Согласно классификации гематолимфоидных опухолей WHO-HAEM5, опубликованной Всемирной организации здравоохранения в 2022 году, лимфомы представляют собой гетерогенную группу онкологических заболеваний, различающихся по прогнозу и патогенезу. Неходжкинские лимфомы (НХЛ) делят на В- и Т-клеточные. К основным подтипам НХЛ относятся следующие: диффузная В-крупноклеточная лимфома (DLBCL), фолликулярная лимфома, лимфома Беркитта, хронический лимфолейкоз, ассоциированные со слизистыми оболочками опухоли лимфоидной ткани, лимфома из клеток мантийной зоны и лимфома маргинальной зоны. Классификация лимфом основана на комбинации данных морфологии, иммунофенотипа, специфических генетических аномалий и клинических признаков заболевания. У пациентов с диагностированным заболеванием клиническое течение крайне вариабельно: от индолентного до агрессивного. Так что стратегии их лечения и ответа на терапию тоже сильно различаются, как и клинические результаты. Основными методами лечения НХЛ считаются химиотерапия, иммунохимиотерапия и лучевая терапия, однако значительная часть этого типа опухолей химиорезистентна или рецидивирует после лечения [1]. В связи с этим поиск новых терапевтических подходов сохраняет актуальность.
Успехи в изучении молекулярных механизмов, лежащих в основе лимфомагенеза, привели к разработке таргетных препаратов [2]. В последние годы в качестве таких лекарственных средств рассматривают микроРНК (miРНК) [3]. Аберрантная экспрессия miРНК описана для большинства видов злокачественных опухолей, включая лимфомы [4]. В экспериментах in vitro показано, что использование длинной интерферирующей РНК для одновременного ингибирования 13 онко-miРНК значительно снижало клеточную пролиферацию, индуцировало остановку клеточного цикла и апоптоз в клеточных линиях DLBCL в основном за счет повышения экспрессии белков PTEN, p27Kip1, TIMP3, RECK и подавления p38/MAPK, Survivin, CDK4, c-Myc [5]. H. Due и соавт. [6] сообщали, что повышение уровня miR-155 в клеточных линиях DLBCL индуцировало изменения в чувствительности этих клеток к винкристину. Кроме того, трансфекция миметиков miR-197 и miR-187 в клеточные линии DLBCL повышала их чувствительность к доксорубицину, усиливая апоптоз [7, 8]. Повышение экспрессии miR-10а и miR-26а ингибировало пролиферацию и индуцировало апоптоз клеток DLBCL [9, 10]. Повышение экспрессии miR-223-3p снижало пролиферацию и ускоряло апоптоз клеток в мантийноклеточной лимфоме in vitro и in vivo через модулирование сигнального пути CHUK/NF-κB2 [11]. miR-373 значительно замедляла рост клеток Т-клеточной лимфомы [12]. M. Morales-Martinez и соавт. [13] отмечали, что miR-7 регулирует химиочувствительность НХЛ посредством негативной регуляции генов YY1 и KLF4 [13]. Показано, что miR-150 можно рассматривать в качестве потенциального терапевтического сенсибилизатора, который регулирует путь PI3K/AKT/mTOR при лечении NK/T-клеточной лимфомы [14]. K. Musilova и соавт. [15] показали, что трансфекция miR-150 в клетки фолликулярной лимфомы приводила к значительному снижению доли клеток в S-фазе, что коррелировало со снижением пролиферации опухолевых клеток.
Возможность доставки синтетических миметиков или ингибиторов miРНК открыла новые терапевтические перспективы. MRX34 (миметик miR-34), mesomiR-1 (миметик miR-16) и кобомарсен (анти-miR-155) проявляли противоопухолевую активность в клинических испытаниях фазы I. Эти исследования не были специально разработаны для НХЛ, но в них участвовали пациенты с B-клеточными НХЛ [3, 16, 17].
Эти данные подтверждают терапевтический потенциал miРНК. Персонализированная комбинированная терапия может напрямую воздействовать на главную проблему при лечении опухолей различной локализации – лекарственную устойчивость.
Целью работы было определение профиля экспрессии miРНК в материале лимфоузлов DLBCL и поиск miРНК, которые в перспективе могут быть использованы в качестве таргетных препаратов, позволяющих максимально персонализировать проводимую терапию.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследуемые группы. В экспериментальную группу вошли пациенты с DLBCL (n = 52). Контрольную группу составили пациенты с реактивной лимфоаденопатией (RL) (n = 40). От каждого пациента было получено письменное информированное согласие, все данные обезличены. Исследование было одобрено Этическим комитетом Новосибирского государственного медицинского университета.
Исследование проведено на гистологических препаратах биоптатов опухолевых лимфатических узлов, которые были обработаны с использованием классических методов фиксации в формалине, обезвоживания в изопропиловом спирте, обезжиривания ксилолом и пропитаны парафином.
Экстракция РНК. Для выделения нуклеиновых кислот из фиксированных в формалине парафинированных образцов проводили их депарафинизацию. Для этого в пробирку, содержащую 3 парафиновых среза ткани лимфатического узла толщиной 15 мкм, добавляли 1 мл минерального масла и тщательно перемешивали в течение 10 с на вортексе (“BioSan”, Латвия), затем пробирку переносили в термошейкер и инкубировали при 65°С и частоте перемешивания 1300 об/мин в течение 2 мин. Полученную суспензию центрифугировали при 13 000‒15 000 g в течение 4 мин и удаляли надосадочную жидкость. В осадок вносили 1 мл 96%-ного этанола, перемешивали в течение 10 с на вортексе и центрифугировали при 13 000‒15 000 g в течение 4 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а в осадок вносили 1 мл 70%-ного этанола, центрифугировали при той же скорости в течение 2 мин. Полученный осадок использовали для выделения нуклеиновых кислот.
Выделение нуклеиновых кислот из образцов проводили с использованием набора реагентов РеалБест экстракция 100 (АО “Вектор-Бест”, Россия).
Выбор miРНК. На основании анализа данных E. Sebestyén и соавт. [18] для исследования были выбраны miРНК, число копий которых в образце превышало 100 единиц, и они были представлены, как минимум, в 80% исследованных авторами образцов. Этим критериям удовлетворяло 29 miРНК: miR-124-3p, -144-5p, -15а-5р, -16-5p, -196b-5p, -221-3p, -29b-3p, -148b-3p, -150-5p, -18a-5p, -183-5p, -185-5p, -205-5p, -20a-5p, -23a-3p, -23b-3p, -26b-5p, -30b-5p, -34a-5p, -451a, -9-5p, -128-3p, -141-3p, -200b-3p, -574-3p, -96-5p, let-7a-5p, let-7c-5p и let-7f-5p. Для нормализации использовали среднее геометрическое значений CT трех miРНК: miR-378-3p, -191-5p и -103a-3p, ‒ которые тоже были выбраны на основе литературных данных [19‒21]. Все олигонуклеотиды были синтезированы в АО “Вектор-Бест”. В зависимости от системы значение Е (эффективность реакции) варьировало от 92.5 до 99.7%.
Обратная транскрипция (ОТ). Синтез кДНК проводили в реакционной смеси объемом 30 мкл, содержащей 3 мкл выделенной РНК, 16.2 мкл 40%-ного раствора трегалозы, 3 мкл 10× буфера для ОТ (500 мM Трис-НCl, рН 8.3 (при 25°C), 500 мM KCl, 40 мМ MgCl2), 3 мкл 4 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов, 3 мкл 10%-ного раствора BSA, 0.32 мкл обратной транскриптазы (АО “Вектор-Бест”), 1.5 мкл 10 мкМ раствора соответствующего праймера для ОТ. Смесь инкубировали в течение 15 мин при 16°С и 15 мин при 42°С с последующей инактивацией в течение 2 мин при 95°С.
ПЦР в реальном времени. Уровни экспрессии miРНК оценивали методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (“Bio-Rad Laboratories”, США). Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 3 мкл образца кДНК, ПЦР-буфер (АО “Вектор-Бест”), 0.5 мкМ каждого праймера и 0.25 мкМ зонд. Условия реакции: 2 мин при 50°С, 2 мин при 94°С и 50 циклов денатурации (10 с при 94°С), отжига и элонгации цепи (20 с при 60°С).
Статистический анализ. Статистический анализ выполнен с использованием программы Statistica v13.1 и U-критерия Манна‒Уитни. Значения р < 0.05 считали статистически значимыми.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Анализ экспрессии исследуемых miРНК в клинических образцах
Методом ОТ-ПЦР в реальном времени проанализированы уровни экспрессии 29 miРНК: miR-124, -144, -15а, -16, -196b, -221, -29b, -148b, -150, -18a, -183, -185, -205, -20a, -23a, -23b, -26b, -30b, -34a, -451a, -9, -128, -141, -200b, -574, -96, let-7a, let-7c и let-7f ‒ в 52 образцах DLBCL и 40 образцах RL. В образцах DLBCL по сравнению с RL выявлено статистически значимое изменение экспрессии для 21 miРНК: снижение для miR-26b, -30b, -150, -451a, -574, -144, -15a, -16, -196b, -221, -29b, -23a, -23b, -148, -128, let-7a, let-7c, let-7f и повышение для miR-124, -9 и -96 (p < 0.05) (табл. 1).
Таблица 1.
Сравнительный анализ уровней miРНК, дифференциально экспрессируемых в образцах пациентов с DLBCL и RL
| miРНК | Уровень различийа | p-valueb | miРНК | Уровень различийа | p-valueb |
|---|---|---|---|---|---|
| miR-26b | ‒3.64 | 1.5 × 10‒13 | miR-29b | ‒2.12 | 1.1 × 10‒7 |
| miR-30b | ‒1.96 | 1.2 × 10‒4 | let-7c | ‒2.75 | 3 × 10‒6 |
| miR-150 | ‒12.47 | 3.6 × 10‒15 | let-7f | ‒1.76 | 2.9 × 10‒9 |
| miR-451a | ‒2.57 | 4.8 × 10‒3 | miR-9 | 1.55 | 7 × 10‒3 |
| miR-574 | ‒1.56 | 3.3 × 10‒3 | miR-23a | ‒1.35 | 1.7 × 10‒2 |
| let-7a | ‒2.33 | 1.1 × 10‒10 | miR-23b | ‒2.01 | 1 × 10‒3 |
| miR-124 | 1.90 | 1.2 × 10‒2 | miR-96 | 1.54 | 1.9 × 10‒2 |
| miR-144 | ‒1.78 | 5 × 10‒3 | miR-148b | ‒1.83 | 6.2 × 10‒12 |
| miR-15a | ‒1.47 | 1.1 × 10‒4 | miR-128 | ‒2.00 | 4.1 × 10‒7 |
| miR-16 | ‒1.75 | 9 × 10‒6 | miR-221 | ‒2.47 | 1.5 × 10‒4 |
| miR-196b | ‒2.50 | 1.7 × 10‒3 |
Наиболее значимые различия, более чем в 2 раза, в экспрессии miРНК зарегистрированы для 10 представителей: miR-26b, -150, -451a, -196b, -221, -29b, -23b, -128, let-7a и let-7c. Распределение относительных уровней экспрессии этих miРНК, включая медианное значение и межквартильный диапазон, представлено на рис. 1.
Рис. 1.
Относительные уровни дифференциально экспрессируемых miРНК в образцах DLBCL и RL. Горизонтальная черная линия в пределах бокса ‒ медиана, бокс ‒ межквартильный диапазон, усы – диапазон без выбросов, выбросы обозначены кружками. Для всех приведенных miРНК различия в экспрессии были статистически значимыми (p < 0.05 по критерию Манна‒Уитни).
Таким образом, наибольший размах в изменении экспрессии среди исследованных miРНК выявлен для miR-150: ее уровень понижен более чем в 12 раз в клетках DLBCL в сравнении с неопухолевой тканью. По-видимому, аберрантная экспрессия этой miРНК ассоциирована с развитием опухоли.
Биоинформационный анализ генов-мишеней miРНК-150
Понимание механизмов регуляции генов относится к одной из основных задач молекулярной биологии и биоинформатики. С помощью ресурса miRPathDB 2.0 (https://mpd.bioinf.uni-sb.de/) определены экспериментально подтвержденные пути, которые значительно обогащены мишенями miR-150 и нарушения в которых могут быть ассоциированы с DLBCL (табл. 2).
Таблица 2.
Процессы, в регуляции которых участвуют гены-мишени miR-150
| Процесс | p-value | Гены-мишени |
|---|---|---|
| Активация В-клеток | 0.030 | CCR6, EP300, FLT3, MMP14, STAT5B, TP53 |
| Дифференцировка B-клеток | 0.019 | EP300, FLT3, MMP14, STAT5B, TP53 |
| Контроль клеточного цикла | 0.049 | BIRC5, EP300, POLD3, PRKCA, TP53 |
| Гемопоэз | 0.018 | CCR6, CREB1, EP300, FLT3, MMP14, MYB, PRKCA, STAT1, STAT5B, TP53, VEGFA, ZEB1 |
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Лимфоциты относятся к важнейшим клеточным компонентам иммунной системы. Большинство лимфом происходит из В-лимфоцитов, подвергшихся неопластической трансформации. Подтипы В-клеточной лимфомы гетерогенны в отношении генетических и клинических характеристик [22]. Развитие В-клеток представляет собой сложный процесс, в котором участвуют как факторы транскрипции и цитокины, так и miРНК [23]. S. Koralov и соавт. [24] показали, что в развитии В‑лимфоцитов участвует рибонуклеаза Dicer ‒ ключевой участник процессинга miРНК, ‒ из чего можно сделать вывод о том, что в регуляцию этого биологического процесса вовлечен сложный сигнальный каскад.
Мы провели анализ уровней экспрессии 29 miРНК в образцах DLBCL и RL и выявили наиболее значимые различия, более чем 2 раза, для 10 miРНК: miR-26b, -150, -451a, -196b, -221, -29b, -23b, -128, let-7a и let-7c. Согласно литературным данным, эти miРНК участвуют в регуляции нормального гемопоэза и, следовательно, их аберрантная экспрессия может быть вовлечена в развитие как миелоидных, так и лимфоидных опухолей [25‒31]. Стоит отметить, что экспрессия miR-150 снижена более чем в 12 раз (p = 3.6 × 10‒15) в образцах DLBCL в сравнении с тканями неопухолевых узловых образований. Таким образом, miR-150 может быть одним из ключевых участников злокачественной трансформации В-лимфоцитов.
На сегодняшний день опубликован ряд работ, отражающих роль miРНК в дифференцировке В-клеток и развитии В-клеточных лимфом [32]. miR-150 контролирует дифференцировку В-клеток, воздействуя на фактор транскрипции c-Myb [33]. c-Myb, играет важную роль во время развития В-клеток, в поддержании их пролиферации, а также в контроле клеточного цикла гемопоэтических клеток [34]. Нарушения на каждом из этих биологических процессов способствуют прогрессии опухолей различного генеза, характеризуя c‑Myb в качестве важного звена в развитии как солидных, так и гематологических опухолей. В исследованиях механизмов канцерогенеза лимфомы Беркитта выявлена ключевая роль генов ZDHHC11 и ZDHHC11B в поддержании пути MYC‒miR-150‒MYB, обеспечивающего развитие опухоли [35]. Лимфома Беркитта, как и DLBCL, ‒ это агрессивная В-клеточная лимфома. Показано, что гены MYC, MYB и ZDHHC11 участвуют и в онкогенезе DLBCL [36]. Таким образом, не исключено, что в развитии DLBCL могут быть задействованы аналогичные регуляторные пути, в которые вовлечена miR-150. М. Wang и соавт. [37] идентифицировали miR-150 в качестве супрессора опухоли, снижающего пролиферацию клеток лимфомы Беркитта, определив в качестве мишеней этой miРНК c-Myb и Survivin. В клетках NK/T-клеточной лимфомы повышенная экспрессия miR-150 коррелирует с усилением апоптоза и снижением пролиферации клеток, что подтверждает роль этой miРНК как супрессора; при этом гены DKC1 и AKT2 идентифицированы в качестве ее прямых мишеней [38]. Кроме того, miR-150 участвует в развитии Т-клеток, регулируя экспрессию NOTCH3, а также сигнальный путь AKT3/Bim [39, 40]. Снижение экспрессии miR-150 способствует мультиорганной инвазии и метастазированию Т-клеточной лимфомы за счет усиления экспрессии мишени ‒ CCR6 [41].
C фундаментальной точки зрения miR-150 можно считать регулятором развития лимфом. Кроме того, на сегодняшний день уже показан потенциал этой miРНК в качестве клинико-биологического маркера. Так, М. Mraz и соавт. [42] выявили, что у пациентов c хроническим лимфолейкозом повышенный уровень miR-150 в крови коррелирует с более длительной общей выживаемостью. А Х. Wang и др. [43] показали, что пониженная экспрессия miR-150 коррелирует с более коротким временем общей выживаемости и периодом без прогрессирования у пациентов с первичной желудочно-кишечной формой DLBCL.
Как отмечалось выше, miРНК ‒ это важные регуляторы нормального гемопоэза. В частности, miR-150 регулирует терминальный эритропоэз у человека [44]. J. Lu и соавт. [45] отмечали, что miR-150 модулирует развитие мегакариоцитарно-эритроцитарных предшественников, при этом уровень ее экспрессии значительно снижается в условиях повышенной потребности в эритропоэзе. Очень часто у пациентов с DLBCL заболевание сопровождается анемией, что позволяет рассматривать miR-150 в качестве одного из потенциальных регуляторов и этого физиологического процесса. Так, C. Apple и соавт. [46] обнаружили дифференциальную экспрессию miR-150, miR-223, miR-15а и miR-24 в костном мозге у пациентов с травмой тазобедренного сустава, отмечая важную роль этих miРНК в эритропоэтической дисфункции, связанной с анемией.
Анализ уровней экспрессии miРНК может быть использован в качестве биомаркеров не только в тканях, но и в плазме крови. H. Fayyad-Kazan и соавт. [47] считают, что уровни miR-150 и miR-342 в плазме можно рассматривать как перспективные биомаркеры в диагностике острого миелоидного лейкоза.
Таким образом, можно предположить, что miR-150 опосредует многие патофизиологические процессы, регулируя экспрессию своих генов-мишеней. На основании полученных данных miR-150 можно рассматривать в качестве перспективной терапевтической мишени с большим потенциалом в клинической практике.
Исследование выполнено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 19-34-60024) и Российского научного фонда (проект № 20-14-00074). Исследование было финансировано в рамках государственного задания (проект № FWGZ-2021-0014).
Все процедуры, выполненные в данной работе, соответствуют этическим стандартам Институционального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. От всех пациентов получено информированное согласие.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.