стресса приводит к фосфорилированию фактора elF2a, что вызывает глобальное ингибирование синтеза белка и избирательную трансляцию мРНК активирующего транскрипционного фактора 4 (ATF4).

ATF4 связывается с такими ДНК мишенями, которые контролируют клеточное выживание, адаптацию и апоптоз (Tian et al., 2021). ATF4 – это своеобразное “бутылочное горлышко”, через которое проходят все сигнальные пути, активируемые стрессом. В частности, мишенями ATF4 являются шапероны и гены аутофагии. Аутофагия может активироваться одновременно с другими клеточными реакциями на стресс, например, с шаперонами, АА-транспортерами, метаболическими ферментами и способствовать выживанию клетки. В настоящее время обсуждается ключевая роль аутофагии в индукции плюрипотентности и активации стволового компонента в опухолях. Можно предположить, что для репрограммирования и перехода к плюрипотентности требуется активация другой программы в клетке, смена белкового содержания, экспрессия другого набора генов и рецепторов, а также включение другого типа метаболизма. Как катаболический процесс, аутофагия может участвовать в решении этой задачи.

Активация аутофагии сопровождается сменой рецепторов фокальной адгезии, индукцией эпителиально-мезенхимного перехода, секрецией цитокинов, ответственных за миграцию, увеличением стволовости и устойчивости к лекарствам. Аутофагия способствует плюрипотентности, в раковых стволовых клетках повышает экспрессию маркеров стволовых клеток, например, CD44, а также экспрессию мезенхимных маркеров, например, виментина. Аутофагия индуцирует плюрипотентность с помощью фактора плюрипотентности SOX2, подавляющего экспрессию mTOR, что еще больше усиливает аутофагию, которая необходима для перепрограммирования (Smith et al., 2019). Таким образом, ситуация напоминает змею, кусающую хвост.

При ответе на стресс клетка как бы балансирует между старением и проявлением стволовых свойств. На клетках карциномы печени было показано, что обе эти программы могут активироваться одновременно. Несмотря на то, что доксорубицин является ДНК-повреждающим агентом, вызывающем старение, было установлено, что обработка доксорубицином вызывает старение в клетках карциномы печени, но это старение сопровождается значительным увеличением экспрессии генов репрограммирования SOX2, KLF4 и c-myc, а также генов, связанных со стволовой структурой печени EpCAM, CK19 и ANXA3 (Karabicici et al., 2021).

Подобные результаты получены на клетках остеосаркомы (Tian et al., 2019). Было установлено, что доксорубицин может увеличивать миграцию и стволовость клеток остеосаркомы и быть причиной рецидива и лекарственной устойчивости. Он повышает экспрессию фактора KLF4 в клетках остеосаркомы, чем увеличивает их стволовые свойства (Tian et al., 2019). Все больше данных свидетельствует о том, что интегрированная реакция на стресс управляет пластичностью рака. В пользу этого говорят результаты, доказывающие, что ингибиторы mTOR и химиотерапевтические препараты индуцируют трансляционную активацию подмножества изоформ мРНК NANJG, SNAIL и NODAL, что приводит к возникновению фенотипов, подобным стволовым клеткам. Такие же процессы происходят при гипоксии. Эти эффекты преодолеваются с помощью лекарств, препятствующих трансляционному перепрограммированию, которое запускается фосфорилированием фактора elF2a, отвечающего за активацию интегрированного ответа на стресс (Jewer et al., 2020).

Химиопрепараты, в частности доксорубицин, вызывая гибель раковых клеток, усиливают стволовость, инвазивность и лекарственную устойчивость оставшихся опухолевых клеток (Liu et al., 2019). В клетках, переживших стресс, стволовой компонент может активироваться за счет активации гена Nanog, клетка становится более плюрипотентной и менее дифференцированной (Jewer et al., 2020). В этом случае можно говорить о некотором эволюционном упрощении таких клеток. У примитивных форм, например, у гидр, клетки выполняют несколько физиологических функций, являясь одновременно и стволовыми. Они осуществляют процесс самообновления, сохраняя определенную дифференцировку (Chakraborty, Agoramoorthy, 2012). Поэтому активация стволового компонента в опухолевых клетках может считаться примером эволюционного регресса, возвращением к эволюционно более примитивной форме. Можно утверждать, что опухолевая клетка находится в перманентном стрессе, что соответствует теории, согласно которой опухолевая клетка вообще представляет собой атавистическую эволюционно примитивную форму (Erenpreisa et al., 2022). C точки зрения эволюции, в опухолях активируются наиболее древние транскрипционные программы (Trigos et al., 2017).

Мы предполагаем, что эволюционный консерватизм интегрированного ответа на стресс и обеспечивает опухолевую прогрессию, увеличение ее злокачественного потенциала и приобретение лекарственной устойчивости. Клетки, сумевшие выжить в условиях стресса, служат источником для рецидивирующего роста. Пластичность клетки, возникновение плюрипотентности обеспечивает аутофагия, в частности митофагия, то есть удаление поврежденных митохондрий, которые продуцируют свободные радикалы. Известно, что низкая митохондриальная активность и недостаточно развитая митохондриальная сеть являются отличительными признаками стволовости (Menendez et al., 2011). Считается, что митохондрии в плюрипотентных клетках возвращаются к незрелому состоянию, в котором они пребывают в эмбриональных стволовых клетках. Если аутофагию подавить, образуются гигантские аномальные митохондрии, и клетка стареет.

Несомненно, старение также является своеобразным ответом на стресс, и активация процесса старения в опухолевых клетках является предпочтительной целью терапии. Как уже говорилось выше, в условиях стресса клетка балансирует между старением и плюрипотентностью, и этот баланс во многом определяет ингибитор аутофагии белковый комплекс mTORC1 (Menendez et al., 2011). Переход к плюрипотентности сопровождается катастрофической перестройкой метаболизма опухолевой клетки. Утрата митохондрий приводит к еще более активному гликолизу; согласно теории Варбурга, опухолевые клетки существуют преимущественно за счет гликолиза. Можно утверждать, что гликолиз более эволюционно древний путь метаболизма, поскольку окислительное фосфорилирование возникло гораздо позже, только после интеграции митохондрии в прокариотический организм. Таким образом, интегрированный ответ на стресс приводит к масштабному эволюционному упрощению опухолевой клетки, затрагивая не только адаптивные гены, но и изменяя метаболизм.

Конечно же, аутофагия регулируется на посттрансляционном уровне, но основная регуляция идет через транскрипционный фактор ATF4, который активируется при интегрированном ответе клетки на стресс. Возможно, ATF4 может служить предпочтительной терапевтической мишенью, и его супрессия позволит подавить интегрированный ответ на стресс и, в частности, снизить уровень активности аутофагии и шаперонов. Уже существуют препараты, подавляющие фосфорилирование фактора elF2a, что предотвращает активацию АТF4 (Tian et al., 2021). Например, препарат ISRIB является ингибитором интегрированного ответа на стресс и нарушает синтез транскрипционного фактора ATF4 (Tian et al., 2021). Шапероны могут, как и аутофагия, не только способствовать дифференцировке, но и поддерживать стволовость. Сообщается о роли Hsp90 в поддержании плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток и в экспрессии факторов плюрипотентности, особенно Oct4 и Nanog (Bradley et al., 2012).

Одним из адаптивных генов, поддерживающих неограниченную пролиферацию, является c-myc. Было показано, что окислительный стресс активирует сигнальные пути, отвечающие за выживание и находящиеся в зависимости от фосфорилирования фактора c-myc, которое приводит к устойчивости опухолевых клеток к окислительному стрессу (Benassi et al., 2006). В ответ на окислительный стресс опухолевая клетка использует активные формы кислорода в качестве промежуточных продуктов для выживания и активации агрессивного поведения, а также перестройки цитоскелета, лежащего в основе подвижности (Pani et al., 2010). Таким образом, окислительный стресс вносит свой вклад в метастазирование и рецидивы опухолей, он активирует адаптивные гены, которые способствуют выживанию.

Гипоксия при раке поджелудочной железы увеличивает злокачественный потенциал опухоли, в частности ее способность к метастазированию (Buchler et al., 2004). Таким образом, различные виды стресса способствуют опухолевой прогрессии и устойчивости опухолевых клеток к терапии.

СИСТЕМА ПРОТЕОСТАЗА И МНОЖЕСТВЕННАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ

Проведение длительной терапии часто сопровождается приобретением опухолевыми клетками множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Аутофагия имеет неоднозначное значение для приобретения клетками МЛУ. С одной стороны, она способствует приобретению клетками фенотипа МЛУ и защищает опухолевые клетки от химиотерапии, а с другой – может активировать апоптоз в тех клетках, в которых он неактивен. В то же время ингибирование аутофагии увеличивает чувствительность опухолевых клеток яичника с фенотипом МЛУ к проводимой химиотерапии, стимулируя апоптоз этих клеток (Liang et al., 2016). Показано, что аутофагия может быть причиной развития фенотипа МЛУ за счет ингибирования апоптоза в опухолевых клетках молочной железы (Sun et al., 2015). Можно предположить, что развитие фенотипа МЛУ также является своеобразным ответом клетки на стресс.

Относительно недавно была описана взаимосвязь между ABC-транспортерами, к которым относится P-гликопротеин, и аутофагией. Р-гликопротеин является трансмембранной помпой, которая выкачивает из опухолевых клеток лекарственные препараты в независимости от их конформации. Было показано, что уровень экспрессии ABC-транспортеров позитивно коррелирует с экспрессией LC3, Beclin 1 (маркеров активации аутофагии) и Richtor и негативно коррелирует с экспрессией Raptor в образцах опухолей толстой кишки. Было установлено, что аутофагия, которую вызывает химиотерапия, способствует устойчивости опухолевых клеток к цитостатикам паклитакселу, тамоксифену, эпирубицину и другим (Li et al., 2017).

Белки теплового шока, как и аутофагия, относятся к системе протеостаза и также участвуют в формировании фенотипа МЛУ. Было показано, что ингибирование Hsp90 приводит к деградации определенных белков и снижает устойчивость к противоопухолевым препаратам. Авторами было установлено, что экспрессия Hsp90 выше в клетках меланомы, устойчивых к мелфалану, а ингибиторы Hsp90 восстанавливают чувствительность меланомы к этому препарату. Ингибирование Hsp90 приводит к подавлению Src и его нижележащих эффекторов, к которым относятся ERK, AKT и NF-kB (Tabata et al., 2020). HSF1 является транскрипционным фактором, регулирующим белки теплового шока, он также контролирует множество путей, участвующих в становлении фенотипа МЛУ. HSF1 регулирует экспрессию MDR1/P-gp на уровне транскрипции, что следует из экспериментов с HSF1⁺ (аденовирусной конструкцией, несущей к ДНК HSF1), который связывает консенсусные элементы белка теплового шока (HSE) в промоторе гена MDR1 (Vilaboa et al., 2000). Таким образом, HSF1 может регулировать экспрессию Р-гликопротеина в условиях стресса и тем самым активировать белки теплового шока и ген mdr1 одновременно. HSF1 вызывает транскрипционную активность белков теплового шока Hsp70/Hsp27, которые защищают опухолевые клетки от апоптоза (Kim et al., 2015а).

Показано (Wang et al., 2013), что ингибитор Hsp90 препарат SNX-2112 эффективно индуцирует апоптоз и вторичный некроз в лейкозных клетках K-562/ADR. Клетки под действием этого препарата останавливали клеточный цикл. Апоптоз в этих клетках активировался митохондриями, продуцирующими цитохром с. Также этот препарат активировал каспазы 3, 8 и 9. Параллельно этим эффектам этот препарат инактивировал сигнальные пути Akt и NF-kB, что способствовало апоптозу (Wang et al., 2013). Уровень экспрессии P-гликопротеина и шаперонов, связанных с лекарственной устойчивостью, также снижался. Таким образом, авторы заключают, что ингибирование шаперонов может быть перспективным подходом к лечению лейкозов с фенотипом МЛУ (Wang et al., 2013). Ингибиторы Hsp90 на основе изоксазолонафтохинона способны непосредственно взаимодействовать с P-гликопротеином и ингибировать его АТФазную активность. Эти соединения подавляют экспрессию P-гликопротеина и снижают устойчивость к доксорубицину и паклитакселу (Dinic et al., 2019). Можно заключить, что стресс, возникающий в опухолевых клетках в результате терапии, вызывает интегрированную защитную реакцию, в которую вовлечены аутофагия, шапероны и механизмы MЛУ, которая связана с неспособностью клетки к апоптозу и экспрессией АВС-транспортеров

В то же время старение клетки, особенно ускоренное старение, которое включается в ответ на стресс или экспрессию онкогенов, также является своеобразным ответом клетки на стресс. Известно, что старые клетки более устойчивы к воздействиям разного типа, и уровень апоптоза у них снижен. Интересно отметить, что в старых лимфоцитах увеличивается уровень экспрессии P-гликопротеина, но его активность не возрастает (Vilas-Boas et al., 2011). По данным других авторов активность P-гликопротеина также увеличивается с возрастом (Aggarwal et al., 1997). Экспрессия АВС-транспортеров является адаптивной реакцией опухолевой клетки, которая приводит к рецидивам резистентных опухолей (Li et al., 2017).

СИСТЕМА ПРОТЕОСТАЗА И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ

Гибель и выживаемость клеток зависит от стабильности ДНК. Хромосомные аномалии и мутации приводят к гибели клеток, в том числе опухолевых. Перспективным подходом для терапии онкозаболеваний представляется возможность увеличения нестабильности ДНК опухолевых клеток при радио- и химиотерапии. Этот эффект также может быть достигнут при нивелировании ответа клетки на стресс при снижении уровня аутофагии и шаперонов в клетке. Применение ингибиторов аутофагии и шаперонов может способствовать подавлению DDR-ответа и угнетению репарации ДНК (Apel et al., 2008; Dubrez et al., 2020). Нарушения аутофагии ассоциированы с повреждениями ДНК, амплификацией геномных регионов и нестандартным числом хромосом (Feng et al., 2017). Известно, что модуляция шаперонов также влияет на стабильность хромосом. Инактивация Hsp70 приводит к нестабильности теломер, частым спонтанным аберрациям (Pandita et al., 2004). Мы предполагаем, что сеть протеостаза одновременно с белковым балансом регулирует и стабильность ДНК. Иными словами, сеть протеостаза регулирует процессы жизни и смерти клетки на белковом уровне и уровне ДНК. Так осуществляется контроль генетических процессов со стороны белкового или клеточного уровня, поскольку всякая биологическая система многоуровневая и регулируется сетью взаимодействий.

Как уже говорилось выше, аутофагия эволюционно консервативный процесс, который активируется в опухолевых клетках как интегральный ответ на стресс после проведения радио- и химиотерапии (Kim et al., 2015b). Аутофагия может способствовать выживанию опухолевых клеток, быть механизмом устойчивости к проводимой терапии или быть причиной их гибели. Но эффект цитопротекции можно ожидать вероятнее, чем гибель опухолевых клеток от аутофагии (Chen et al., 2009). Известно, что блокада генов аутофагии Beclin1, Atg3, Atg4b, Atg4c, Atg5 и Atg12 с помощью специфических siRNA приводит к ингибированию аутофагии и увеличению цитотоксичности радиотерапии в устойчивых к терапии опухолевых клетках (Apel et al., 2008). В опухолевых клетках наблюдается повышенный уровень аутофагии, что и является причиной их радио- и хемоустойчивости. Аутофагия активируется в ответ на повреждение ДНК. ATM позитивно регулирует аутофагию через AMPK и TSC1/2 (Zhang et al., 2015). Было установлено, что отсутствие аутофагии ингибирует репарацию ДНК, приводит к персистенции повреждений генома и быстрой клеточной гибели (Zhang et al., 2015). Белковый комплекс mTORC1 негативно регулирует аутофагию и может быть мишенью для терапии, увеличивающей нестабильность ДНК в опухолевых клетках (Condon, Sabatini, 2019).

Известно, что некоторые сенсоры повреждений ДНК, такие как FOXO3a, ATM, ATR и p53 являются важными регуляторами аутофагии, и поэтому аутофагия играет важную роль в реакциях на повреждение ДНК. Подавление или отмена аутофагии вызывает увеличение повреждений ДНК. Во время DDR-ответа аутофагия может действовать как источник энергии для поддержания остановки клеточного цикла и поддержания активности репарации ДНК. Индукция аутофагии рапамицином снижает генотоксическую активность окислительного стресса. Это исследование подтверждает цитопротективную роль аутофагии и говорит о том, что ее ингибирование может повысить чувствительность опухолевых клеток к агентам, повреждающим ДНК (Galati et al., 2019). Известно, что если повреждения ДНК оказываются нерепарируемыми, аутофагия может активировать клеточную гибель. Сигнальные пути, которые активируют аутофагию после ДНК-повреждений, затрагивают DDR-киназы ATM, ATR и ДНК-ПК, и это приводит к инактивации комплекса mTORC1, который, как уже говорилось выше, является ингибитором аутофагии (Anand et al., 2020; Juretschke, Beli, 2021).

Интересно отметить, что цитоплазматический p53 подавляет аутофагию, а ядерный p53 ее стимулирует (Lin et al., 2018). Именно p53 решает во многом судьбу клетки после повреждений ДНК. Либо повреждения ДНК репарируются, либо, если они слишком серьезны, клетка отправляется в апоптоз (Roshani-Asl et al., 2020). Множество протеинов, которые участвуют в процессе аутофагии, регулируются p53, который вовлекает в регуляцию такие белки как DRAM, DAPK и AMPK (Anand et al., 2020).

С большой вероятностью можно предположить, что митохондриальная ДНК гораздо более сильно подвержена повреждениям, чем ядерная ДНК по той причине, что расположена в непосредственной близости к месту генерации свободных радикалов. В зависимости от степени повреждения запускается либо механизм восстановления митохондриальной ДНК, либо митофагия (Anand et al., 2020). Есть предположение (Chao et al., 2021), что при гамма-облучении подавление аутофагии вызывает не связанную с апоптозом проницаемость мембраны митохондрии, в результате чего высвобождается митохондриальная эндонуклеаза G, которая перемещается в ядро и вызывает повреждения ядерной ДНК. Этими же авторами (Chao et al., 2021) было показано, что блокировка функций лизосом приводит к утечке митохондриальной ДНК в цитозоль, что приводит к образованию митохондрий без эндонуклеазы G и накоплению эндонуклеазы G в ядре. Авторы считают, что аутофагия устраняет митохондрии с повышенной проницаемостью, вызванной повреждением митохондриальной ДНК, что предотвращает нестабильность генома, опосредованную эндонуклеазой G. Этими же авторами, было показано, что эндонуклеаза G поддерживает повреждения ядерной ДНК в клетках с дефектной аутофагией. Таким образом, аутофагия ограничивает выход эндонуклеазы G из митохондрий с поврежденной митохондриальной ДНК, чтобы поддержать целостность ядерного генома (Chao et al., 2021).

Однако для поддержания стабильности ДНК непосредственно в ядре, как уже говорилось выше, аутофагия имеет большое значение. Утрата аутофагии связана с повышенным повреждением ДНК, неправильной амплификацией геномных областей и аномальным числом хромосом (Feng et al., 2017). В недавней работе раскрывается механизм, посредством которого аутофагия регулирует убиквитинирование хроматина (Wang et al., 2016). В частности, рецептор аутофагии и субстрат SQSTM1/p62 ингибирует лигазу RNF168, что приводит к подавлению убиквитинирования гистонов в ответ на разрывы двухцепочечной ДНК. Нарушение регуляции этого процесса приводит к снижению способности к восстановлению ДНК и соответствующему повышению чувствительности клеток к радиационному повреждению (Wang et al., 2016; Feng et al., 2017).

Известно, что трансфекция клеток miРНК против SQSTM1/p62 приводит к возникновению обильных очагов ядерного конъюгированного убиквитина. Таким образом, нокдаун SQSTM1/p62 увеличивает полиубиквитинирование хроматина, а сверхэкспрессия этого белка оказывает противоположный эффект. Поэтому считается, что SQSTM1/p62 является специфическим негативным регулятором убиквитинирования ДНК (Wang et al., 2016; Feng et al., 2017). Восстановление двухцепочечных разрывов обычно включает гомологичную рекомбинацию или негомологичное воссоединение концов ДНК. Авторы обнаружили, что сниженная эффективность гомологичной рекомбинации, возникающая в результате ингибирования аутофагии, восстанавливается нокдауном SQSTM1/p62. Кроме того, последующее привлечение факторов репарации, включая BRCA1, RAP80 и Rad51 нарушается при сверхэкспрессии SQSTM1/p62 и ингибировании аутофагии, но снова может быть восстановлено путем нокдауна SQSTM1/p62. Данные, полученные авторами, свидетельствуют о том, что дефицит аутофагии в результате делеции Atg3 приводит к нарушению рекрутирования факторов репарации ДНК в зависимости от SQSTM1/p62 (Wang et al., 2016; Feng et al., 2017). Убиквитинирование гистонов изменяет способность ДНК к репарации, приводя к образованию структур хроматина, способствующих сборке комплексов репарации на поврежденной ДНК. Убиквитинирование гистонов происходит вблизи двухцепочечных разрывов ДНК, что является ключевой стадией привлечения факторов репарации к месту повреждения. Рецептор-субстрат аутофагии SQSTM1/p62 деградирует, если аутофагия активна, и накапливается, если аутофагия подавлена.

Интересные результаты получены при изучении аутофагии на протоковой аденокарциноме поджелудочной железы (PDAC). Ингибирование аутофагии с помощью хлорокина приводило к значительному подавлению роста этих опухолевых клеток in vivo (ксенотрансплантация клеток PDAC под кожу голых мышей) (Yang et al., 2011). Авторы считают, что антипролиферативный эффект хлорокина был следствием угнетения аутофагии и увеличения повреждений ДНК. Ингибирование аутофагии с использованием siРНК к Atg5 значительно увеличивало количество двуцепочечных разрывов ДНК, измеренное по количеству фокусов 53BP1. По данным исследования комет, количество DSB также возрастало после обработки клеток PDAC хлорокином (Yang et al., 2011). Аутофагия играет решающую роль в патогенезе PDAC, клетки которой проявляют повышенную конститутивную аутофагию. Результаты исследования показывают, что активная аутофагия обеспечивает рост PDAC, поддерживая окислительное фосфорилирование и стабильность ДНК (Yang et al., 2011).

Киназа ATM играет центральную роль в DDR и определяет баланс между старением и апоптозом. Активированная ATM способствует аутофагии, в частности поддерживает лизосомно-митохондриальную ось, которая, в свою очередь, активирует старение и ингибирует апоптоз. Следовательно, ATM является ключевым фактором, который позволяет клеткам избежать апоптоза, вступая в старение, посредством модуляции аутофагии (Stagni et al., 2021).

Прежде всего, необходимо отметить, что аутофагия снижает уровень свободных радикалов, избавляя клетку от поврежденных митохондрий. Кроме того, повышается антиоксидантная защита в результате продукции Nrf2 при деградации KEAP1 в результате аутофагии (Hеwitt, Korolchuk, 2017). Необходимо иметь в виду, что аутофагия влияет непосредственно на репарацию DSB. Нарушения аутофагии могут ингибировать репарацию через подавление гомологичной рекомбиниции, либо усиливая протеосомную деградацию CHK1, либо увеличивая уровень SQSTM1/p62 в ядре. Ядерный SQSTM1/p62 нарушает гомологичную рекомбинацию, ингибируя убиквитинирование хроматина (Hewitt, Korolchuk, 2017).

Связующим звеном между шаперонами и аутофагией является BAG3. Это многофункциональный кошаперон Hsp70 и антиапоптотический белок, который взаимодействует с ATФазным доменом Hsp70 и играет ключевую физиологическую роль в клеточном протеостазе. Функционально взаимодействуя с Hsp70 и LC3, BAG3 доставляет полиубиквитинированные белки на путь аутофагии. Этот кошаперон обеспечивает одновременно устойчивость к апоптозу и аутофагическую активность. Одновременно BAG3 регулирует ключевые физиологические функции, включая адгезию, метастазирование и ангиогенез (Kogel et al., 2000).

Белки теплового шока также стабилизируют геном. Киназа CHK1 – первый фактор репарации ДНК, который связан с Hsp90. Взаимодействие между CHK1 и Hsp90 продемонстрировано иммунопреципитацией. Ингибирование Hsp90 запускает деградацию CHK1 по протеосомному пути. Клетки, обработанные ингибитором Hsp90 и собранные в разное время после облучения, имеют более длинные хвосты комет, чем просто облученные клетки. Это свидетельствует о том, что ингибирование Hsp90 не только замедляет сборку факторов репарации, но и угнетает сам процесс репарации ДНК (Sottile, Nadin, 2018). Белок Hsp90 необходим для поддержания фокусов γH2X и эффективной репарации повреждений ДНК после радиации. Нокаут по Hsp90 усиливает чувствительность к радиации: облучение крысиных фибробластов, утративших HSF1, приводит к снижению фокусов p53BP в сайте повреждений ДНК и снижает способность к репарации DSB по сравнению с клетками дикого типа (Sottile, Nadin, 2018).

Белки Hsp70 и Hsp27 ассоциациируются с ферментами восстановления целостности ДНК после удаления азотистого основания, такими как AP-эндонуклеаза человека и ДНК-гликозилаза урацила (Mendez et al., 2000). Это наблюдение предполагает значительную роль белков теплового шока в механизмах репарации ДНК. Способность DDR реагировать на повреждение ДНК контролируется балансированием между синтезом и деградацией клиентских белков, которое регулируется Hsp. Hsp90, в частности, связывается с белками DDR и предотвращает их убиквитинирование и деградацию. Эти белки включают CHK1, MLH1, MLH2, APE1 и другие (Ikwegbue et al., 2019). Повреждение ДНК запускает сложный сигнальный каскад, включающий множество событий поэтапного фосфорилирования белков. Обнаружено, что остаток треонина 7 в белке Hsp90 фосфорилируется сразу после повреждения ДНК. Фосфорилированный Hsp90 затем накапливается в местах двухцепочечных разрывов и образует очаги репарации с медленной кинетикой, соответствующей кинетике сложного повреждения ДНК (Quanz et al., 2012).

Фосфорилирование Hsp90а зависит от фосфатидилинозитол-3-киназ (PI3K), включая ДНК-ПК. ДНК-ПК играет важную роль в восстановлении разрывов двухцепочечной ДНК путем негомологичного воссоединения концов и передаче сигналов о повреждении ДНК (Quanz et al., 2012). С Hsp90 взаимодействует ядерный опухолевый супрессор BRCA1, который связан с репарацией двунитевых разрывов ДНК и принимает участие в гомологичной рекомбинации. Поскольку опухолевые клетки, экспрессирующие высокие уровни BRCA1 устойчивы к радиации и нескольким классам химиотерапевтических агентов, снижение экспрессии BRCA1 с помощью ингибиторов Hsp90 может восстановить чувствительность к противоопухолевым агентам (Pennisi et al., 2015). Восстановление стабильности ДНК после проведения химио- и радиотерапии позволяет опухоли выжить и вновь начать пролиферировать, что может иметь значение для последующего рецидива.

СИСТЕМА ПРОТЕОСТАЗА И АПОПТОЗ

Взаимосвязь между аутофагией и апоптозом активно изучается в последние годы. Нокдаун Beclin1 или Atg5 увеличивают чувствительность множественной миеломы к апоптозу, вызванному доксорубицином. Beclin1 формирует комплекс с PI3K III и стимулирует образование аутофагосом, активируя PI3K III. В то же время Bcl2 непосредственно связывает Beclin1 и блокирует его способность к индукции аутофагии (Pan et al., 2011). Существуют исследования, показывающие, что ингибирование аутофагии индуцирует апоптоз. Было показано, что нокдаун DEPTOR, который является ингибитором обоих комплексов mTOR, индуцирует апоптоз, увеличивает чувствительность к доксорубицину, подавляет аутофагию и PI3K/Akt-сигналинг в клетках множественной миеломы (Zhang et al., 2013). Активная аутофагия в сочетании с дефектами апоптоза может способствовать злокачественной дифференцировке опухоли, что приводит к более злокачественному фенотипу опухолевых клеток и плохому прогнозу заболевания. Аутофагия поддерживает клеточный энергетический баланс и при ингибировании цитопротективной аутофагии может появиться шанс и для активации апоптоза. Так, известно, что увеличенный уровень аутофагии в опухолевых клетках поджелудочной железы с низкой активностью гена smad4 коррелировал со сниженной радиочувствительностью.

Процесс аутофагии может использоваться клетками для предотвращения или задержки апоптотической гибели в ответ на повреждение ДНК, поэтому ингибирование аутофагии может быть важным подходом для увеличения радиочувствительности опухолевых клеток (Wang et al., 2018). Считается, что опухолевые клетки имеют характерный метаболизм, в основном вызванный изменениями в сетях передачи сигналов, а не мутациями в генах, ответственных за метаболизм. Было установлено (Gremke et al., 2020), что некоторые опухолевые клетки с приобретенной лекарственной устойчивостью проявляют чувствительность к ингибиторам метаболизма.

За клеточный метаболизм во многом отвечает комплекс mTORC1. Именно он отвечает за метаболическую уязвимость опухолевых клеток. Он способствует устойчивости к химиотерапии и одновременно подавляет аутофагию (Gremke et al., 2020). Опосредованное mTORC1 подавление аутофагии необходимо и достаточно для создания метаболической уязвимости, приводящей к энергетическому кризису и апоптозу. Этими же авторами было установлено (Gremke et al., 2020), что конститутивная активация передачи сигналов от mTORC1 в опухолях с приобретенной устойчивостью к химиотерапии подавляет аутофагию и лишает клетки мощного механизма выживания за счет метаболических нарушений, вызванных различными соединениями, нацеленными на метаболизм. Аутофагия имеет решающее значение для выживания клеток в условиях энергетического стресса, вызванного нехваткой питательных веществ (Gremke et al., 2020).

Тройной негативный рак молочной железы очень трудно поддается лечению из-за приобретенной устойчивости к химиотерапии. Было показано, что BAG3 имеет повышенную экспрессию при химиорезистентном раке молочной железы. Снижение экспрессии BAG3 с помощью лентивирусной трансдукции siRNA увеличивает чувствительность опухолевых клеток молочной железы к терапии с помощью 5-фторурацила, доксорубицина и доцетаксела. На опухолевых клетках молочной железы было показано, что повышенная устойчивость к апоптозу связана с усиленной цитопротективной аутофагией, повышенной экспрессией кошаперона BAG3, BAG3-зависимой стабилизацией белков Bcl-2, способствующих выживанию, и индукцией изменений, подобных эпителио-мезенхимному переходу в экспрессии генов (Das et al., 2018b).

Таким образом, процессы аутофагии часто являются причиной лекарственной устойчивости опухолевых клеток, они стабилизируют геном и снижают способность к апоптозу. В то же время в терапевтических подходах к лечению рака молочной железы, о котором говорилось выше, не все так однозначно. Наблюдения говорят о том, что нарушения пути PI3K/AKT/mTOR выявляется более, чем в 70% опухолей молочной железы (Ozates et al., 2021). Этими авторами было установлено действие препарата AZD3463 как антиканцерогенного агента, который одновременно индуцирует апоптоз и аутофагию. В результате экспериментов было показано, что рапамицин, подавляющий mTORC1-сигналинг и индуцирующий аутофагию, усиливает действие AZD3463. Внесение в культуру опухолевых клеток молочной железы препарата AZD3463 совместно с рапамицином значительно снижало выживаемость опухолевых клеток, при этом увеличивалась активность аутофагии, апоптоза и увеличивалась доля клеток на границе фаз G₀/G₁ (Ozates et al., 2021). Эти результаты показали, что индукция аутофагии снижала устойчивость опухолевых клеток к терапии и вызывала в них апоптоз (Ozates et al., 2021). Однако, несмотря на встречающиеся противоречивые данные, считается, что аутофагия промотирует лекарственную устойчивость.

В работах последних лет пристальное внимание уделяется оксидоредуктазе, содержащей домен WW; ей отводится решающая роль в индукции апоптоза и подавлении аутофагии в опухолях различного гистогенеза (Zhao et al., 2021). Трудность терапии эпителиального рака яичника паклитакселом заключается в высокой хеморезистентности этих раковых клеток. На клеточной линии карциномы яичника А2780 было установлено, что паклитаксел вызывал аутофагичекский флюкс в этих клетках, увеличивая экспрессию генов аутофагии, например, Beclin1, LC3, и снижая уровень субстрата аутофагии SQSTM1/p62 (Zhao et al., 2021). Данные конфокальной микроскопии подтверждали визуально отмеченное накопление аутофагосом. Эксперименты по трансфекции оксидоредуктазой, содержащей домен WW, показали, что этот фермент активирует mTORC1 и ингибирует аутофагию, он также увеличивает апоптоз в исследуемой клеточной линии, обработанной паклитакселем (Zhao et al., 2021).

Несмотря на очевидный прогресс в понимании взаимосвязи между апоптозом и аутофагией, основные регуляторы этих процессов остаются неизвестными. Роль N-концевого аргинилированного комплекса BIP (R-BIP)/Beclin1/p62 исследуется с целью установления роли этого комплекса в перекрестных взаимодействиях между апоптозом и аутофагией. На модели ксенотрансплантации голым мышам клеток колоректального рака была оценена противоопухолевая эффективность комбинированного лечения. Было показано, что бортезомиб в сочетании с митомицином С синергически индуцировал цитотоксичность и апоптоз. Эта комбинация лекарств инактивировала киназу Akt и индуцировала дефосфорилирование Beclin1. Дефосфорилирование Beclin1 было причиной расщепления Beclin1 и разрушения комплекса (R-BIP)/Beclin1/p62, что приводило к переключению аутофагии на индукцию апоптоза. Эта комбинация лекарств значительно подавляла рост внутрибрюшинного ксенотрансплантата. Результаты показали, что BIP обладает анти-апоптотическими свойствами и действует как индуктор аутофагии. Таким образом, было установлено, что сочетанное воздействие митомицина С и бортезомиба индуцирует апоптоз, инактивирует Akt, разрушает BIP/Beclin1/p62 и снижает аутофагию (Song et al., 2018).

Молекулярный шаперон Hsp70 прямо или косвенно регулирует внутренние и внешние пути апоптоза. Нокдаун Hsp70 повышает чувствительность клеток к апоптозу. Hsp70 влияет на высвобождение цитохрома с, активность каспаз, образование активных форм кислорода и фрагментацию ДНК. Ингибируя активность каспаз, этот шаперон блокирует внешние и внутренние пути апоптоза. Кроме того, Hsp70 блокирует TNF-α опосредованный апоптоз, подавляя этим внешний путь апоптоза (Kumar et al., 2016).

Вызванная стрессом гибель клеток находится под контролем семейства регуляторов апоптоза Bcl-2. Клетки, подверженные стрессовым условиям, имеют повышенную экспрессию Hsp70. Этот молекулярный шаперон действует на нескольких уровнях для подавления индуцированных стрессом апоптотических сигналов некоторых членов семейства Bcl-2. Он восстанавливает и стабилизирует развернутые белки и индуцирует повторный синтез поврежденных белков. Поэтому синтез Hsp70 может считаться необходимым механизмом для восстановления, выживания клеток и их адаптации в летальных условиях (Roufayer, Kadry, 2019).

Белки протеостаза, обладающие шаперонной активностью, защищают клетки от резких изменений окружающей среды. Во время онкогенеза эти взаимодействия шаперонов интенсивно реконструируются таким образом, что становятся выгодны для трансформирующейся клетки. Они ускоряют эволюцию опухоли, приводя к химиорезистентности и снижая ее способность к апоптозу. Шапероны необходимы для выполнения белком p53 своей функции онкосупрессора, но эти же шапероны действуют иначе при мутации p53. Известно, что они “разматывают” мутантный белок p53, обнажая участки, склонные к агрегации. Это приводит к выключению других белков онкосупрессоров, что вызывает ингибирование апоптоза и химиорезистентность (Wawrzynow et al., 2018).

Система протеостаза, включающая, в частности, шапероны и аутофагию, формирует разветвленную сеть взаимодействий, позволяющую чувствовать малейшие изменения гомеостаза. Терапевтические воздействия включают интегральный клеточный ответ на стресс, приводящий к химио- и радиорезистентности опухолевых клеток. Последствием такого ответа может явиться стабилизация генома и снижение способности к апоптозу. Подавление систем аутофагии и шаперонов позволит увеличить генетическую нестабильность опухолей, увеличить апоптоз, привести к сбою процессов синтеза и деградации белков. Таким образом, ингибирование систем протеостаза позволит модулировать клеточные процессы на клеточном и белковом уровне, а также на уровне ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате интегрированного ответа опухолевой клетки на стресс, который часто активирует проводимая терапия, клетка движется по определенным “рельсам”, приобретая все большую автономность и злокачественность. Это дает ей возможность прогрессировать гораздо быстрее, чем это позволили бы ей сделать случайные мутации. В числе прочих реакций на стресс активируются аутофагия и шапероны. Это позволяет клетке обрести все большую независимость от микроокружения, приобрести стволовые свойства и лекарственную устойчивость, избежать апоптоза, восстановить стабильность ДНК и в дальнейшем активно пролиферировать, приводя к рецидивам онкозаболеваний. По всей видимости, ответ на стресс сопровождается активацией адаптивных генов, способствующих выживанию, и приводит к определенному эволюционному упрощению, позволяющему клетке активно делиться. Понимание этих механизмов делает возможным разработку новых терапевтических подходов, основанных на нивелировании клеточного ответа на стресс.