ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ, 2020, том 90, № 6, с. 888-895

УДК 541.515:577.112.3:544.431.15:678.048

ПРО(АНТИ)ОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА

АМИНОКИСЛОТ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ В

ПРИСУТСТВИИ ИОНОВ Fe²⁺ И Cu²⁺

^aБелорусский государственный университет, ул. Ленинградская 14, Минск, 220030 Республика Беларусь

^bНаучно-исследовательский институт физико-химических проблем Белорусского государственного университета,

Минск, 220030 Республика Беларусь

*e-mail: yurkovail@tut.by

Поступило в Редакцию 10 февраля 2020 г.

После доработки 10 февраля 2020 г.

Принято к печати 16 февраля 2020 г.

С помощью флуоресцентного зонда (терефталевой кислоты) оценена способность аминокислот и их

производных акцептировать и/или содействовать образованию радикалов HO˙ в системах Cu²⁺-H₂О₂,

Fe²⁺(ЭДТА)-H₂О₂. В диапазоне концентраций 0.005-30 мM. по увеличению значения IC₅₀ аминокислоты

располагаются в ряд: Trp < Phe ≤ Met ≤ His < Gly ≤ Glu < α-Ala < Cys << β-Αla << Tau (система с ионами

Cu²⁺); His ≤ Met < Trp ≤ Cys << β-Αla < Tau ≤ Glu < α-Ala < Gly (система со свободными ионами Fe²⁺).

В присутствии меди(II) цистеин и его производные, глутамин, α-аланин и гистидин (S) способствуют

образованию HO˙ и действуют как антиоксиданты при молярном соотношении S:Cu²⁺ >2:1, а для гисти-

дина при ≥ 1:1. Цистеин является прооксидантом в системе с Fe²⁺-ЭДТА.

Ключевые слова: аминокислота, гидроксильный радикал, прооксидант, ион Fe²⁺(Cu²⁺), флуоресцентный

зонд, радикал-акцепторная активность

DOI: 10.31857/S0044460X2006008X

Аминокислоты и их производные являются

и токсичная частица [E°(HO^·, H⁺/H₂O) = 2.73 В,

частью антиоксидантной системы организма для

E°' = 2.31 В при рН = 7.25], известная в настоя-

защиты клеток от окислительного стресса [1, 2].

щее время [2]. Радикалы НО˙ инициируют процес-

Последний развивается в результате нарушения

сы деструкции важнейших биомолекул с высокой

баланса оксиданты-антиоксиданты и характери-

скоростью (10⁹-10¹⁰ M.^-1с^-1) и играют решающую

зуется чрезмерным накоплением активных форм

роль в развитии патологий [2, 3]. В настоящее вре-

кислорода (О₂˙^-, Н₂О₂, НСlО, НО˙) [2]. Активные

мя нет никакой известной ферментативной реак-

формы кислорода способны индуцировать по-

ции, способной деактивировать НО˙ in vivo. Один

вреждения компонентов клеток и органов в целом.

из путей образования НО˙ в организме - это разло-

Окислительный стресс играет ключевую роль в

жение H₂О₂, катализируемое ионами переходных

развитии многих патологий (воспаления, атеро-

металлов (Fe²⁺, Cu⁺ и др.) (схема 1) [2, 3].

склероз, инсульт, инфаркт, диабет и др.) [1, 2].

Увеличение свободных (не связанных с белка-

Среди активных форм кислорода гидроксиль-

ми или слабо связанных с аминокислотами) ионов

ный радикал (НО˙) - самая реакционноспособная

меди и железа вследствие нарушения гомеостаза

Схема 1.

Cu²⁺(Fe³⁺) + H₂O₂ → Cu⁺(Fe²⁺) + O₂˙^- + 2H⁺, k_v ~ 4.6×10² М.^-1с^-1

O₂˙^- + Fe³⁺(Cu²⁺) → Fe²⁺(Cu⁺) + O₂, k_v ~ 1×10⁸ (1×10⁹) М.^-1с^-1

Fe²⁺(Cu⁺) + H₂O₂ → Fe³⁺(Cu²⁺) + HO˙ + OH^-, k_v ~ 76 (4.7×10³) М.^-1с^-1

888

ПРО(АНТИ)ОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

889

коррелирует с развитием заболеваний (сердеч-

Схема 2.

но-сосудистые, нейродегенеративные, рак и др.),

патогенез которых сопряжен с образованием ак-

тивных форм кислорода [4].

Роль аминокислот и их производных в регу-

хиометрией реакции концентрация радикалов НО˙

лировании активных процессов, опосредованных

прямо пропорциональна интенсивности флуорес-

активными формами кислорода, в биосистемах

ценции 2-гидрокситерефталата.

интенсивно исследуется [1, 2]. Однако, несмотря

на большой накопленный материал, детальный

Аминокислоты и их производные могут различ-

механизм вовлечения аминокислот и их произ-

ным образом влиять на уровень НО˙ в тест-систе-

водных в регулирование свободно-радикальных

ме, включающей ионы Fe²⁺(Cu²⁺) и терефталевую

реакций, в частности в условиях Fe²⁺(Cu²⁺)-опо-

кислоту. С одной стороны, аминокислоты, взаи-

средованного генерирования HO˙, остается откры-

модействуя с Fe²⁺(Cu²⁺), могут влиять на способ-

тым. В присутствии ионов переходных металлов

ность редокс-систем генерировать НО˙. С другой

(Fe²⁺, Cu²⁺, Co²⁺) аминокислоты самостоятельно

стороны, они могут акцептировать образующиеся

или в сочетании с другими веществами способны

НО˙, и, тем самым, конкурировать с терефталевой

как ингибировать, так и интенсифицировать про-

кислотой 1 за их присоединение (схема 2). В ко-

цессы окисления в клетках [1, 2, 5-9]. Исследова-

нечном итоге эти процессы будут приводить к из-

ния антиоксидантных свойств аминокислот и их

менению концентрации 2-гидрокситерефталата 2.

производных проводятся при различных условиях

Про/антиоксидантные свойства веществ оце-

in vitro/vivo, зачастую данные противоречивы, их

нивали по их способности влиять на кинетику

трудно сопоставить и прогнозировать действие от-

гидроксилирования терефталевой кислоты и ин-

дельных аминокислот.

дексу IC₅₀ (концентрация полумаксимального ин-

Задачей данной работы было оценить способ-

гибирования).

ность различных аминокислот и их производных

Действие аминокислот и их производных в

акцептировать и/или содействовать образованию

присутствии ионов меди(II). В условиях Cu²⁺-

радикалов HO˙ в присутствии как ионов Fe²⁺, так и

опосредованного генерирования НО˙ наиболь-

Cu²⁺ при одинаковых условиях. Для тестирования

шие различия во влиянии аминокислот и их про-

был выбран метод флуоресцентных зондов, бази-

изводных на окисление терефталевой кислоты

рующийся на использовании терефталевой кисло-

выявлено на начальном участке исследованно-

ты. Данный метод обладает высокой чувствитель-

го концентрационного диапазона. Наибольшей

ностью и прост в исполнении. Для генерирования

НО˙-акцептирующей способностью обладают

HO˙ использовали следующие редокс-системы:

ароматические аминокислоты Trp и Phe. В их при-

Cu²⁺(Fe²⁺)-H₂О₂, Fe²⁺/ЭДТА-H₂О₂. Концентраци-

сутствии значительно снижается выход 2-гидрок-

онный диапазон тестируемых соединений нахо-

ситерефталата и они обладают низкими индекса-

дился в области 5×10^-6-2×10^-2 моль/л, в отдель-

ми IC₅₀ (см. таблицу).

ных случаях он расширялся.

Среди серосодержащих аминокислоты лучшей

Терефталевая кислота является специфичным и

антирадикальной активностью обладает Met и его

высокочувствительным детектором НО˙ (~10^-9 М.),

сульфоксид. В присутствии Cys (с = 5×10^-6-1×

она не реагирует с другими активными форма-

10^-4 моль/л) и его N-ацетилированного аналога

ми кислорода (О₂˙^-, ¹О₂, Н₂О₂) [10]. Вследствие

(NAC) гидроксилирование терефталевой кислоты

симметричности молекулы терефталевая кислота

усиливается в значительной степени. Это свиде-

(рK_а1 = 3.51, рK_а2 = 4.82) взаимодействует с НО˙

тельствует о том, что уровень НО˙ в системе воз-

с образованием только одного моногидроксилиро-

растает. В указанном диапазоне стимулирующим

ванного изомера - 2-гидрокситерефталата 2. Дан-

эффектом обладают также Glu и протеиногенный

ный продукт является стабильным и в отличие от

α-Ala. Увеличение выхода 2-гидрокситерефталата

терефталевой кислоты обладает флуоресценцией

наблюдается и в присутствии His. Однако активи-

(λ_ex = 315 нм, λ_em= 418 нм). В соответствии со сте-

рующее действие His проявляется в более узкой

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 6 2020

890

МИЛАЧ и др.

Индексы IC₅₀ исследованных соединений и константы скоростей реакций с гидроксильным радикалом

IC50, ммоль/л

Соединение

²⁺-H₂O₂

Fe²⁺-H₂O₂

Fe²⁺/ЭДТА-H₂O₂

kНО˙, М.^-1∙с^-1 [3, 11]

(0.05:5 ммоль/л)

(0.1:1 ммоль/л)

(0.1:0.1:1 ммоль/л)

Trp

0.015 ± 0.001

0.072 ± 0.008

0.071 ± 0.007

1.3×10¹⁰

(рН = 6.0-8.5)

Phe

0.071 ± 0.006

6.5×10⁹

(рН = 5.8-8)

Met

0.075 ± 0.006

0.047 ± 0.005

8.3×10⁹ (рН = 6-7)

MetSO

0.046 ± 0.004

0.083 ± 0.008

1×10¹⁰

His

0.078 ± 0.007

0.038 ± 0.004

0.280 ± 0.030

5×10⁹ (рН = 6.0-7.0)

Gly

0.158 ± 0.015

24.8 ± 1.70

> 30

1.7×10⁷ (рН = 5.8-6.0)

Glu

0.189 ± 0.021

7.88 ± 0.46

1.55 ± 0.14

2.3×10⁸ (рН = 6-7)

α-Ala

0.241 ± 0.026

9.26 ± 0.74

9.97 ± 0.80

7.7×10⁷ (рН = 5.5-6.8)

Cys

0.69 ± 0.08

0.082 ± 0.008

3.28 ± 0.29

3.5×10¹⁰, 4.7×10¹⁰

(рН = 7)

NAC

1.16 ± 0.093

0.099 ± 0.01

1.99 ± 0.18

1.36×10¹⁰

β-Ala

5.67 ± 0.39

3.42 ± 0.32

5.25 ± 0.47

Tau

>30

7.37 ± 0.59

2.4×10⁶-1.4×10⁷

GSH

0.111 ± 0.010

0.034 ± 0.003

0.739 ± 0.072

1.3×10¹⁰ (рН = 5.5)

GSSG

0.024 ± 0.002

0.222 ± 0.024

0.466 ± 0.050

9.6×10⁹ (рН = 7)

Cyst

0.344 ± 0.035

Car

0.073 ± 0.007

0.041 ± 0.004

0.289 ± 0.030

4.0×10⁹

NaN₃

0.051 ± 0.005

0.044 ± 0.004

0.046 ± 0.005

1.2×10¹⁰

(pH = 7.9-13)

ДМСО

0.035 ± 0.004

7.0×10⁹

области концентраций (5×10^-6-1×10^-5 моль/л) и он

татов для Car, His и β-Αla указывают на важность

имеет, в отличие от Cys, Glu и α-Ala, более низкий

наличия пептидной связи для проявления антира-

уровень IC₅₀. Все аминокислоты, обнаруживаю-

дикальных свойств дипептида.

щие прооксидантный эффект, работают как анти-

GSH (L-γ-глутамил-L-цистеинилглицин) при

оксиданты при молярном соотношении аминокис-

с = 5×10^-6-5×10^-5 моль/л интенсифицирует окис-

лота:Cu²⁺ >2:1, за исключением His, для которого

ление терефталевой кислоты с образованием

оно ≥1:1. НО˙-Акцепторные свойства Gly прояв-

2-гидрокситерефталата. При этом его окисленная

ляются также при соотношении аминокислота:

форма (GSSG) не обладает таким эффектом. Для

Cu²⁺ > 2:1, а непротеиногенного β-Αla - при соот-

дисульфида цистамина (Сyst), известного радио-

ношении >10:1. Индекс IC₅₀ для β-Αla в >20 раз

протектора, прооксидантного действия также не

выше, чем для α-Ala. Сульфокислота Tau, не вхо-

наблюдали. Из полученных данных следует, что

дящая в состав белков, не влияет на гидроксили-

влияние GSH на гидроксилирование терефталевой

рование терефталевой кислоты.

кислоты, как и для свободных аминокислот, зави-

Значимую роль в регулировании процессов,

сит от соотношения пептид:Cu²⁺. Максимальный

опосредованных активными формами кислоро-

прооксидантный эффект GSH наблюдается при

да, играют такие производные аминокислот, как

соотношении 1:1, а заметный антиоксидантный -

карнозин (Car) и глутатион (GSH) [1, 2]. В рабо-

при >2:1. Величины его индекса IC₅₀ составляют

те выявлено, что Car (β-аланил-L-гистидин) эф-

0.056, 0.111, 0.160 и 0.210 ммоль/л соответствен-

фективно снижает уровень НО˙ в той же области

но для с_Cu2+ = 0.025, 0.05, 0.075 и 0.1 ммоль/л при

концентраций (>1×10^-5 моль/л), где проявляются

[H₂O₂] = const. Прооксидантные свойства GSH

аналогичные свойства His. Совокупность резуль-

коррелируют с таковыми для Cys и Glu, входящи-

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 6 2020

ПРО(АНТИ)ОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

891

ми в его состав. Несмотря на свое активирующее

[14]. Надо отметить, что дисульфид GSSG, в от-

действие в малых дозах, GSH имеет низкий индекс

личие от GSH, обладает более высокой антиради-

IC₅₀, сравнимый с таковым для Car.

кальной активностью. В работе [15] показано, что

в условиях Cu⁺-опосредованного генерирования

В Cu²⁺-содержащей системе по увеличению

НО˙ цистин и GSSG более эффективны в ингиби-

значений IC₅₀ аминокислоты располагаются в сле-

ровании ДНК-повреждений, чем Cys и GSH.

дующий ряд, включающий референтный азид на-

трия: Trp < NaN₃ ≤ Phe ≤ Met ≤ His < Gly ≤ Glu <

Полученные данные указывают на то, что свой

α-Ala < Cys << β-Αla << Tau.

вклад в протекторное действие аминокислоты

вносит их способность связывать ионы Cu²⁺/Cu⁺

В соответствии с работами [3, 11], по снижению

в комплексы [1, 16-19]. Cys и GSH образуют ком-

константы скорости реакции с гидроксильным

плексы как с Cu²⁺, так и с Cu⁺, причем более ста-

радикалом (kНО˙) исследованные аминокислоты

бильные с восстановленной медью [16]. Антиок-

располагаются следующим образом: Cys ≥ Trp ≥

сидантный эффект Gly, α-Ala и Glu, несмотря на

NaN₃> Met > His ≈ Phe >> Glu > α-Ala > Gly >

низкие значения kНО˙, видимо, связан с их хорошей

Tau (см. таблицу). Сопоставление величин kНО˙ и

аффинностью к ионам Cu²⁺/Cu⁺ [17-19]. Gly, α-Ala

IC₅₀ исследованных аминокислот указывают на то,

и His в низких концентрациях обладают в ~3-4 раза

что с их участием в условиях Cu²⁺-опосредован-

большей Cu²⁺-хелатирующей активностью, чем

ного образования НО˙ протекают сложные про-

Tau и β-Ala [20]. His и Car (0.5-5 ммоль/л) хорошо

цессы. Полученные данные обращают внимание

ингибировали Н₂О₂-CuSO₄-аскорбат-индуциро-

на то, что нужно учитывать не только скорость

ванное окисление ДНК, а β-Ala был неэффективен

взаимодействия аминокислоты с НО˙, но также

[7]. Антиоксидантные свойства MetSO снижаются

их способность влиять на соотношение Cu²⁺:Cu⁺

на 25% при переходе от систем с несвязанными

и координировать ионы меди таким образом, что

Cu⁺ к хелатированным 2,2'-бипиридином [21].

это может воздействовать на каталитическую ак-

Действие аминокислот и пептидов зависит от

тивность последних в реакциях с H₂O₂. Так, от-

их молярного соотношения с Cu²⁺, что может быть

сутствие НО˙-акцепторной активности Таu согла-

связано с процессами комплексообразования. Уве-

суется с его низкой константой (kНО˙) и данными

личение количества Cys или GSH в 2 раза в срав-

работ [9, 12], указывающими на то, что он слабо

нении с Cu(I) сопровождается образованием ста-

ингибирует свободно-радикальную деструкцию

бильных комплексов, что препятствует участию

биомолекул, инициированную НО˙. Однако в слу-

Cu(I) в реакции Фентона (схема 1) [16, 22, 23].

чае Cys, Gly и α-Ala такой корреляции нет, хотя в

Действие аминокислот и их производных в

условиях γ-радиолиза первый проявляет высокие

присутствии ионов железа(II). В условиях Fe²⁺-

НО˙-акцепторные свойства в отличие от простей-

Н₂О₂-опосредованного окисления терефталевой

ших аминокислот [2]. Известно, что биотиолы -

кислоты влияние тестируемых соединений от-

эффективные радиопротекторы [2].

личается от их действия в присутствии Cu²⁺ (см.

Прооксидантный эффект аминокислот и про-

таблицу). Важным отличием является то, что ни

изводных можно объяснить нуклеофильными

одна аминокислота не обнаруживает прооксидант-

свойствами их функциональных групп, способ-

ного эффекта. Самый низкий индекс IC₅₀ характе-

ных восстанавливать Cu(II) до Cu(I) и, тем самым,

рен для His, он обладает высокой антирадикальной

содействовать ускорению разложения H₂О₂ и, сле-

активностью при данных условиях. Хотя, согласно

довательно, повышению уровня НО˙. Наибольшее

работе [8], в присутствии аскорбата His ускорял

прооксидантное действие проявляют Cys и его

деструкцию биомолекул, индуцированную Fe²⁺-

производные, несущие SH-группу. Это согласу-

Н₂О₂. Cys и его производные являются эффектив-

ется с двоякой ролью биотиолов в регулировании

ными НО˙-акцепторами, а Glu, α-Ala и Gly теряют

свободнорадикальных процессов [5, 6, 9]. His за

свою активность, что отражается в их высоких

счет имидазольной группы также может служить

значениях IC₅₀. Среди пептидов отличие наблю-

нуклеофилом и способствовать восстановлению

дается только для GSH, в диапазоне 5×10^-6-5×

Cu²⁺ [13], и, тем самым, активизировать процес-

10^-4 моль/л он более эффективен, чем его окислен-

сы деструкции, что согласуется с данными работы

ная форма.

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 6 2020

892

МИЛАЧ и др.

дантный эффект), так и ослаблять (антиоксидант-

ный) каталитическую активность металла.

Наиболее существенное отличие в действии

аминокислот в сравнении с системой со свободны-

ми ионами Fe²⁺ выявлено для Cys и его N-ацети-

лированного аналога. Данные тиолы способству-

ют гидроксилированию терефталевой кислоты в

диапазоне концентраций 5×10^-6-1×10^-3 моль/л, за-

метный ингибирующий эффект наблюдали при с =

5×10^-3 моль/л. GSH не оказывает прооксидантного

действия, однако протекторный эффект, схожий по

силе в системе Fe²⁺-H₂О₂, оказывает при увеличе-

нии концентрации более чем в 10 раз.

Способность тестируемых соединений (S) хелатиро-

Прооксидантное действие биотиолов (RSН)

вать Fe²⁺ (1, [S] = 10 ммоль/л) и ингибировать образо-

можно объяснить нуклеофильными свойствами

вание 2-гидрокситерефталата 2 в тест-системе тереф-

талевая кислота-Fe²⁺-H₂О₂ (0.06:0.1:1 ммоль/л) (2,

сульфгидрильной группы. Перенос электрона в

[S] = 0.5 ммоль/л).

водной среде от Cys и GSH к ионам железа(III)

при физиологических условиях протекает очень

В системе, содержащей свободные Fe²⁺, по уве-

медленно [2]. Активность тиолов коррелирует с

личению индекса IC₅₀ аминокислоты располага-

pK_a-значениями их SH-групп (GSH 9.2, Cys 8.5,

ются в следующий ряд: His ≤ NaN₃ ≤ Met < Trp ≤

рН = 7.4). Окислительная модификация низкомо-

Cys << β-Αla < Tau ≤ Glu < α-Ala < Gly.

лекулярных тиолов предпочтительна при повыше-

НО˙-Акцепторные свойства аминокислот ис-

нии их нуклеофильных свойств путем перевода в

следовали также в системе Fe²⁺-H₂O₂, в которую

тиолатную форму (RS¯). В выбранных условиях

вводили этилендиаминтетрауксусную кислоту

эксперимента, по-видимому, возможно прямое

(ЭДТА), образующую комплекс Fe²⁺/ЭДТА (lgK =

взаимодействие Cys с комплексом Fe³⁺/ЭДТА, что

14.3). Добавка ЭДТА, с одной стороны, повыша-

приводит к восстанавлению ионов Fe³⁺ и, тем са-

ет эффективность системы, т. е. усиливает ката-

мым, возвращает их в каталитический цикл раз-

литический эффект железа(II) в реакции Фентона

ложения H₂О₂. Активирующее действие GSH и

(схема 1) {E°(Fe³⁺/Fe²⁺) = 0.77 В, E°(Fe³⁺-ЭДТА/

Cys на Fe²⁺/ЭДТА-опосредованный свободнора-

Fe²⁺-ЭДТА) = 0.13 В [2]}, а с другой - препятству-

дикальный процесс наблюдали в работе [9], хотя,

ет связыванию ионов железа с тестируемыми сое-

согласно данным [6], трипептид и N-ацетилиро-

динениями.

ванный цистеин ускоряли пероксидное окисление

липидов, индуцированное нехелатированными ио-

Согласно полученным данным, His и Car эф-

нами Fe²⁺.

фективнее в системе со свободными ионами Fe²⁺,

что может указывать на вклад в их антиоксидант-

Таким образом, методом флуоресцентных зон-

ное действие связывания Fe²⁺/Fe³⁺ [24, 25]. В на-

дов выявлено различие в антиоксидантном дей-

шем эксперименте Fe²⁺-хелатирующая активность

ствии аминокислот и их производных в зависи-

His, в отличие от других аминокислот, наилучшим

мости от того, какие ионы Fe²⁺(Cu²⁺) опосредуют

образом коррелирует с антирадикальной (см. рису-

образование радикалов НО˙. Отдельные аминокис-

нок). Согласно данным работы [24], His эффекти-

лоты и их производные - эффективные промоторы

вен в связывании Fe(III), а Glu нет. Gly и α-Ala спо-

или протекторы только в присутствии Cu²⁺. Дан-

собны образовывать комплексы с ионами железа,

ные простого экспресс-анализа позволяют сделать

хотя и менее прочные, чем с ионами меди [26].

вывод о том, что в присутствии ионов Fe²⁺(Cu²⁺)

Однако данные аминокислоты не проявляют зна-

про(анти)оксидантное действие аминокислот и

чимой активности в присутствии Fe²⁺. Надо отме-

пептидов обусловлено балансом их НО˙-акцептор-

тить, что образование комплексов аминокислоты с

ных, восстановительных и комплексообразующих

ионами металлов может как усиливать (проокси-

свойств. Полученные результаты полезны для раз-

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 6 2020

ПРО(АНТИ)ОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

893

работки эффективных антиоксидантов, нутрицев-

ления каждого компонента растворы тщательно

тиков, лекарственных препаратов на основе ами-

перемешивали на приборе Vortex Mixer. Далее

нокислот и понимания детального механизма их

тест-системы инкубировали при комнатной темпе-

действия при определенных условиях.

ратуре в течение 5 или 9 мин. Время с момента по-

следнего перемешивания до измерения в каждой

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

серии было одинаковым и отмечалось строго по

В работе использовали L-цистеин (Cys), N-аце-

секундомеру. Для определения длительности ин-

тил-L-цистеин (NAC), таурин (2-аминоэтансуль-

кубирования теста изучали кинетическое поведе-

фоновая кислота) (Tau), L-метионин (Met), L-ме-

ние реакции образования 2-гидрокситерефталата.

тионин сульфоксид (МеtSO), L-гистидин (His),

После введения H₂O₂ в реакционную смесь тереф-

L-триптофан (Trp), глицин (Gly), L-фенилаланин

талевая кислота-M²⁺ интенсивность флуоресцен-

(Phe), L-глутаминовую кислоту (Glu), α-аланин

ции при 418 нм записывали как функцию времени.

(α-Ala), β-аланин (β-Ala), карнозин (Car), глутати-

Данные оценивали, используя метод конкури-

он восстановленный (GSH) и окисленный (GSSG),

рующих реакций. Терефталевая кислота 1 и те-

динатриевую соль глицеро-2-фосфата (GP), тереф-

стируемое соединение (S) конкурируют за взаи-

талевую кислоту, феррозин (Fz) производста фир-

модействие с гидроксильным радикалом (схема 2).

мы «Sigma-Aldrich» (Германия). Азид натрия, ги-

Сигнал флуоресценции (F) измеряли как функцию

дропероксид, диметилсульфоксид, цистамин, соли

концентрации тестируемого соединения ([1] = }

металлов (CuSO₄·5H₂O, FeSO₄·7H₂O) и натрие-

const) и строили графики в координатах F-[S].

вая соль ЭДТА - коммерческие продукты (ЗАО

Так как флуоресцентный сигнал в системе про-

«Вектон», Россия). Все использованные в работе

порционален только концентрации 2-гидроксите-

реактивы и растворители имели аналитическую

рефталата 2, то для обработки экспериментальных

степень чистоты. Водные растворы готовили с ис-

результатов использовали адаптированное уравне-

пользованием деионизированной воды.

ние Штерна-Фольмера (1).

Cпектры флуоресценции в диапазоне

350-

(1)

550 нм получали на спектрофлуориметре Solar

CM2203. Оптическое поглощение проб измеряли

Здесь [S] и [1] - концентрации тестируемого сое-

на спектрофотометре Specord S600.

динения и терефталевой кислоты соответственно;

Определение антирадикальной активно-

F₀ и F - интенсивность сигнала флуоресценции

сти соединений. Тест-система для исследования

2-гидрокситерефталата при λ_em = 418 нм в отсут-

НО˙-акцепторной способности соединений име-

ствие и в присутствии тестируемого соединения

ла следующий состав: терефталевая кислота-

соответственно.

Cu²⁺(Fe²⁺, Fe²⁺/ЭДТА)-H₂O₂, фосфатно-солевой

Для расчета индекса IC₅₀ уравнение (1) пере-

буфер (PBS, 10 ммоль/л, рН = 7.4). Общий объем

группировали и преобразовали в логарифмиче-

реакционной системы составлял 2 мл. Изначально

скую зависимость, а затем получали прямую в

готовили исходные концентрированные растворы

координатах: log[F₀/F - 1]- log[S]. Концентрацию

реагентов, затем их аликвоты добавляли в тест-си-

стему для достижения необходимых концентра-

тестируемого вещества, при которой наблюда-

ется уменьшение флуоресценции по сравнению

ций компонентов. Исходный раствор терефтале-

вой кислоты (с = 1×10^-2 моль/л) готовили путем

с контролем в два раза (индекс IC₅₀), получали

растворения 0.0118 г кислоты в 25 ммоль/л раство-

при значении log(F₀/F - 1) = 0 [если F = 1/2F_o, то

ре NaOH. В тест-системе конечная концентрация

log(F₀/F - 1) = 0]. В качестве контроля использова-

терефталевой кислоты составляла 6×10^-5 моль/л.

ли NaN₃, что объясняется его устойчивыми анти-

радикальными свойствами в условиях Fe²⁺(Cu²⁺)-

При тестировании соединений строго соблюда-

опосредованного генерирования НО˙ [2].

ли следующий порядок добавления растворов ре-

агентов: PBS, терефталевая кислота, тестируемое

Для расчета относительной константы ско-

соединение, соль металла, H₂O₂. Для достижения

рости реакции (kS,HO˙) тестируемого соедине-

однородности во всем объеме пробы после добав-

ния (S) с НО˙ строили графики в координатах:

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 6 2020

894

МИЛАЧ и др.

(F₀/F - 1)-([S]/[1]). По тангенсу угла наклона пря-

экспериментальной серии проводили 3-5 парал-

мой (F₀/F - 1)-([S]/[1]), равному k_S,ОН/(k1,ОН·[1]),

лельных опытов. Оценку линейной связи между

рассчитывали величину kS,HO˙ с учетом того, что

количественными переменными проводили с по-

k1,НО˙ = 4.4×10⁹ M.^-1·с^-1 [10]. Рассчитанные в дан-

мощью коэффициента Пирсона. Гипотезу о нали-

ной работе значения kS,НО˙ для NaN₃, ДМСО, Trp

чии достоверной положительной корреляции счи-

и Tau, равные 8.6×10⁹, 5.2×10⁹, 1.06×10¹⁰, 1.3×

тали подтвержденной при R² = 0.97-0.99 (р < 0.05).

10⁷ М.^-1с^-1 соответственно, хорошо согласуют-

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

ся с литературными данными (см. таблицу). Это

дополнительно указывает на то, что выбранный

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

метод тестирования хорошо подходит для экс-

интересов.

пресс-оценки антирадикальной активности соеди-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

нений при заданных условиях.

Ингибирующую активность соединений (%)

1. Vertuani S., Angusti A., Manfredini S. // Curr.

Pharm. Des. 2004. Vol. 10. P. 1677. doi 10.2174/

рассчитывали по уравнению (2).

1381612043384655

(2)

2. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology

and medicine, fourth edition. Oxford: University press,

Определение Fe²⁺-хелатирующей способно-

2012. 851 p.

сти соединений. Способность соединений хелати-

3. Buxton G.V., Greenstock C.L., Helman W.P., Ross A.B. //

ровать ионы Fe²⁺ оценивали в соответствии с ме-

J. Phys. Chem. Ref. Data. 1988. Vol. 17. N 2. P. 513. doi

тодикой, основанной на образовании устойчивого

10.1063/1.555805

водорастворимого комплекса между феррозином

4. Valko M., Jomova K.,·Rhodes C.J., Kuca K., Musülek K. //

(Fz) и Fe²⁺ (рН = 4-9) [27]. Тестируемые соедине-

Arch. Toxicol. 2016. Vol. 90. P. 1. doi 10.1007/s00204-

ния конкурируют с Fz за связывание Fe²⁺, в резуль-

015-1579-5

тате чего уменьшается количество окрашенного

5. Yin J.-J., Fu P.P., Lutterodt H., Zhou Y.-T., Antho-

комплекса Fe(II)Fz₃.

line W.E., Wamer W. // J. Agric. Food Chem. 2012.

Vol. 60. P. 2554. doi 10.1021/jf204724w

К 0.2 мл образца добавляли 0.2 мл раствора

6. Sagrista M.L., Garcia A.E., Africa De Madariaga M.,

FeSO₄

(5×10^-5 моль/л). Реакцию инициирова-

Mora M. // Free Rad. Res. 2002. Vol. 36. N 3. P. 329.

ли добавлением 0.2 мл раствора феррозина (2.5×

doi 10.1080/10715760290019354

10^-4 моль/л). Смесь хорошо встряхивали и остав-

7. Mozdzan M., Szemraj J., Rysz J., Nowak D. // Basic

ляли при комнатной температуре в темноте на

Clin. Pharmacol. Toxicol. 2005. Vol. 96. P. 352. doi

15 мин. После достижения в смеси равновесия

10.1111/j.1742-7843.2005.pto_03.x

измеряли оптическое поглощение пробы при λ =

8. Шендикова Е.Н., Мельситова И.В., Юркова И.Л. //

562 нм. Глицеро-2-фосфат и ЭДТА были использо-

Химия высоких энергий. 2016. Т. 50. N 4. С. 260.;

ваны в качестве стандартных соединений.

Shendikova E.N., Mel’sitova I.V., Yurkova I.L. // High

Хелатирующую активность

(%) соединений

Energy Chem. 2016. Vol. 50. N 4. Р. 249. doi 10.7868/

рассчитывали по уравнению (3).

S0023119316040173

9. Шендикова Е.Н., Мельситова И.В., Юркова И.Л. //

(3)

Химия высоких энергий. 2017. Т. 51. N 5. С. 380.;

Shendikova E.N., Mel’sitova I.V., Yurkova I.L. // High

Здесь A_к и A_о - величина оптической плотности

Energy Chem. 2017. Vol. 51. N 5. P. 363. doi 10.7868/

комплекса Fe(II)Fz₃ соответственно без добавок и

S002311931705014X

в присутствии исследуемого образца.

10. Page S.E., Arnold W.A, McNeill K. // J. Environ. Monit.

2010. Vol. 9. N 12. P. 1658. doi 10.1039/c0em00160k

Статистический анализ. Для обработки полу-

11. Aruoma O.I., Halliwell B., Hoey B.M., Butler J. //

ченных экспериментальных результатов применя-

Biochem J. 1988.Vol. 256. P. 251. doi 10.1042/

ли методы математической статистики, включая

bj2560251

статистические функции программ Excel и Origin

12. Shi X., Flynn D.C., Porter D.W., Leonard S.S.,

8. Достоверность полученных результатов контро-

Vallyathan V., Castranova V. // Ann. Clin. Lab. Sci.

лировали с помощью t-теста Стьюдента. В каждой

1997. Vol. 27. P. 365.

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 6 2020

ПРО(АНТИ)ОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

895

13. Christensen A.M., Schaefer J., Kramer K.J., Morgan T.D.,

21. Ramoutar R.R., Brumaghim J.L. // Main Group Chem.

Hopkins T.L. // J. Am. Chem. Soc. 1991. Vol. 113.

2007. Vol. 6. P. 143. doi 10.1080/10241220802012387

P.6799. doi 10.1021/ja00018a013

22. Hanna P.M., Mason R.P. // Arch. Biochem.

14. Gutierrez-Correa J., Stoppani A.O. // Free Rad. Res.

Biophys. 1992. Vol. 295. P. 205. doi 10.1016/0003-

Vol. 27. P. 543. doi 10.3109/10715769709097858

9861(92)90507-s

15. Battin E.E., Brumaghim J.L. // J. Inorg. Biochem. 2008.

23. Spear N., Aust S.D. // Arch Biochem Biophys. 1995.

Vol. 102. P. 2036. doi 10.1016/j.jinorgbio.2008.06.010

Vol. 317. Р. 142. doi 10.1006/abbi.1995.1146

16. Fernanda M., Leal C., van den Berg C.M.G. //

24. Nair N.G. Perry G.S., Smith M.A., Reddy V.P. // J.

Aquatic Geochem. 1998. Vol. 4. P. 49. doi 10.1023/

Alzheimer’s Dis. 2010. Vol. 20. P. 57. doi 10.3233/

A:1009653002399

JAD-2010-1346

17. Cerda B.A., Wesdemiotis C. // J. Am. Chem. Soc. 1995.

25. Vera-Aviles M., Vantana E., Kardinasari E., Koh N.L.,

Vol. 117. P. 9734. doi 10.1021/ja00143a017

Latunde-Dada G.O. // Pharmaceuticals. 2018. Vol. 11.

18. Senapati1 U., Mandal B., Bankura K.P. // Rasayan

P. 111. doi 10.3390/ph11040111

J. Chem. 2017. Vol. 10. P. 981. doi 10.7324/

26. Marino T., Toscano M., Russo N., Grand A. // J. Phys.

RJC.2017.1031798

Chem. (B). 2006. Vol. 110. P. 24666. doi 10.1021/

19. Umadevi P., Senthilkumar L. // RSC Adv. 2014. Vol. 90.

P. 49040. doi 10.1039/C4RA08155B

jp0645972

20. Wu H.-C., Shiau C.-Y., Chen H.-M., Chiou T.-K. // J.

27. Carter P. // Anal. Biochem. 1971. Vol. 40. P. 450. doi

Food Drug Anal. 2003. Vol. 11. P. 148.

10.1016/0003-2697(71)90405-2

Pro(anti)oxidant Properties of Amino Acids

and Their Derivatives in The Presence of Fe²⁺ and Cu²⁺ Ions

O. A. Milach^a, I. V. Mel’sitova^a, and I. L. Yurkovaa,b,*

^aBelarussian State University, 220030 Belarus

^bResearch Institute of Physicochemical Problems, Belarussian State University, Minsk, 220030 Belarus

*e-mail: yurkovail@tut.by

Received February 10, 2020; revised February 10, 2020; accepted February 16, 2020

Fluorescent probe, terephthalic acid, was used for rapid analysis of the ability of amino acids and their deriva-

tives to accept and/or promote the formation of HO˙ radicals in the Cu²⁺-H₂O₂, Fe²⁺/EDTA-H₂O₂ systems. In

the concentration range of 0.005-30 mM., according to the increase in IC₅₀, amino acids are ranked as follows:

Trp < Phe ≤ Met ≤ His < Gly ≤ Glu < α-Ala < Cys << β-Αla << Tau (system with Cu²⁺); His ≤ Met < Trp ≤

Cys << β-Αla < Tau ≤ Glu < α-Ala < Gly (system with free Fe²⁺). In the presence of copper(II), Cys and its

derivatives, Glu, α-Ala, His (S) intensify HO˙ formation, and act as antioxidants in molar ratio of S:Cu²⁺ > 2:1,

only for His this ratio is ≥1:1. Cys is also a prooxidant in the system with Fe²⁺/EDTA.

Keywords: amino acid, hydroxyl radical, prooxidant, Fe²⁺(Cu²⁺) ion, fluorescent probe, radical scavenging

activity

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 6 2020