ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ, 2019, том 89, № 8, с. 1309-1312

ПИСЬМА

В РЕДАКЦИЮ

УДК 54.03;544-971

ИЗОТЕРМИЧЕСКОЕ КАЛОРИМЕТРИЧЕСКОЕ

ТИТРОВАНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО СЫВОРОТОЧНОГО

АЛЬБУМИНА АДДУКТОМ С₆₀-L-АРГИНИН

Е. И. Почкаеваa,b, *, Ю. А. Ануфриков^a, В. П. Фаенкова^c, В. В. Шаройкоa, c,

Н. А. Чарыков^d, И. В. Мурин^a

^aИнститут химии Санкт-Петербургского государственного университета,

Университетский пр. 26, Санкт-Петербург, 198504 Россия

*e-mail: evgeniyapochkaeva@gmail.com

^bНациональный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова, Санкт-Петербург, Россия

^cПервый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова,

Санкт-Петербург, Россия

^dСанкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет),

Санкт-Петербург, Россия

Поступило в Редакцию 30 мая 2019 г.

После доработки 30 мая 2019 г.

Принято к печати 5 июня 2019 г.

Методом изотермической калориметрии титрования изучено взаимодействия между аддуктом фуллерена

С₆₀ с L-аргинином и человеческим сывороточным альбумином (HSA). В результате проведенного иссле-

дования установлено образование комплекса С₆₀-Arg-HSA со стехиометрическим соотношением 1:0.7.

Ключевые слова: фуллерен, аргинин, человеческий сывороточный альбумин, калориметрическое ти-

трование

DOI: 10.1134/S0044460X19080237

Молекула фуллерена обладает высокой химиче-

рен взаимодействует с белками по механизму ин-

ской активностью благодаря большому числу сво-

дуцированного соответствия. В работе [9] было

бодных связей, способных присоединять различ-

проведено экспериментальное и теоретическое

ные радикалы [1, 2], демонстрирует способность

исследование взаимодействия человеческого сы-

проникать через клеточные мембраны [3], модули-

вороточного альбумина [10] с фуллереном C₆₀ в

ровать транспорт ионов [4], преодолевать гемато-

водной среде. Результаты исследования показали,

энцефалический барьер [5, 6], проявлять адгезив-

что фуллерен C₆₀ вызывает незначительные изме-

ную активность в сочетании с мембранотропной

нения конформации белка. Однако полигидрокси-

(что может быть использовано для получения но-

лированный фуллерен C₆₀(OH)₄₄ при связывании

вых иммуномодуляторов, адъювантов и носителей

с белками вызывает их явные конформационные

для вакцины, в том числе и для ВИЧ-антигенов)

изменения и потерю их активности [11,12].

[3, 6, 7].

Белки выполняют в организме функцию уни-

Одним из доказательств способности фул-

версального транспортера биологически актив-

леренов взаимодействовать с белками является

ных соединений и микроэлементов [13], поэтому в

образование фуллеренспецифических антител

рамках настоящего исследования была поставлена

[8]. Данные рентгеноструктурного анализа Fab-

задача изучить взаимодействие между аддуктом

фрагмента этих антител показывают, что фулле-

фуллерена С₆₀ с L-аргинином и человеческим сы-

1309

1310

ПОЧКАЕВА и др.

на 1 моль титруемого вещества (HSA) приходит-

ся 0.7 моль титранта (С₆₀-Arg) (см. таблицу). Это

можно объяснить особенностями структуры изу-

чаемого белка, а именно недоступностью некото-

рых сайтов связывания в силу стерического фак-

тора. Рассчитанная константа связывания С₆₀-Arg

c человеческим сывороточным альбумином (K_а =

6.0×10⁵ 1/М.) сопоставима с константой связыва-

ния, полученной спектрофлуометрическим мето-

V(C₆₀-Arg)

дом (K_а = 14.84×10⁴ 1/М.). Следует отметить, что

Зависимость теплового эффекта взаимодействия аддукта

полученное значение лежит в эффективном диапа-

С₆₀-Arg с человеческим сывороточным альбумином при

зоне 10⁴-10⁵ моль/дм³, что, в свою очередь, свиде-

298.15 K. ΔH - тепловой эффект реакции, V(C₆₀-Arg) -

тельствует о способности альбумином выполнять

объем титранта.

транспортные функции в кровотоке.

Из представленных значений термодинамиче-

вороточным альбумином. На рисунке представ-

ских параметров (см. таблицу) видно, что взаимо-

лена зависимость теплового эффекта реакции

действие аддукта С₆₀-Arg c человеческим сыво-

взаимодействия аддукта C₆₀-Arg с человеческим

роточным альбумином является экзотермическим

сывороточным альбумином при 298.15 K от объ-

процессом. Отрицательные значения ΔH и ΔS яв-

ема титранта. На основе полученных экспери-

ляются типичными при образовании водородных

ментальных данных были рассчитаны параметры

связей, поэтому связывание аддукта С₆₀-Arg с че-

взаимодействия аддукта С₆₀-Arg с человеческим

ловеческим сывороточным альбумином происхо-

сывороточным альбумином на основе термодина-

дит за счет аргининовых остатков фуллеренового

мической модели независимого связывания [14].

аддукта.

Полученное значение стехиометрии взаимо-

Таким образом, установлено, что человеческий

действия показывает, что в точке эквивалентности

сывороточный альбумин связывается с аддуктом

C₆₀-Arg в стехиометрическом соотношении 1:0.7

Термодинамические характеристики связывания С₆₀-

с K_а = 6.0×10⁵ 1/М. Человеческий сывороточный

Arg с человеческим сывороточным альбумином при

альбумин является одним из важнейших транс-

298.15 K^a

портных белков и играет ключевую роль в транс-

Термодинамический параметр

Численное значение

порте жирных кислот, метаболитов и лекарств,

поэтому полученные результаты важны для даль-

K_d, M.

1.7×10^-6

-Arg в био-

нейшего применения производного C₆₀

0.7±0.07

медицине.

ΔH, кДж/моль

-85.3±8.5

Аддукт фуллерена С₆₀-Arg синтезировали в со-

ответствии с методиками, описанными в работах

ΔS, Дж/(моль·K)

-175±17.5

[15, 16]. Дополнительно была проведена иденти-

ΔG, кДж/моль

-33.0±3.3

фикация коммерческого продукта C₆₀-Arg (МСТ

–TΔS, кДж/моль

-52.3±5.2

«Нано», Россия).

Аддукт С₆₀-L-аргинин. ИК спектр, ν, см^-1:

K_a, 1/M.

6.0×10⁵

⁺),

1638 (C-N), 1574, 1401

3430 (NH), 3187 (NH₃

^aK_d - константа диссоциации, K_a - константа связывания,

(COO^-), 1190 (N-C₆₀), 527 (C₆₀). Спектр ЯМР ¹³С,

n - стехиометрический коэффициент связывания С₆₀-Arg

δ_С, м. д.: 27.5, 43.1 (СН₂), 56 (СН), 158 (С{N₃}),

с человеческим сывороточным альбумином, ΔH, ΔS, ΔG -

176.4 (СООН), 139.6, 76.2, 63.7 и 16.4 (С₆₀), 76.2

изменение энтальпии, энтропии и энергии Гиббса в ре-

(НС₆₀). Масс-спектр, m/z: 2112.5 [M - Н]⁺, 1936.4,

зультате связывания аддукта С₆₀-Arg с человеческим сы-

1765.1,

1591.3,

1412.3,

1242.0,

1067.9,

890.4,

вороточным альбумином, T- абсолютная температура.

720.8. Найдено,

%: C 61.35; H 5.37; N 21.20.

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 89 № 8 2019

ИЗОТЕРМИЧЕСКОЕ КАЛОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ

1311

C₁₀₈H₁₁₂N₃₂O₁₆. Вычислено, %: C 61.35; H 5.34; N

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

21.20.

Работа выполнена с использованием оборудо-

Результаты комплексного термического анали-

вания ресурсных центров Научного парка

за аддукта C₆₀-Arg показали, что в температурном

Санкт-Петербургского государственного уни-

диапазоне до 340 K аддукт является термически

верситета «Методы анализа состава вещества» и

устойчивым. В интервале температур 340-950 K

«Термогравиметрические и калориметрические

происходят многоступенчатые процессы разло-

методы исследования».

жения производного (в присутствии O₂), включа-

ющие дегидратацию (-nH₂O), декарбоксилирова-

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

ние (-nCO₂), деазотирование (-N₂) и дегидриро-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

вание (-H₂). Общая потеря массы, составляющая

интересов.

65.9%, соответствует отщеплению восьми остат-

ков L-аргинина. В интервале температур 950-1270

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

K происходит окисление фуллеренового ядра [17].

Krusic P.J., Wasserman E., Keizer P.N., Morton J.R.,

Спектры ЯМР ¹³С регистрировали на приборе

Preston K.F. // Science. 1991. Vol. 254. P. 1183. doi

Bruker Avance III 400 WB (100.64 МГц) с исполь-

10.1126/science.254.5035.1183

зованием тетраметилсилана в качестве внешне-

Morton J.R., Negri F., Preston K.F. // Acc. Chem. Res.

го стандарта. ИК спектры снимали на приборе

1998. Vol. 31. P. 63. doi 10.1021/AR950120P

Shimadzu FTIR-8400S в таблетках с KBr. Масс-

Rašović I. // Mater. Sci. Technol. 2017. Vol. 33. P. 777.

спектры регистрировали на приборе Agilent 1100

doi 10.1080/02670836.2016.1198114

LC/MSD Trap. Комплексный термический анализ

Goodarzi S., Da Ros T., Conde J., Sefat F., Mozafari M. //

проводили на приборе Shimadzu DTG-60H при

Mater. Today. 2017. Vol. 20. P. 460. doi 10.1016/J.

303.62-1274.95 K. Элементный состав определяли

MATTOD.2017.03.017

на приборе Euro EA3028-HT.

Hsieh F.-Y., Zhilenkov A.V., Voronov I.I., Khakina E.A.,

Для проведения изотермического титрования

Mischenko D.V., Troshin P.A., Hsu S. // ACS Appl. Ma-

использовали следующие реагенты: аддукт C₆₀-

ter. Interfaces. 2017. Vol. 9. P. 11482. doi 10.1021/acsa-

Arg (МСТ «Нано», Россия), человеческий сыво-

mi.7b01077

роточный альбумин (Биолот, Россия), раствор

Castro E., Garcia A.H., Zavala G., Echegoyen L. //

Дульбекко (Биолот, Россия) [11]. Изучение взаи-

J. Mater. Chem. (B). 2017. Vol. 5. P. 6523. doi 10.1039/

модействия человеческого сывороточного альбу-

C7TB00855D

мина и аддукта фуллерена C₆₀-Arg проводили при

Zhu X., Xiao S., Zhou D., Sollogoub M., Zhang Y. //

298.15 K методом изотермической калориметрии

Eur. J. Med. Chem. 2018. Vol. 146. P. 194. doi 10.1016/

J.EJMECH.2018.01.040

титрования с использованием прибора Nano ITC

2G (TA Instruments, США), оснащенного золотой

Пиотровский Л.Б. // Рос. нанотехнол. 2007. Т. 2.

№ 7-8. С. 6.

измерительной ячейкой объемом 1 мл. Для про-

ведения измерений в ячейку помещали раствор

Li S., Zhao X., Mo Y., Cummings P.T., Heller W.T. //

J. Nanoparticle Res. 2013. Vol. 15. N 2. P. 1. doi

человеческого сывороточного альбумина (с = 1×

10.1007/s11051-013-1769-0

10^-4 моль/л). После установления равновесия к

содержимому ячейки при непрерывном переме-

10.

Brown J.R. Serum albumin: amino acid sequence.

шивании добавляли раствор аддукта C₆₀-Arg (с =

London: Pergamon Press, 1977. P. 27. doi 10.1016/

1×10^-3моль/л) путем последовательных инъекций

B978-0-08-019603-9.50009-0

по 10 мкл. В качестве среды для протекания изуча-

11.

Yang L.-Y., Hua S.-Y., Zhou Z.-Q., Wang G.-C., Jiang

емой реакции использовали фосфатный буферный

F.-L., Liu Y. // Colloids Surfaces (B). 2017. Vol. 157. P.

раствор Дульбекко. Интервал между инъекциями

261. doi 10.1016/j.colsurfb.2017.05.065

составлял 2400 с, скорость вращения мешалки -

12.

Zhang M.-F., Xu Z.-Q., Ge Y.-S., Jiang F.-L., Liu Y. //

250 об/мин. Точность поддержания температуры в

J. Photochem. Photobiol. (B). 2012. Vol. 108. P. 34. doi

ходе эксперимента составляла ±0.0003 K [11].

10.1016/j.jphotobiol.2011.12.006

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 89 № 8 2019

1312

ПОЧКАЕВА и др.

13. Орлова М.А., Трофимова Т.П., Орлов А.П., Шаталов

16. Jiang G., Yin F., Duan J., Li G. // J. Mater. Sci. Ma-

О.А., Свистунов А.А., Наполов Ю.К., Чехонин В.П. //

ter. Med. 2015. Vol. 26-24. N 1. P. 5384. doi 10.1007/

Онкогематология. 2013. T. 8. № 1. С. 65.

s10856-014-5348-4

14. Herrera I., Winnik M.A. // J. Phys. Chem. (B). 2013.

17. Iurev G.O., Lelet M.I., Pochkaeva E.I., Petrov A.V.,

Vol. 117. P. 8659. doi 10.1021/jp311812a

Semenov K.N., Charykov N.A., Podolsky N.E., Dulne-

15. Hu Z., Guan W., Wang W., Huang L., Tang X., Xu H.,

Zhu Z., Xie X., Xing H. // Carbon. 2008. Vol. 46. P. 99.

va L.L., Sharoyko V.V., Murin I.V. // J. Chem. Thermo-

doi 10.1016/j.carbon.2007.10.041

dyn. 2018. Vol. 127. P. 39. doi 10.1016/j.jct.2018.07.007

Isothermal Calorimetric Titration of Human Serum Albumin

with TheFullerene C₆₀-L-Arginine Adduct

E. I. Pochkaevaa, b, *, Yu. А. Anufrikov^a, V. P. Faenkova^c, V. V. Sharoika, c,

N. А. Charykov^d, and I. V. Murin^a

^aInstitute of Chemistry, St. Petersburg State University, Universitetskii pr. 26, St. Petersburg, 198504 Russia

*e-mail: evgeniyapochkaeva@gmail.com

^bAlmazov National Medical Research Centre, St. Petersburg, Russia

^cPavlov First St. Petersburg State Medical University, St. Petersburg, Russia

^dSt. Petersburg State Institute of Technology (Technical University), St. Petersburg, Russia

Received May 30, 2019; revised May 30, 2019; accepted June 5, 2019

The interaction between fullerene C₆₀-L-arginine adduct and human serum albumin (HSA) was studied using

isothermal calorimetric titration at 298.15 K. As a result, the formation of a С₆₀-Arg-HSA complex with a

stoichiometric ratio of 1:0.7 was revealed.

Keywords: fullerene, arginine, human serum albumin, calorimetric titration

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 89 № 8 2019