Гибридизация на твердой поверхности

М. Zwick с сотрудниками [2] первыми использовали слайды “Affymetrix Chip Design Group” (США) с ковалентно связанными олигонуклеотидами для селекции геномных фрагментов (метод MGS, microarray-based genomic selection).

Протокол MGS включает пять основных этапов (рис. 1):

1) расщепление геномной ДНК на случайные фрагменты длиной 300 п.н;

2) репарация концевых фрагментов ДНК с добавлением 3'-выступающих остатков аденина и присоединение уникальных адаптеров с 5'-выступающим тимидином;

3) гибридизация фрагментов ДНК с комплементарными олигонуклеотидами на микрочипе высокой плотности;

4) элюирование фрагментов ДНК, связанных с зондами;

5) амплификация выделенных фрагментов с помощью праймеров, интегрированных в адаптеры.

В методе использовали перекрывающиеся гибридизационные зонды к обеим цепям дуплекса, при этом каждая цепь перекрывалась зондами от 1.5 до 4 раз. На одном слайде содержалось 385 тыс. гибридизационных зондов длиной от 50 до 93 нуклеотидов, позволяющих проводить изотермическую гибридизацию. Зонды покрывали фрагмент генома размером от 4 до 5 млн.п.н. Позднее их число увеличили до 2.1 млн. Эти зонды потенциально могут связаться с 34 млн.п.н. геномной последовательности [3, 4].

Аналогичным методом [5] выделяли более 200 тыс. экзонов для секвенирования. В качестве гибридизационных зондов были выбраны олигонуклеотиды к кодирующей последовательности экзона длиной >60 н., перекрывающие последовательность экзона со сдвигом 20 н. Всего использовали в работе 7 слайдов (“Roche NimbleGen”, США), каждый из которых содержал 385 тыс. зондов. В зависимости от применяемого протокола от 55 до 85% выделенных фрагментов ДНК содержали целевые последовательности. Метод позволяет секвенировать до 98% всех целевых экзонов.

Т. Albert и соавт. [6] ввели в схему дополнительную процедуру ‒ амплификацию фрагментов ДНК перед гибридизацией на микрочипе. Секвенирование всего экзома с использованием гибридизации на микрочиповых слайдах доказало свою полезность для выявления редких вариантов генов и мутаций, вызывающих заболевания [7, 8]. Для обогащения 1000 генов из транскриптома хлопка А. Salmon и др. [9] использовали 135 тыс. зондов, содержащихся на слайдах “Roche NimbleGen”.

Nelson с сотрудниками [10] удалось повысить эффективность обогащения целевых мишеней при блокировании побочной гибридизации адаптерных частей зондов с геномной ДНК и дублировании стадии гибридизационного обогащения целевых мишеней.

Для выделения последовательностей генов BRCA1 и TP53 в микрофлюидных кассетах микрочипового ДНК-синтезатора Geniom (“Geniom”, Германия) синтезировали 50-членные олигонуклеотиды [11, 12]. На основе этого синтезатора разработали автоматизированный метод HybSelect для подготовки образцов для высокопроизводительного секвенирования. Метод позволяет параллельно проводить обогащение ≤8 образцов размером от 125 т.п.н. до 1 млн.п.н. Метод был апробирован на анализе 115 генов, ассоциированных с развитием злокачественных опухолей [13].

Несмотря на удовлетворительную производительность, разработанный метод HybSelect не лишен существенных недостатков. Во-первых, для проведения селективного выделения целевых дуплексов требуется много (от 10 до 15 мкг) исходного материала ДНК. Во-вторых, необходимость дорогостоящего специализированного оборудования (станции для проведения гибридизации). В‑третьих, метод хорошо работает при обогащении геномных фрагментов размером ~500 п.н., но значительно менее эффективен в случае коротких экзонов (~120 п.н.) [5]. В-четвертых, HybSelect сложно масштабировать и автоматизировать.

Гибридизация в растворе

Из-за недостатков обогащения целевых фрагментов ДНК на твердой поверхности “Roche NimbleGen” и другие компании перешли на обогащение мишеней в растворе, где гибридизация идет с избытком гибридизационных зондов. Фирма “Roche NimbleGen” прекратила выпуск слайдов для гибридизации геномных фрагментов непосредственно на микрочипе.

Компания “Agilent” была первой, разработавшей коммерческий продукт, использующий гибридизацию олигонуклеотидов с геномными фрагментами ДНК в растворе [14]. В этом методе применяют синтезированные на микрочиповом ДНК-синтезаторе 200-членные олигонуклеотиды, содержащие 170-членную мишеньспецифическую последовательность, фланкированную двумя праймерами для амплификации. Набор синтезированных олигонуклеотидов отщепляют от слайда и подвергают двураундной ПЦР. В первом раунде используют интегрированные в последовательность олигонуклеотидов праймеры, во втором – в мишеньспецифические дуплексы вводят последовательность промотора фага T7. Затем, используя транскрипцию in vitro в присутствии биотин-UTP, получают биотинилированные оцРНК-зонды для выделения целевых геномных фрагментов. Геномную ДНК случайным образом расщепляют на фрагменты длиной ~250 п.н., к которым присоединяют адаптеры. После 12 циклов ПЦР полученные ампликоны гибридизуют с РНК-зондами в растворе. Биотинилированные РНК, содержащие и не содержащие комплементарную геномную ДНК, выделяют из реакционной смеси с помощью магнитных шариков с иммобилизованным стрептавидином. ДНК:РНК-гибриды разрушают и полученную ДНК амплифицируют с помощью ранее введенных в состав фрагментов геномной ДНК адаптеров (рис. 2).

Разработанный метод не требует специального оборудования и совместим с различными секвенирующими платформами. Он был апробирован на секвенировании 15 тыс. экзонов (2.5 млн.п.н.) человеческого генома.

К основными достоинствам метода относятся:

1) высокая концентрация оцРНК-зондов, что позволяет повысить эффективность процесса гибридизации с целевыми ДНК-фрагментами;

2) относительно небольшое количество геномной ДНК (0.5‒3.0 мкг) для секвенирования;

3) проведение гибридизации в растворе, что позволяет масштабировать и автоматизировать процесс в отличие от твердофазной гибридизации на слайдах [2];

4) нивелирование различий в гибридизации разных аллелей благодаря использованию протяженных зондов;

5) возможность готовить и характеризовать большие партии РНК-зондов, что позволяет иметь стандартизованный материал для использования в большом числе экспериментов;

6) эффективность при таргетном секвенировании как множества несмежных геномных фрагментов, так и протяженных геномных районов;

7) высокая специфичность – успешно определяют 85‒90% целевых последовательностей.

Созданы коммерческие наборы, основанные на различных вариантах обогащения последовательностей ДНК в растворе: например, Agilent SureSelect (“Agilent”) [15], Illumina TruSeq (“Illumina”, США) [16], Roche NimbleGen SeqCap EZ (“Roche NimbleGen”) [17]. Принципиальная разница между “Agilent” и другими коммерческими наборами заключается в природе гибридизационных зондов: “Agilent” использует 120‒170-членные РНК-пробы, в то время как “Roche NimbleGen” 60‒90-членные, а “Illumina” 95-членные ДНК-зонды [3, 16]. Для процедуры проведения обогащения геномной ДНК в растворе применяются стандартные 96-луночные планшеты и термоциклер, то есть специализированного оборудования в этом случае не требуется.

Модификация метода обогащения целевых фрагментов путем гибридизации олигонуклеотидов с геномными фрагментами ДНК в растворе ‒ транспозонопосредованная фрагментация анализируемой ДНК (рис. 3).

Данная модификация значительно упрощает процесс получения фрагментов анализируемой ДНК, поскольку фрагментация и присоединение адаптеров происходит за одну стадию с применением фермента транспозазы [18, 19]. Транспосомы (комплекс фермента транспозазы с двухцепочечными олигонуклеотидами, содержащими участок связывания с транспозазой и часть последовательности праймера для последующей амплификации) обладают способностью случайным образом связываться с целевыми последовательностями двухцепочечной геномной ДНК. Транспозазы в транспосоме расщепляют ДНК и одновременно встраивают на участке разрезания олигонуклеотиды из комплекса.

Разработанные методы обогащения экзома оказались эффективными для обнаружения мутаций, служащих причиной редких менделевских заболеваний [20‒23], сложных расстройств [24‒27], митохондриальных нарушений [28‒30]. Также их применяли при скрининге потенциальных генетических мутаций, связанных с раковыми заболеваниями [31‒36].

Метод гибридизационного обогащения успешно используют при анализе древней ДНК человека (ancient DNA; аДНК), сохранившейся в человеческих останках. Первым генетическим маркером, проанализированным в палеогенетических исследованиях человека, была митохондриальная ДНК (мтДНК), так как в клетках ее копийность гораздо выше, чем ядерной ДНК. Для гибридизации использовали биотинилированные ДНК или РНК-зонды, направленные на два гипервариабельных сегмента контрольной области мтДНК [37‒43].

Селективное обогащение фрагментов Y-хромосомы аДНК проводили как на твердой поверхности [44], так и в растворе [45].

Carpenter и соавт. [46] разработали метод полногеномного обогащения (whole-genome in-solution capture, WISC) аДНК, используя современную ДНК человека в качестве зондов.

В настоящее время разработаны коммерческие наборы, ориентированные на мтДНК, индивидуальные локусы или целые геномы, такие как myBaitsR³ (“Daicel Arbor Biosciences”, США), которые используют для секвенирования аДНК [47, 48].

Применение смеси олигонуклеотидов, полученных с помощью микрочипового синтезатора, содержащей 962 438 зондов, позволило секвенировать экзоны бурундуков [49]. Из целевых 11 975 экзонов обогатить удалось более 99%. Зонды были рассчитаны на основе известной последовательности генома бурундука Tamias alpinus. Однако эти же зонды были успешно использованы для селективного выделения экзонов родственных видов: Tamias amoenus, Tamias ruficaudus и Tamias striatus.

Аналогичным образом, используя зонды для экзонов генов домашней коровы (Bos taurus), Т. Cosart и др. [50] секвенировали 16 131 экзон быка (Bos indicus) и дикого бизона (Bison bison). Предложенный метод селективного обогащения геномной ДНК применяли для секвенирования ряда хромосом и митоходриального генома западных шимпанзе (Pan troglodytes verus) [51]. R. Tewhey и соавт. [52] для гибридизации использовали перекрывающиеся РНК-зонды длиной 120 нуклеотидов. На мишени размером 3.9 млн.п.н. они картировали 93% мутаций с точностью более 99%. Подход Agilent был успешно применен также при проведении секвенирования мутаций в генах, ответственных за потерю слуха [53].

С помощью гибридизации в растворе с ДНК-олигонуклеотидами были получены для секвенирования образцы ретровирусов, интегрированные в геном человека [54].

Добавление коммерческого препарата C0t1 DNA при проведении гибридизации, как на поверхности, так и в растворе, увеличивает ее специфичность [14, 55]. C0t1 DNA состоит из коротких фрагментов (50–300 п.н.) плацентарной ДНК человека, обогащенной повторяющимися последовательностями. При гибридизации на слайде или в растворе C0t1 DNA обычно добавляют соответственно в 5- и 20-кратном избытке по отношению к геномной ДНК.

Моноплексная ПЦР

ПЦР с момента появления в 1980 годах предназначалась для наработки целевого фрагмента ДНК с помощью праймеров для амплификации [71]. Именно поэтому технология ПЦР была применена для NGS. В моноплексной ПЦР в одной пробирке с помощью одной пары праймеров нарабатывают только один ДНК-дуплекс. После амплификации всех целевых фрагментов их объединяют в эквимолярных количествах для создания библиотеки для секвенирования. Получение ампликонов с помощью моноплексной ПЦР может быть очень трудоемким процессом, поэтому эта стадия была автоматизирована. Например, для упрощения процедуры получения ампликонов компания “Fluidigm” (Канада) разработала микрофлюидное устройство Access Array system, позволяющее автоматизировать процесс получения целевых ампликонов. Одновременно можно получить 480 различных ампликонов [72].

Эмульсионная технология RainDance (“Bio-Rad”, США) [73], использующая моноплексную ПЦР, значительно более производительна по сравнению с описанной выше. В ней генерируют миллионы капель двух типов: один содержит геномную ДНК (1 молекула геномной ДНК, дезоксинуклеозидтрифосфаты, ДНК-полимераза в буфере), а другой только молекулы одной пары праймеров. Затем эти типы капель смешивают в соотношении 1 : 1. Примерно 1.5 млн капель ПЦР собирают в одну пробирку для ПЦР объемом 0.2 мл, амплифицируют в стандартном термоциклере с последующим разрушением эмульсии с высвобождения ампликонов в раствор. После очистки смесь секвенируют.

Технологии как RainDance, так и Fluidigm совместимы с большинством коммерческих секвенаторов и требуют только несколько нанограммов исходного материала для получения ампликонов для секвенирования. Однако технология RainDance позволяет получать значительно больше ампликонов одновременно: до 20 тыс. на образец по сравнению с 480 для Fluidigm. В продуктах компании “Bio-Rad” есть панели ампликонов, связанных с мутациями в генах, ассоциированных с онкологическими заболеваниями и аутизмом.

Мультиплексная ПЦР

Мультиплексная ПЦР ‒ реакция, в которой несколько пар праймеров одновременно генерируют несколько ампликонов из одного и того же исходного материала. До недавнего времени использование мультиплексной ПЦР было ограничено ‒ из-за высокого уровня неспецифической амплификации. Однако в последние годы несколько компаний разработали алгоритмы, позволяющие значительно повысить селективность мультиплексной ПЦР.

Компания “Illumina” разработала вариант мультиплексной ПЦР, включающий следующие стадии:

1) гибридизацию олигонуклеотидов к их комплементарным последовательностям в интересующей области;

2) достраивание одного из пары олигонуклеотидов;

3) сшивание достроенного фрагмента со вторым олигонуклеотидом;

4) ПЦР-амплификацию полученного фрагмента ДНК с использованием универсальных праймеров, содержащих индексные последовательности.

Разработанный подход позволяет создавать разнообразные панели, в том числе и нестандартные. Пользовательские панели могут быть созданы для 1536 мишеней в геномах человека, мыши, крысы и коровы. Сконструированы панели TruSeq Amplicon Cancer Panel (“Illumina”), нацеленные на гены, связанные с развитием рака. Одна из них создана для секвенирования 212 ампликонов 48 ассоциированных со злокачественными опухолями генов. TruSight Tumor Panel (“Illumina”) разработана для получения 174 ампликонов, покрывающих сайты мутаций в 26 ассоциированных с развитием рака генах [74].

Компания “Thermo Fisher Scientific” (США) разработали технологию Ion AmpliSeq, позволяющую проводить до 24 тыс. амплификаций в одной пробирке (рис. 5).

В протоколе этого метода предусмотрено использование всего 1 нг ДНК и РНК. Технология AmpliSeq получила широкое распространение во всем мире. Так, ее использовали в исследованиях злокачественных опухолей [75], наследственных заболеваний [76] и бактерий [77].

На основе технологии AmpliSeq разработаны наборы для исследования либо определенных генов (например, Ion AmpliSeq TP53 Panel, Ion A-mpliSeq BRCA1 и BRCA2 Panel), либо заболеваний (например, муковисцидоза, деменции, рака толстой кишки и легкого). Создан набор для полноэкзомного секвенирования, содержащий 294 тыс. пар праймеров.

Истощение фоновых ДНК

Прежде всего, система CRISPR-Cas была использована для обогащения целевых ДНК путем истощения нежелательных. Метод обогащения получил название DASH (Depletion of Abundant Sequences by Hybridization) [80]. На первом этапе конструируют библиотеку фрагментов ДНК для секвенирования, содержащую в частности праймеры для ее амплификации. Разрушение ненужных для секвенирования последовательностей в полученной библиотеке проводят с помощью РНК-гидов, направленных на неинформативные последовательности. После амплификации дуплексов, содержащих в своем составе оба амплификационных праймера, библиотеку секвенируют. Используя этот метод, J. DeRisi с сотрудниками [80] удалось снизить содержание митохондриальной рРНК в клетках HeLa на два порядка и обогатить содержание целевых последовательностей патогенов в образцах пациентов. Модифицированный метод DASH был применен S. Bae с сотрудниками [81] для разработки сверхчувствительного способа обнаружения циркулирующих опухолевых ДНК.

R. Stevens и др. [82] разработали метод выделения длинных фрагментов ДНК (10‒36 т.п.н.) с помощью система CRISPR-Cas. После расщепления исходной ДНК эндонуклеазой Cas9 оба конца целевого фрагмента ДНК остаются связанными с ферментом. Обработка реакционной смеси экзонуклеазами приводит к разрушению фоновых последовательностей, но не затрагивает защищенные Cas9 целевые последовательности. Разработанный метод позволяет обогатить мишени в 30‒600 раз.

Применение гель-электрофореза, аффинной хроматографии и гибридизации

В нижеприведенных методах ДНК разрезают с использованием Cas9 и целевые фрагменты выделяют электрофорезом в агарозном геле. Такие методики позволяют выделять очень большие неповрежденные участки генома. Bennett-Baker & Mueller [83] с помощью пульсирующего электрофореза выделили геномные фрагменты размером 2 млн.п.н. со стократным обогащением. Т. Gabrieli с соавт. [84] усовершенствовали метод и апробировали его на секвенировании бактериального фрагмента длиной 200 т.п.н. с помощью нанопорового секвенатора. В рассмотренном методе используют приборы для импульсного гель-электрофореза, а также ДНК с чрезвычайно высокой молекулярной массой, что доступно далеко не во всех лабораториях. Однако есть другие методы, которые обходят эти проблемы.

D. Nachmanson с соавт. [85] разрезали геномную ДНК на фрагменты длиной ~500 п.н. с помощью набора РНК-гидов и выделяли целевые фрагменты гель-электрофорезом либо экстракцией геномной ДНК. Таким способом удалось добиться обогащения в 49 тыс. раз. J. Lee и др. [86] гидролизовали целевую последовательность размером 13 т.п.н. на фрагменты, размеры которых были оптимальны для создания библиотеки для секвенатора Illumina. Целевые фрагменты выделяли с помощью гель-электрофореза либо конъюгированных со стрептавидином шариков. В последнем случае РНК-гиды были биотинилированы.

Идея обогащения целевых ДНК путем выделения комплекса РНК-гид:Cas9:ДНК реализована в нескольких патентах. Например, авторы работ [87, 88] выделяли комплекс, включающий биотинилированный фермент Cas9, с помощью стрептавидинсодержащих шариков. D. Bang и др. [89] использовали для этой цели нуклеазу Cas9, содержащую полигистидиновый тег, и металл-хелатную хроматографию. Х. Xu и соавт. [90] выделяли комплекс путем гибридизации удлиненного РНК-гида с комплементарным олигонуклеотидом, иммобилизованным на твердой поверхности. А. Aalipour и др. [91] использовали каталитически неактивный белок Cas9 с полигистидиновым тегом для выделения целевых ДНК и аллельспецифическую количественную ПЦР для выявления редких мутаций ДНК. Разработанный метод позволяет выявить одну такую мутацию на фоне 1000 аллелей дикого типа.

Другой способ применения системы CRISPR-Cas для обогащения целевых последовательностей ‒ FLASH (Finding Low-Abundance Sequences by Hybridization) ‒ связан с подготовкой библиотек для секвенирования. В этом методе исходную геномную ДНК подвергают дефосфорилированию и разрезают с использованием технологии CRISPR-Cas. Продукты расщепления, содержащие концевые фосфатные группы на целевых фрагментах, способны присоединять адаптеры для секвенирования. После амплификации происходит значительное обогащение библиотеки целевыми последовательностями ДНК. Так, при анализе маркеров устойчивости к антибиотикам удалось достичь 5000-кратного обогащения библиотеки анализируемыми ДНК [92]. Если применять методы секвенирования, позволяющие “прочитывать” протяженные участки ДНК, необходимости в амплификации ДНК нет. Так, N. Hafford-Tear и соавт. [93], используя комплекс CRISPR-Cas и метод одномолекулярного секвенирования в реальном времени (PacBio SMRT), проанализировали мутации, ассоциированные с эндотелиальной дистрофией роговицы (дистрофией Фукса). Варианты метода FLASH получили распространение в нанопоровом секвенировании [94‒96].

Систему CRISPR/Cas9 также используют для фрагментации ДНК с целью генерации фрагментов одинаковой длины. В наиболее широко используемом методе – обработке утразвуком – генерируются фрагменты ДНК произвольного размера, что может приводить к проблемам при секвенировании, связанным с низким уровнем “покрытия”, неравномерным “покрытием” и ложными мутациям. Подход, названный CRISPR-DS, успешно использован для секвенирования экзонных областей TP53 [85]. Целевые фрагменты ДНК для секвенирования могут быть выделены с помощью простого фракционирования по молекулярному весу, что приводит к обогащению примерно в 49 тыс. раз. Метод позволяет снизить на один–два порядка массу исследуемой ДНК.

На основе системы CRISPR-Cas быстро растет разнообразие методов обогащения целевых последовательностей ДНК, однако до сих пор ни один из них не достиг эффективности таковых с применением гибридизации нуклеиновых кислот.