Хитин мухи черная львинка Hermetia illucens привлекает внимание исследователей в связи с возможностью промышленного разведения насекомого и получения возобновляемого сырья, обладающего биологической активностью. Жизненный цикл мухи включает стадию куколки, из которой вылупляется имаго. После вылета взрослой мухи остаются пустые пупарии, представляющие собой хитин-содержащий экзувий. Хитин является основой экзоскелета членистоногих, обеспечивает жесткость и структурную целостность; выделенный в чистом виде хитин характеризуется также иммуномодулирующими, противомикробными, противогрибковыми и сорбционными свойствами (Скрябин и др., 2002; Lenardon et al., 2010; Варламов и др., 2020).
В организме насекомых хитин присутствует в комплексе с белками (Henriques et al., 2020) и его содержание варьирует от 0.27% у пчелиного расплода, до 5% у мучных червей (Finke, 2013). По литературным данным личинки черной львинки 5-го возраста содержат от 4.5% (Caruso et al., 2014) до 8.7% хитина (Diener et al., 2009). После вылета мухи кутикула, содержащая хитин, может быть использована как биосорбент, в том числе и как сорбент для получения препаратов пробиотических бактерий, усиливающий их выживаемость в кишечном тракте и пробиотическую эффективность.
Цель исследования – изучение поверхности кутикулы куколки H. illucens до и после нанесения суспензии молочнокислых пробиотиков, щадящего высушивания и измельчения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Препарат биомассы кутикул куколок после вылета мух H. illucens получен при содержании личинок насекомого на комбикорме ПК-3 Раменского комбината хлебопродуктов, Россия. Кутикулу измельчали растиранием в фарфоровой ступке и стерилизовали термически в сухожарном шкафу при 160°С 2 ч.
Согласно приведенному в паспорте ВКПМ описанию, штамм пробиотических бактерий Lactobacillus acidophilus В 2707 выращивали сутки на стерильном обезжиренном молоке, затем смешивали со стерильным порошком кутикулы в соотношении 1 : 2, вес/объем. Высушивали при 45°С в течение 12 ч и измельчали растиранием в фарфоровой ступке.
Сканирующую электронную микроскопию осуществляли на микроскопе TESCAN MIRA 3 LMH (TESCAN, Czech Republic). Препараты в виде порошка наносили на поверхность двустороннего проводящего скотча для микроскопии Supplies (США), наклеенного на предметный столик. Напыление осуществляли золотом на установке Q150R ES Plus (Quorum Technologies Ltd, Соединенное Королевство). Оценку элементного состава и размеры частиц определяли с использованием системы энергодисперсионного анализа Oxford AZtecOne X-act (Oxford Instruments, UK) – программного обеспечения к микроскопу TESCAN MIRA 3 LMH (TESCAN, Czech Republic) при ускоряющем напряжении 10 квт и количестве накопленных импульсов 5 млн. Количественные расчеты осуществлялись автоматически программой AZtecOne Quant. Статистические различия оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа в программе Statistica 10 (Anova). Для первичной обработки данных и построения диаграмм использовали Microsoft Excel 2019.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Возможность получения сорбированного на носителе пробиотика во многом определяется структурной организацией сорбента. Электронные фотографии частиц интактной кутикулы куколок H. illucens демонстрировали упорядоченную структуру повторяющихся шестиугольных единиц (рис. 1а, 1б), поверхность и пространство между которыми в процессе получения пробиотика на носителе заполнены культуральной жидкостью, что видно на рис. 1 в по изменению рельефа поверхности сорбента. При высушивании частиц кутикулы с иммобилизованным пробиотиком, образовалась пленка, покрывающая клетки микроорганизмов, которая, по-видимому, выполняет функцию защиты лактобактерий, так как они сохранили свою бациллярную морфологию, не сморщены и не сплющены (рис. 1г).
Рис. 1.
Поверхность шестиугольных единиц кутикулы куколок H. illucens: а – увеличение 1480×; б – 3840×; в – частицы кутикулы с нанесенной культуральной жидкостью лактобациллы, 1310×; г – лактобациллы (отмечено стрелками) под пленкой на поверхности носителя, 24600×.
Значительные изменения в структуре частиц интактной измельченной кутикулы наблюдались при медленном 12-часовом режиме высушивания порошка сорбента с иммобилизованным пробиотиком без применения высоких температур (45°С). За этот период, вероятно, относительно крупные частицы кутикулы (рис. 2а) подверглись ферментативному гидролизу культуральной жидкостью с лактобациллой, что привело к деструкции склеротинизированного хитин-белкового комплекса и проявилось в образовании мелких частиц (рис. 2б), включая образование наночастиц (рис. 2в). Средний диаметр частиц порошка измельченной кутикулы куколок составил D 845.3 ± 109.1 мкм, в то время как средние размеры частиц кутикулы с пробиотиком были достоверно меньше, D 63.4 ± ± 13.9 мкм (F = 276.1; P ≤ 0.001), и не превышали D 255 мкм. Распределение размерных фракций частиц в % (без учета наночастиц) приведено на рис. 3. Средний размер наночастиц составил D 54 ± ± 18 нм.
Рис. 2.
Фото частиц измельченной кутикулы куколок H. illucens: а – частицы интактной кутикулы, увеличение 53×; б – высушенные частицы с пробиотиком, 311×; в – наночастицы кутикулы, 109 000×. Отрезками на фото 2 б и 2 в отмечены максимальные диаметры (D) частиц, которые учитывали при анализе размерных фракций.
Рис. 3.
Распределение размерных фракций частиц, %: а – препарат пробиотик на частицах кутикулы; б – измельченная интактная кутикула.
Процентный состав основных элементов кутикулы куколок H. illucens представлен в табл. 1.
Таблица 1.
Элементный состав порошка кутикулы куколок H. illucens и комплекса кутикулы с культуральной жидкостью L. acidophilus В 2707
| Кутикула | Кутикула с пробиотиком | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Элемент | % | σ | С/N | % | σ | С/N |
| C | 61.53 | 0.16 | 8.7 | 68.24 | 0.29 | 52.5 |
| N | 7.08 | 0.23 | 1.30 | 0.40 | ||
| O | 28.02 | 0.09 | 26.74 | 0.15 | ||
| Na | 0.09 | 0.01 | 0.41 | 0.01 | ||
| Mg | 0.38 | 0.01 | 0.24 | 0.01 | ||
| P | 0.71 | 0.01 | 0.51 | 0.03 | ||
| K | 0.66 | 0.01 | 0.66 | 0.02 | ||
| Ca | 1.53 | 0.02 | 1.90 | 0.03 | ||
| Всего | 100.00 | 100.00 | ||||
Элементный состав комплекса кутикулы куколок H. illucens с внесенной культуральной жидкостью с L. acidophilus В 2707 показал отличия от исходной кутикулы не в качественном отношении, а в количественном соотношении элементов. В 6 раз увеличилась величина С/N за счет снижения доли азота, что коррелирует с предположением о расщеплении хитин-белкового комплекса кутикулы и выявленном уменьшении размеров частиц сорбента. Повысилась доля натрия и несколько повысилось содержание кальция, а магния и фосфора уменьшилось, по-видимому, за счет химического состава нанесенной на кутикулу органики и перераспределения удельного содержания компонентов.
Пробиотик, иммобилизованный на сорбенте из микрочастиц кутикулы куколок H. illucens, был протестирован в рационе цыплят. Исследования проводились в условиях СГЦ “Загорское ЭПХ” на бройлерах кросса “Росс 309” в клеточных батареях типа Р-15, по 35 голов в каждой группе, с суточного до 35 – суточного возраста выращивания. Нормы посадки, световой, температурный, влажностный режимы, фронт кормления и поения соответствовали рекомендациям ФНЦ ВНИТИП РАН (Фисинин, Егоров, 2018) и для всех групп были одинаковыми. Включение препарата в дозе 0.5 г/т комбикорма повысило прирост живой массы цыплят в конце опыта на 5.7% по сравнению с бройлерами контрольной группы, и обеспечило высокую сохранность птицы. При этом затраты корма на 1 кг прироста живой массы в опытной группе за период выращивания снизились на 3.5% за счет повышения переваримости и использования питательных веществ корма, что может быть связано с активностью пробиотика.
Таким образом, получена обогащенная кальцием, магнием и фосфором биопленка лактобактерий L. acidophilus В 2707 на сорбенте, состоящем из микро частиц кутикулы куколок черной львинки H. illucens, включая наночастицы, что позволило получить пробиотический препарат с высокой биологической эффективностью.
Работа выполнена в рамках реализации федеральной программы поддержки университетов “Приоритет 2030”.