Для защиты генетического материала от гидролиза системами рестрикции–модификации вирусы, плазмиды и транспозоны используют ряд стратегий, одна из которых – продукция антирестрикционных белков. К ним относятся такие ингибиторы рестриктаз, как Ocr, ArdA и ArdB [1–3]. Некоторые антирестриктазы (Ocr и ArdA) относятся к ДНК-миметиками, т.е. структурно и электростатически имитируют В-форму ДНК и за счет этого функционируют как конкурентные ингибиторы ферментов рестрикции [4, 5]. Белок ArdB не относится к ДНК-миметикам, так как его структура не имеет ничего общего со структурой ДНК [6]. Ранее была высказана гипотеза, согласно которой механизм действия белков семейства ArdB состоит в том, что они неспецифически связываются с ДНК [7], поэтому рестриктаза I типа, транслоцируя ДНК перед ее гидролизом, “сталкивается” с молекулой антирестрикционного белка. В результате R-субъединица рестриктазы образуется комплекс с ArdB, что блокирует транслокацию и соответственно рестрикцию [8]. Однако пока это только неподтвержденная гипотеза.
Антирестрикционная активность ArdB описана А. Белогуровым (А. Belogurov) и др. [9] для представителя семейства IА ‒ EcoKI. А D. Serfiotis-Mitsa и соавт. [10] показали, что ArdB ингибирует рестриктазы из семейств IВ, IС и ID. Однако авторы не сравнивали активность ArdB против семейств IA и IB системы рестрикции–модификации I типа (RM-I), так как гены исследованных рестриктаз были локализованы в хромосомах бактерий неизогенных штаммов.
В представленной работе проведено сравнение антирестрикционной активности ArdB по отношению к ферментам EcoKI и EcoAI системы RM-I в штамме Escherichia coli TG1.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные штаммы и условия культивирования. Штамм Escherichia coli TG1 (thi relA supE44 hsdR17 hsdM Δ(lac-proAB) [F' traD36 proAB lacIqZ ΔM15]) был получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) НИЦ “Курчатовский институт” (Москва, Россия). Клетки культивировали в среде LB (“Диа-М”, Россия) с добавлением антибиотиков: ампициллин (400 мкг/мл), канамицин (80 мкг/мл) или хлорамфеникол (20 мкг/мл). Агаризованная среда содержала 1.5% Бактоагара (“Диа-М”). Верхний слой содержал 0.7% Бактоагара и при индукции промотора гена PrhaB – 2 г/л рамнозы (“Диа-М”).
Конструирование плазмид. В качестве источника гена ardB использовали конъюгативную плазмиду R64, в качестве источника генов, определяющих экспрессию EcoKI, – хромосому штамма E. coli MG1655 (ВКПМ НИЦ “Курчатовский институт”). В качестве источника генов, определяющих экспрессию EcoAI, использовали хромосому E. coli NK354 [10].
ПЦР-амплификацию клонированных генов, эндонуклеазную обработку, электрофорез в агарозном геле, изолирование фрагментов ДНК проводили по общепринятой методике [11].
Наборы последовательно расположенных генов hsd (hsdS, hsdR, hsdM) с конститутивными промоторами, определяющими экспрессию систем рестрикции–модификации EcoKI и EcoAI, были клонированы в вектор pACYC184 по сайтам рестрикции BamHI, HindIII.
Полученные конструкции представлены в табл. 1.
Таблица 1.
Плазмиды, использованные в работе
| Плазмида | Описание | Источник |
|---|---|---|
| pAM35 | В вектор pACYC184 вставлены гены субъединиц S, M и R рестриктазы EcoAI под контролем собственного промотора, Cmr | Эта работа |
| pACYCEcoKI | В вектор pACYC184 вставлены гены субъединиц S, M и R рестриктазы EcoКI под контролем собственного промотора, Cmr | Эта работа |
| pTZArdB | Вектор pTZ57R содержит ген ardB из плазмиды R64 под контролем промотора Plac, Apr | [12] |
| pArdBRam | Вектор pRhamhIL-10LT содержит ген ardB из плазмиды R64 под контролем сильного, индуцируемого рамнозой промотора гена rhaB, Kmr | Эта работа |
Трансформацию бактерий плазмидами проводили кальциевым методом [11].
Анализ ферментативной активности рестриктаз. Эндонуклеазную активность ферментов определяли с использованием фаговой методики [13] – по эффективности посева (ЕОР – efficiency of plating) фага λ.0 – и выражали как отношение числа бляшек на газоне штамма E. coli TG1 с тем или иным набором плазмид к их числу на газоне того же штамма, не несущего плазмид. Активность рестриктаз оценивали по снижению ЕОР по отношению к штамму TG1 без плазмид.
Экспрессия и анализ антирестрикционной активности ArdB. Для проверки антирестрикционной активности клетки инкубировали в среде LB в течение 4 ч с аэрацией 200 об/мин с последующим добавлением фага λ (любезно предоставлен проф. R. Devoret, Laboratoire d’Enzymologie, Centre National de la Recherche Scientifique, Франция) и высевом на агаризованную среду. Величину EOP оценивали как отношение числа полученных негативных колоний на газоне с исследуемыми клетками к числу негативных колоний, образованных E. coli TG1.
Для индукции экспрессии гена, определяющего синтез ArdB(R64) под контролем промотора PrhaB, в среду LB добавляли рамнозу (2 мг/мл) через 2 ч после засева (OD600 ~ 0.1).
Уровень экспрессии ArdB контролировали методом электрофореза в 15%-ном ПААГ в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) с окрашиванием Кумасси G-250 [14].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для оценки антирестрикционной активности ArdB клетки E. coli TG1 трансформировали плазмидами, содержащими гены системы RM-I: p-ACYCEcoKI (семейство IA) или pAM35 (семейство IB), – и плазмидами с геном ardB: pTZArdB или pArdBRam. Их исследовали по отдельности или в комбинации (рестриктаза + антирестриктаза). В результате отслеживали влияние трех разных концентраций ArdB в клетке: с плазмидой pTZArdB (ardB под промотором гена Plac, но без индукции ИПТГ), pArdBRam с промотором гена PrhaB, который сильнее Plac, и pArdBRam с добавлением рамнозы для индукции экспрессии с промотора PrhaB.
На полученные трансформанты высевали фаг λ.0 для определения ЕОР, как описано выше. Результаты проведенных экспериментов представлены в табл. 2.
Таблица 2.
Антирестрикционная активность ArdB
| Штамм E. coli | EOPa | Штамм E. coli | EOP |
|---|---|---|---|
| EcoАI (семейство IВ) | EcoKI (семейство IA)b |
||
| TG1 | 1.00 ± 0.11 | TG1 | 1.0 ± 0.11 |
| TG1-pAM35 | (5.5 ± 1.78) × 10–2 | TG1-pACYCEcoKI | (4.7 ± 2.12) × 10–4 |
| TG1-pAM35-pTZArdB | (1.6 ± 0.23) × 10–1 | TG1-pACYCEcoKI-pTZArdB | (4.7 ± 0.52) × 10–2 |
| TG1-pAM35-pArdBRam (без индукции) | (2.9 ± 0.15) × 10–1 | TG1-pACYCEcoKI-pArdBRam + индукция | (3.9 ± 0.89) × 10–1 |
| TG1-pAM35-ArdBRam + индукция | (5.7 ± 0.95) × 10–1 |
[i] a Эффективность посева фага λ.0 определяли как отношение числа бляшек, образованных трансформированными клетками E. coli, к числу бляшек, образованных штаммом TG1; чем меньше это соотношение, тем выше эндонуклеазная активность исследуемого фермента. Представлены средние результаты трех независимых экспериментов.
b Положительный контроль.
Как видно из данных, представленных в табл. 2, рестрикционная активность эндонуклеазы EcoАI, экспрессируемой трансформантом E. coli TG1-pAM35, значительно ниже, чем EcoKI в клетках E. coli TG1-pACYCEcoKI: снижение EOP на 1.5 и на 4 порядка соответственно. По всей видимости, это обусловлено разным числом сайтов узнавания этих рестриктаз в геноме фага λ (5 для EcoКI и 1 для EcoАI).
По результатам экспериментов можно заключить, что белок ArdB активен в отношении EcoАI – типового представителя семейства IВ системы RM-I. Даже экспрессия ArdB с относительно слабого лактозного промотора вызывала частичное восстановление уровня ЕОР. При экспрессии ArdB с более сильного промотора PrhaB выявлено повышение антирестрикционной активности ArdB, связанное с увеличением количества белка в клетке (рис. 1).
Рис. 1.
Электрофоретический анализ лизатов клеток E. coli TG1. Дорожки: 1 – маркер молекулярной массы белков PageRuler Unstained Protein Ladder (“Thermo Fisher Scientific”, США); 2 – E. coli TG1; 3 – E. coli TG1-pAM35-pArdBRam без индукции; 4 – E. coli TG1-pAM35-pArdBRam + рамноза.
Полученные результаты можно рассматривать как важное подтверждение упомянутых выше результатов D. Serfiotis-Mitsa и др. [10] о способности ArdB ингибировать активность EcoAI.
Сравнение эффективности ингибирования активности двух различных RM-систем белком ArdB позволяет выдвинуть гипотезу о неспецифичности его работы, то есть способности ингибировать RM-I независимо от последовательности сайта узнавания.
На основании данных, представленных в табл. 2, можно говорить о проявлении антирестриктазной активности ArdB как против эндонуклеаз семейств IA, так и IB (EcoKI и EcoAI соответственно). Отметим, что для этих экспериментов EcoKI и EcoAI экспрессировали, используя изогенные штаммы E. coli TG1. Эффективность ингибирования EcoKI и EcoAI с помощью ArdB практически одинакова и для обеих эндонуклеаз составляет более 98% (табл. 2). Эндонуклеазы EcoAI и EcoKI узнают разные последовательности ДНК [15, 16], поэтому одинаковую эффективность ингибирования их активности можно рассматривать как подтверждение высказанной гипотезы о неспецифичности ArdB относительно нуклеотидной последовательности ДНК, узнаваемой S-субъединицей комплекса RM-I. Скорее всего, ArdB распознает пространственную структуру ДНК в сайте расщепления рестриктазой или вблизи него.
Ранее в работах Г.Б. Завильгельского и И.В. Манухова [7, 8] был предположен механизм работы ArdB, объясняющий природу его антирестрикционной активности. В частности предполагалось, что ArdB ингибирует транслокацию ДНК R-субъединицами комплекса RM-I и, как следствие, независимо от работы S-субъединицы комплекса, а значит и от последовательности узнаваемого ею сайта. Теперь нами подтверждено одно из основных следствий этой гипотезы ‒ универсальность механизма действия ArdB. Таким образом, вся накопленная к настоящему времени информация по особенностям структуры, каталитической активности и другим важным свойствам ArdB вполне согласуется с гипотезой, хотя ее доказательность нуждается в дальнейшей проверке.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (22-74-00027). Теоретическая оценка применимости результатов работы в биотехнологии, обзор литературы и редактирование текста публикации были выполнены Мануховым Ильей Владимировичем при финансировании Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект 1022060200069-0-1.6.2;1.6.4;1.6.5;1.6.10;1.6.19 по теме “Разработка технологии рационального и высокопродуктивного использования агро- и биоресурсов, их эффективной переработки и получения безопасных и качественных источников пищевых и не пищевых продуктов”).
В работе не использовались животные в качестве объектов исследования.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.