ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ, 2020, том 90, № 7, с. 1124-1132

УДК 632.938.2:602

НАНОЧАСТИЦЫ ХИТОЗАН-ТРИПОЛИФОСФАТ:

СИНТЕЗ МЕТОДОМ ИОННОГО ГЕЛЕОБРАЗОВАНИЯ,

СВОЙСТВА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

И. И. Новикова^a, И. Л. Краснобаева^a

^aВсероссийский научно-исследовательский институт защиты растений,

Подбельского шоссе 3, Пушкин, 196608 Россия

^bСанкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, 199034 Россия

*e-mail: elzavpopova@mail.ru

Поступило в Редакцию 3 февраля 2020 г.

После доработки 3 февраля 2020 г.

Принято к печати 6 февраля 2020 г.

Методом ионного гелеобразования хитозана (M 6.5×10³ и 60×10³ Да)в присутствии триполифосфата

получены наночастицы со средним размером около 100 нм. Дисперсии наночастиц проявили высокую

антимикробную активность против патогенных организмов - бактерии C. michiganensis (штамм 101) и

грибов F. graminearum и A. solani.

Ключевые слова: хитозан, ионное гелеобразование, наночастицы, антимикробная активность

DOI: 10.31857/S0044460X20070173

Хитозан с его уникальными свойствами - не-

кулярных масс. Существенным ограничением ис-

токсичностью, биосовместимостью, способно-

пользования хитозана в растениеводстве является

стью к биодеградации, поликатионной структу-

его нерастворимость в воде при рН ≥ 6 [2, 5].

рой - широко используется в медицине, пищевой

Использование хитозана в сельском хозяйстве в

промышленности, сельском хозяйстве [1-9]. Ши-

форме наночастиц наиболее перспективно [13-17],

рокий спектр биологической активности хитозана

может повысить его эффективность независимо

обусловливает его применение в растениеводстве

от величины М и создать преимущества в борьбе

в качестве средств, стимулирующих рост и разви-

с различными болезнями [15]. Среди разнообраз-

тие растений, а также в препаратах, защищающих

ных методов получения наночастиц хитозана наи-

многие сельскохозяйственные культуры от грибко-

более известен метод ионного гелеобразования

вых, вирусных и бактериальных заболеваний [2, 5].

[18-21]. Он заключается в формировании ионного

Основной критерий применимости хитозана

комплекса в результате электростатического вза-

для этих целей - величина его молекулярной мас-

имодействия положительно заряженных амино-

сы, во многом определяющая его биологические

групп хитозана, протонированных в растворах при

свойства. Однако до сих пор не выявлено одно-

рН = 4.0-6.5, с трехвалентным анионом триполи-

значной корреляции между величиной М хитозана

фосфата. К преимуществам этого метода относят-

и его биологическими свойствами [10-13]. Изме-

ся возможность контролировать свойства наноча-

нение молекулярной массы полимера влечет за со-

стиц, отсутствие побочных химических реакций и

бой изменение механизма и локуса его биологиче-

нетоксичность триполифосфата.

ского действия, а конечный эффект определяется

свойствами изучаемой системы в целом. Поэтому

Нами изучены физико-химические свойства

поиск максимальной биологической активности

нано- и микрочастиц, полученных из образцов хи-

хитозана проводится в широком диапазоне моле-

тозана с различной молекулярной массой, и иссле-

1124

НАНОЧАСТИЦЫ ХИТОЗАН-ТРИПОЛИФОСФАТ

1125

Таблица 1. Условия окислительной деструкции хитозана (M 150∙10³ Да) и характеристика полученных образцов по

молекулярной массе (М) и по размерам (R) в ацетатном буфере при рН = 5

(NaNO₂),

№

Время

Выход

М образца,

г/на 5 г

R, нм

R, нм ^а

образца

реакции, мин

реакции, %

×10^-3

хитозана

0.043

150

6.5

6, 46

0.024

120

8, 50, 277

7, 153

Исходный образец

150

9, 41, 503

9, 416

^аПосле ультразвукового воздействия в течение 30 мин.

Таблица 2. Влияние концентрации хитозана в реакции с триполифосфатом, скорости (3200, 6200, 15000 об/мин) и

времени (1, 2 ч) центрифугирования дисперсий, полученных в буфере при рН = 5, на размеры частиц

Хитозан,

3200

6200

15000

№

с, мг/мл

R_исх, нм

М×10^-3

6.5

0.5

115

2, 3, 4

2, 2^а, 2^б

130, 118, 90

104

102

240

61, 210

38, 166

30, 128

16, 84

150

59, 323

135

28, 160

23, 93

^аПосле воздействия ультразвуком в течение 30 мин.

^бПосле хранения 5 сут при 4°С и воздействия ультразвуком в течение 30 мин.

дована их антимикробная и фунгицидная актив-

радиусом от 50 нм и более. Агрегаты представля-

ность в сравнении с исходным полимером.

ют собой достаточно рыхлые образования, разме-

ры которых могут изменяться при ультразвуковом

Для получения образцов хитозана с различной

молекулярной массой была выбрана окислитель-

воздействии, а также при хранении [23]. Слабое

ная деструкция хитозана [22], протекающая в до-

ультразвуковое воздействие разрушает агрегаты,

статочно мягких условиях при действии нитрита

преобразуя их в стабильную моду с усредненным

натрия. Варьируя количество NaNO₂ и время реак-

размером, однако в образце хитозана с М 6.5×

ции, мы получили 2 образца хитозана с М 6.5×10³

10³ Да при действии ультразвука распределение

и 60×10³ Да (табл. 1). Получение образцов из одно-

агегатов по размерам не изменяется. Исходный хи-

го исходного хитозана (М 150×10³ Да) позволило в

тозан и полученные при его деструкции образцы

дальнейшем провести сравнительное изучение их

были использованы для получения наночастиц.

свойств. Выбор исходного хитозана с высоким со-

На основании литературных данных [18, 19, 23]

держанием звеньев с аминогруппами (степень деа-

и предварительных экспериментов были опреде-

цетилирования 85%) обусловлен потенциальными

лены оптимальные условия получения наночастиц

биоцидными свойствами такого хитозана [5].

методом ионного гелеобразования, изучено влия-

В водных растворах макромолекулы полисаха-

ние способа выделения, хранения и воздействия

ридов, в том числе и хитозана, способны к агре-

ультразвука на размеры частиц в образующихся

гации [2, 18]. Такие растворы представляют собой

дисперсиях (табл. 2). Выбор условий синтеза и

смесь частиц различных размеров, что отражает-

обработки ультразвуком дисперсии наночастиц

ся в полимодальном распределении по размерам.

представлено на примере образца с М 6.5×10³ Да.

Исходный хитозан и полученные из него образ-

Синтез проводили в ацетатном буфере при различ-

цы были охарактеризованы по размерам методом

ных концентрациях хитозана и при постоянной

динамического рассеяния света. Образцы неод-

концентрации триполифосфата (0.84 мг/мл), со-

нородны (табл. 1), в распределении присутствует

отношение хитозан (аминогруппы)-триполифос-

мода собственно макромолекул хитозана с гидро-

фат не менее 5:1 (моль). После формирования на-

динамическим радиусом до 10 нм и моды агрега-

ночастц реакционную смесь подвергали диализу

тов макромолекул хитозана с гидродинамическим

против воды.

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 7 2020

1126

ПОПОВА и др.

Таблица 3. Параметры дисперсий, полученных из свежевыделенных наночастиц хитозана (М 60×10³ Да)

Концентрация

Среда для

Параметры

№

наночастиц в

триполифосфата

хитозана

R, нм

PDI

ζ-потенциал, мВ

дисперсии, мг/мл

Буфер, рН = 5

0.45

26.8±3

1.85

Буфер, рН = 4.5

211

0.25

19.8±2

0.89

Вода

Вода, рН = 5

185

0.32

11.2±1

0.91

4^а

Вода

Вода, рН = 5

300, 1200

0.91

5^б

Буфер, рН = 5

210

0.51

21.4±0.5

1.04

^аЧерез 5 дней хранения при 4°С.

^бМ 6.5×10³.

Из хитозана с М 6.5×10³ Да (с = 2 мг/мл) получе-

стиц, водную дисперсию можно хранить в холо-

ны наночастицы с размером 130 нм, а при увеличе-

дильнике (4°С) несколько дней [25]. После тща-

нии концентрации хитозана в 3 раза образовались

тельного промывания осадков деионизированной

более крупные частицы (табл. 2). К уменьшению

водой и повторного их суспендирования с добав-

размеров частиц приводит обработка полученной

кой Твин-80 образовавшиеся дисперсии подверга-

дисперсии ультразвуком. При хранения диспер-

ли воздействию ультразвука в течение 30 мин и за-

сии в холодильнике (4°С, 5 сут) выпадал осадок,

тем фильтровали для удаления визуально видимых

но при действии ультразвука происходило его дис-

агрегированных частиц.

пергирование и формирование дисперсии со сред-

Для изучения влияния изменения среды при

ним размером частиц ~90 нм.

синтезе на размеры свежевыделенных вышеука-

Для извлечения наночастиц полученные дис-

занным способом частиц, повторно суспендиро-

персии центрифугировали, варьируя скорость и

ванных в воде с добавлением Твин-80, образцы

продолжительность. Центрифугирование позво-

хитозана растворяли в ацетатном буфере (рН = 4.5,

ляет последовательно удалять из дисперсии ча-

5.0) или в воде (рН = 5) (табл. 3).

стицы крупной фракции, и средний размер частиц,

Снижение рН буфера до 4.5 при получении

оставшихся в супернатанте, снижается. На приме-

дисперсий приводит к увеличению размеров нано-

ре образца с М 60×10³ Да видно как изменяются во

частиц, а их концентрация уменьшается в 2 раза.

времени размеры частиц в супернатанте по ходу

При синтезе в водной среде при рН = 5 размеры

центрифугирования.

наночастиц также увеличиваются, как и при рН =

Полученные

при

центрифугировании

4.5 происходит снижение ζ-потенциала и выхода

(15000 об/мин, 2 ч) осадки с выходом до 10% ли-

наночастиц. Если в свежеприготовленной диспер-

офильно сушили и затем суспендировали в де-

сии (табл. 3, оп. № 3) присутствуют частицы од-

ионизированной воде. Воду добавляли с таким

ного размера, то после хранения в течение 5 сут

расчетом, чтобы концентрация комплекса хито-

(табл. 3, оп. № 4) в образце появляется осадок, при

зан-триполифосфат в дисперсии была ~1.5 мг/мл.

перемешивании которого в распределении по раз-

Однако только для образца с М 6.5×10³ Да удалось

мерам обнаружены агрегаты микронного размера.

получить стабильную дисперсию наночастиц,

Взаимодействие между хитозаном и трипо-

причем для этого потребовалось добавление 5%-

лифосфатом было подтверждено сравнением ИК

ного неионногенного стабилизатора Твин-80. Рас-

спектров исходного хитозана и полученных на-

пределение по размерам частиц для этого образца

ночастиц. Полоса в области 3500-3300 см^-1, об-

характеризовалось двумя модами: 43±4 и 147±13 нм.

условленная валентными колебаниями связей

Лиофилизация дисперсий - общепринятая тех-

функциональных групп N-H и O-H хитозана, ста-

нология, обеспечивающая долгосрочное хранение

новится шире, что свидетельствует об усилении

полимерных наночастиц [18, 24]. Если лиофили-

водородной связи при образовании наночастиц.

зация не позволяет достичь полного повторного

При образовании ионного комплекса хитозан-

диспергирования осадка, что обычно обусловлено

триполифосфата максимумы поглощения валент-

агрегацией или необратимым слиянием наноча-

ных и деформационных колебаний связей N-H

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 7 2020

НАНОЧАСТИЦЫ ХИТОЗАН-ТРИПОЛИФОСФАТ

1127

d ɧɦ

Рис. 1. Распределение частиц по диаметрам по данным атомно-силовой микроскопии (а) и распределение наночастиц в

дисперсии по гидродинамическим диаметрам (б) из данных динамического рассеяния света для образца хитозана с М

60×10³ Да (образец № 6, табл. 2).

смещаются в сторону низких частот. Полоса при

V = πh(3r²+h²)/6,

(1)

1599 см^-1, наблюдающаясяв спектре исходного хи-

V = 4πR³/3.

(2)

тозана, сдвигается к 1561 см^-1.Вместо полосы при

Можно трактовать данные атомно-силовой

1650 см^-1 в спектре наночастиц появляется полоса

микроскопии иначе: в предположении быстрой и

при 1630 см^-1, соответствующая деформационным

сильной адсорбции на слюду контакт частицы со

колебаниям связи N-H в ионе NH₃₊. Указанные из-

слюдой приводит к формированию на поверхно-

менения в ИК спектрах наночастиц обусловлены

сти пятна из материала частицы, форма и размер

взаимодействием аминогруппы и фосфат-аниона и

которого соответствуют проекции частицы на по-

образованием комплекса хитозан-триполифосфат

верхность (т. е. диаметр объекта атомно-силовой

[26, 27].

микроскопии может соответствовать диаметру

Некоторые образцы, представляющие собой

частицы в дисперсии). Частица при этом разру-

дисперсии наногелей сшитого хитозана, охаракте-

шается и ее объем более не соответствует объему

ризованы распределением частиц по размерам ме-

исходной частицы.

тодом динамического рассеяния света в дисперсии

Методами атомно-силовой микроскопии и ди-

и визуализированы с помощью атомно-силовой

намического рассеяния света получены результа-

микроскопии после адсорбции на слюду. Метод

ты, не противоречащие друг другу. Образец хито-

атомно-силовой микроскопии позволяет получить

зана с М 60×10³ Да (табл. 2, оп. № 6), очищенный

информацию о размерах частиц после их адсо-

диализом и подвергнутый обработке ультразвуком

рбции на слюду и высушивания. Эти процессы

в течение 30 мин, состоял из частиц разных разме-

приводят к деформации частиц, на поверхности

ров, образовавшихся при взаимодействии хитоза-

слюды они имеют форму сегмента шара. Можно

на и триполифосфата, а также из частиц хитозана

приближенно вычислить диаметр исходной части-

в виде агрегатов. На изображении атомно-силовой

цы в растворе, предполагая, что объем вещества

микроскопии визуализировано множество адсор-

частицы в дисперсии и на поверхности слюды

бированных частиц неопределенной формы с ши-

после адсорбции сохраняется. Для этого по фор-

роким распределением по размерам: присутству-

муле для вычисления объема сегмента шара (1) из

ют большие частицы (агрегаты), средний диаметр

данных атомно-силовой микроскопии получаем

которых 281±55 нм, а средняя высота 13±3 нм, при

радиус основания r и высоту h, а затем вычисляем

этом видны и более мелкие частицы (рис. 1).

радиус R сферической частицы в дисперсии по со-

Эти параметры адсорбированных частиц могут

отношению (2).

соответствовать диаметру ~90 нм частиц в дис-

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 7 2020

1128

ПОПОВА и др.

d ɧɦ

Рис. 2. Распределение частиц по диаметрам по данным атомно-силовой микроскопии (а) и распределение наночастиц в дис-

персии по гидродинамическим диаметрам (б) из данных динамического рассеяния света для образца хитозана № 1, табл. 3.

персии. Необходимо учесть, что метод атомно-

ванной воде с добавлением Твин-80, присутствуют

силовой микроскопии дает информацию о высу-

частицы округлой формы с узким распределением

шенных на воздухе частицах, а метод динамиче-

по размеру (рис. 2). Средний диаметр частиц со-

ского рассеяния света - о набухших частицах в

ставляет 130±17 нм, средняя высота - 6±2 нм. Ди-

воде. Поскольку гидродинамический радиус вы-

аметр частицы, рассчитанный через объем сегмен-

числяется по формуле Стокса из данных о коэф-

та шара, равен 42 нм. Из данных динамического

фициентах поступательной диффузии, наличие

рассеяния света диаметр частиц составляет 94 нм.

гидратной «шубы» приводит к увеличению ка-

Для данного образца оба метода демонстрируют

жущегося гидродинамического радиуса. Размеры

узкое мономодальное распределение по размеру

частиц (диаметр), полученные методом атомно-си-

частиц, а изображение атомно-силовой микро-

ловой микроскопии (диаметр в плоскости 281±

скопии подтверждает сферическою форму частиц

55 нм, расчет через объем сегмента шара 90 нм)

и отсутствие их слипания. Таким образом, метод

и динамического рассеяния света (420±28 нм,

ионного гелеобразования в подобранных условиях

120±10 нм), можно считать приблизительно соот-

дает возможность получать стабильные дисперсии

ветствующими друг другу с учетом особенностей

сферических частиц хитозана диаметром около

метода измерения и расчета.

100 нм.

На изображении атомно-силовой микроскопии

Оценку бактерицидной и фунгицидной актив-

образца (табл. 3, образец 1), который сразу после

ности полученных дисперсий наночастиц в отно-

получения был ресуспендирован в деионизиро-

шении фитопатогенных видов проводили в срав-

Таблица 4. Антагонистическая активность образцов (с = 140 мкг/мл по хитозану) в отношении тест-культур

фитопатогенных бактерий Clavibacter michiganensis (штамм 101) и гриба Fusarium graminearum

Диаметр зоны лизиса, мм

Образец

C. michiganensis

F. graminearum

3 сут

6 сут

Контроль (вода)

Ацетатный буфер

18.0±0.2

13.5±0.2

Хитозан в ацетатном буфере, рН = 5

22.5±0.2

18.0±0.1

Дисперсия наночастиц (табл. 2, оп. № 2)

29.5±0.1

20.0±0.1

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 7 2020

НАНОЧАСТИЦЫ ХИТОЗАН-ТРИПОЛИФОСФАТ

1129

Таблица 5. Фунгистатическая активность раствора хитозана в ацетатном буфере (рН = 5) и дисперсии наночастиц

по отношению к грибу Alternaria solani

Диаметр зоны угнетения

роста мицелия гриба

Ингибирование роста гриба

Образец

с, мкг/мл

A. solani в процессе

A. solani, %

культивирования, мм

3 сут

5 сут

3 сут

5 сут

Хитозан в ацетатном буфере

300

11.0±0.1

450

13.5±0.15

Дисперсия наночастиц (табл. 3, оп. № 1)

300

13.0±0.1

10.0

23.0

450

17.0±0.2

12.0±0.1

65.0

70.0

нении с раствором хитозана в ацетатном буфере

Таким образом, методам ионного гелеобразо-

методом бумажных фильтров (табл. 4) и метода-

вания из образцов хитозана различной молеку-

ми лунок и агаровых блоков (табл. 5). Сравнение

лярной массы получены стабильные дисперсии

диаметров лизиса тест-культур C. michiganensis и

наночастиц. С помощью атомно-силовой микро-

гриба F. graminearum показало, что дисперсия на-

скопии и методом динамического рассеяния света

ночастиц обладает большей антибактериальной и

визуализированы наночастицы с диаметром около

фунгицидной активностью, чем исходный хитозан

100 нм. Первичные испытания антагонистической

(табл. 4).

активности образцов в отношении тест-культур

Оценка прямого антагонистического действия

фитопатогенных бактерий и грибов (штаммов C.

раствора хитозана и дисперсии наночастиц на рост

michiganensis, F, graminearum и A. solani) показа-

мицелия гриба A. solani методами диффузии в агар

ли, что, независимо от молекулярной массы хито-

и агаровых блоков подтвердила более сильную ак-

зана, более высокую активность имеют дисперсии

тивность дисперсии наночастиц по сравнению с

с наночастицами хитозана по сравнению с раство-

раствором хитозана, а также выявила зависимость

ром того же полимера.

фунгистатической активности исследуемых сое-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

динений от их концентрации (табл. 5).

В работе использовали хитозан (Биопрогресс)

Если хитозан и дисперсия наночастиц в кон-

с М 150×10³ Да и степенью деацетилирования

центрации 300 мкг/мл обладают слабой фунгиста-

85%. Окислительной деструкцией при действии

тической активностью, то увеличение концентра-

нитрита натрия [22] получены образцы хитозана

ции наночастиц до 450 мкг/мл ведет к повышению

с молекулярной массой 6.5×10³ и 60×10³ Да, опре-

активности. В отличие от исходного хитозана,

деляемой вискозиметрическим методом [31]. Три-

дисперсия наночастиц в концентрации 450 мкг/мл

полифосфат и нитрит натрия (Вектон) использова-

ингибирует рост мицелия гриба A. solani в тече-

ли без дополнительной очистки.

ние 5 сут культивирования, причем уже на тре-

тьи сутки диаметр зоны угнетения роста гриба

Ионное гелеобразование проводили с исполь-

под действием дисперсии наночастиц составляет

зованием образцов хитозана с разными молекуляр-

17.0 мм, что существенно превышает зону лизи-

ными массами. Хитозан (30 мг) растворяли в 15 мл

са исходного хитозана (13.5 мм). Преимущество

0.2 М. ацетатного буфера (рН = 4.5 или 5) в тече-

в фунгистатической активности дисперсии на-

ние 3 ч при постоянном перемешивании. Для про-

ночастиц и ее зависимость от концентрации под-

ведения синтеза в водной среде хитозан в течение

тверждены методом агаровых блоков. Полученные

3 ч при постоянном перемешивании растворяли в

данные биологических испытаний согласуются с

приготовленном растворе, рН = 5 (2%-ная уксус-

исследованиями [28-30], в которых для несколь-

ная кислота с добавлением раствора KОН). Полу-

ких видов фитопатогенных бактерий и грибов

ченный раствор фильтровали через фильтр Шотта

продемонстрирована более высокая антибактери-

(размер пор - 40 мкм). К фильтрату добавляли при

альная и фунгистатическая активность дисперсий

постоянном перемешивании в течение 5 мин по

наночастиц по сравнению с хитозаном.

каплям раствор триполифосфата, приготовленный

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 7 2020

1130

ПОПОВА и др.

в деионизированной воде или в ацетатном буфере

стиц снимали на Фурье-спектрометре Spectrum

(с = 0.84 мг/мл). Дисперсию наночастиц пере-

BX в таблетках KBr.

мешивали 30 мин, затем облучали ультразвуком

Для изучения антигрибной и антибактериаль-

60 мин. В дальнейшем дисперсию наночастиц

ной активности исследуемых образцов в отноше-

подвергали в течение 4 ч диализу против деио-

нии фитопатогенных грибов и бактерий различные

низованной воды [19], при этом объем дисперсии

концентрации хитозана готовили растворением в

нормировался и составлял 21 мл.

0.2 М. ацетатном буфере, рН = 5.0. Оценку антибак-

Дисперсию наночастиц центрифугировали 1 ч

териальной активности образцов по отношению к

при скорости 6200 об/мин. Полученный осадок

тест-культуре C. michiganensis (штамм 101) (воз-

наночастиц подвергали либо лиофильной сушке,

будитель бактериального рака томата) и антигриб-

либо сразу суспендировали в деионизированной

ной активности по отношению к F. graminearum

воде с добавкой Твин-80 (15 мас%) и затем 30 мин

(возбудитель фузариоза колоса и корневой гнили

обрабатывали ультразвуком. Концентрацию нано-

зерновых культур) проводили методом бумажных

частиц в полученной дисперсии определяли весо-

дисков [32]. Оценивали диаметр (мм) зоны лизиса

вым методом. Для лиофильно высушенного осадка

тест-культур на агаризованной питательной среде.

процедура суспендирования в деионизированной

Тест-культуры фитопатогенных микроорганиз-

воде с добавкой Твин-80 (15 мас%) и обработки

мов выращивали 5 сут в пробирках на скошенной

ультразвуком в течение 30 мин оказалась успеш-

питательной среде C. michiganensis (штамм 101)

ной только при использовании образца хитозана с

и Чапека (F. graminearum и A.solani) в термоста-

М 6.5×10³ Да.

те при 22-25°С. Для тестирования суспензии

Исследование образцов хитозана с разными

фитопатогенных культур готовили, смывая сте-

молекулярными массами и дисперсий частиц, по-

рильной водой с поверхности скошенного агара.

лученных методом гелеобразования, проведены

Поверхность агаризованной среды Чапека в чаш-

в Ресурсном центре Санкт-Петербургского госу-

ках Петри сплошным газоном засевали суспен-

дарственного университета «Центр диагностики

зиями тест-культур патогенов. Титры жизнеспо-

функциональных материалов для медицины, фар-

собных клеток посевного материала составляли

макологии и наноэлектроники». На спектрометре

10⁵ КОЕ/мл для C. michiganensis (штамм

101)

Photocor Complex (298.00±0.05 K, длина волны

по стандарту мутности и 103 КОЕ/мл для F.

источника света λ_о = 445 нм) получены гидроди-

graminearum и A. solani (подсчет в камере Горяева).

намические радиусы наночастиц (погрешность

Затем на поверхность засеянной среды помеща-

метода динамического рассеяния света 10%). Дзе-

ли стерильные бумажные фильтры диаметром

та-потенциал и диаметры частиц получены на ана-

10 мм, на которые пипеткой наносили растворы

лизаторе размеров частиц Photocor Compact-Z и на

образцов разной концентрации, чашки с культура-

приборе Zetasizer Malvern Nano ZS ZEN 3500.

ми помещали в термостат при 22-25°С. Через 2-

Анализ методом атомно-силовой микроскопии

3 сут для бактерий и 4-5 сут для грибов измеряли

выполнен на микроскопе VEECO diNanoScope V в

диаметр зоны отсутствия роста тест-культур во-

полуконтактном режиме с использованием зондов

круг фильтра.

HA_NA (NT-MDT). Для приготовления образцов

использовали свежесколотую поверхность слюды.

Определение фунгистатической активности

На слюду размером 5×5 мм, наклеенную предвари-

образцов по отношению к тест-культуре фитопа-

тельно на металлическую пластину, горизонталь-

тогенного гриба A. solani (возбудитель листовых

но установленную на торцевом срезе вала элект-

пятнистостей широкого спектра сельскохозяй-

родвигателя, наносили 20 мкл исследуемой дис-

ственных культур) проводили методом диффузии в

персии, выдерживали 1 мин, после чего удаляли

агар (метод лунок) и методом агаровых блоков, ос-

раствор со слюды, включая вращение электродви-

нованных на способности угнетать рост мицелия

гателя 3000 об/мин на 1 мин. Образцы сушили на

возбудителя [33]. Поверхность питательной среды

воздухе не менее 1 сут. Полученные изображения

Чапека засевали тест-культурой гриба, как было

обрабатывали в программе NanoScope Analysis.

описано выше. При тестировании методом лунок

ИК спектры хитозана и дисперсий его наноча-

в агаре стерильным пробочным сверлом вырезали

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 7 2020

НАНОЧАСТИЦЫ ХИТОЗАН-ТРИПОЛИФОСФАТ

1131

лунки диаметром 7 мм, и в них пипеткой помещали

8. Tikhonov V.E., Stepnova E.A, Babak V.G., Yamskov I.A.,

растворы наночастиц образцов хитозана с разными

Palma-Guerrero J., Jansson H-B, Lopez-Llorca L.V.,

концентрациями. Через 4-5 сут выращивания куль-

Salinas J., Gerasimenko D.V., Avdienko I.D., Varla-

mov V.P. // Carbohydr. Polym. 2006. Vol. 64. P. 66. doi

туры в термостате при 22-25°С измеряли диаметр

10.1016/j.carbpol.2005.10.021

зоны отсутствия роста тест-культуры гриба вокруг

9. Fernandes J.C., Eaton P., Gomes A.M., Pintado M.E.,

лунки.

Malcata F.X. // Ultramicroscopy. 2009. Vol. 109. P. 854.

При тестировании методом блоков в теплую

doi 10.1016/j.ultramic.2009.03.015

агаризованную среду Чапека вносили растворы

10. Kumar A.B., Varadaraj M.C., Tharanathan R.N. //

наночастиц определенного объема, рассчитывая

Biomacromolecules. 2007. Vol. 2. P. 566. doi 10.1021/

конечную концентрацию в среде в зависимости от

bm060753z

исходной концентрации наночастиц. После засты-

11. Попова Э.В. Домнина Н.С., Коваленко Н.М., Бори-

вания среды на ее поверхности устанавливали ага-

сова Е.А., Колесников Л.Е., Тютерев С.Л. // Вестн.

ровые блоки 5-суточной тест-культуры A. solani,

защиты растений. 2017. Т. 93. С. 28.

вырезанные стерильным пробочным сверлом, и

12. Куликов С.Н., Оберемок Д.Р., Безродных Е.А., Ти-

помещали чашки Петри в термостат при 22-25°С.

хонов В.Е., Варламов В.П. // Уч. зап. Казанск. унив.

Фунгистатическую активность оценивали по диа-

2013. Т. 155. Вып. 3. С. 27

метру подавления роста тест-культуры через 3 и

13. Kashyapa P.L., Xiang X., Heiden P. // Int. J. Biol.

5 сут выращивания.

Macromol. 2014. Vol. 77. P. 36. doi 10.1016/j.

Работа выполнена при технической поддерж-

ijbiomac.2015.02.039

ке научного парка Санкт-Петербургского госу-

14. Jampilek J., Kralova K. // Ecol. Chem. Eng. S. 2015.

дарственного университета, Ресурсного образо-

Vol. 22. P.321. doi 10.1515/eces-2015-0018

вательного центра по направлению «Химия» и

15. Nair R., Varghese S.H., Nair B.G., Maekawa T., Yoshi-

Центра диагностики функциональных материалов

da Y., Kumar D.S. // Plant Sci. 2010. Vol. 179. P. 154.

для медицины, фармакологии и наноэлектроники.

doi 10.1016/j.plantsci.2010.04.012

16. Agnihotri S.A., Mallikarjuna N.N, Aminabhavi T.M. //

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

J. Control. Release. 2004. Vol. 100. P. 5. doi 10.1016/j.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

jconrel.2004.08.010

интересов.

17. Khot L.R., Sankaran S, Maja J. // Crop Protection (C).

2012. Vol. 35. P. 64. doi 10.1016/i.cropro.2012.01.007

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

18. Rampino A., Borgogna M.. Blasi P., Bellich B., Cesaro A. //

1. Saharan V., Pal A. Chitosan based nanomaterials in

Int. J. Pharm. 2013. Vol. 455. P. 219. doi 10.1016/j.

plant growth and protection. Springer: Briefs in Plant

ijpharm.2013.07.034

Science. 2016. 55 р.

19. Fabragas A., Minarro M., Garcia-Montoya E., Perez-

2. Хитин и хитозан: получение, свойства и приме-

Lozano P., Carrillo C., Sarrate R., Sanchez N., Tico J.R,,

нение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой,

Sune-Negre J.M. // Int. J. Pharm.. 2013. Vol. 446. P. 199.

В.П. Варламова. М.: Наука. 2002. 368 с.

doi 10.1016/j.ijpharm.2013.02.015

3. Younes I., Rinaudo M. // Marine Drugs 2015. Vol. 13.

20. Mazancová P., Némethová V., Treľová D,. Kleščíková L.,

P. 1133. doi 10.3390/md13031133

Lacík I., Rázg F. // Carbohydr. Polym. 2018. Vol. 192.

4. Hadrami E., Lorne R. // Marine Drugs. 2010. Vol. 10.

P.104. doi 10.1016/j.carbpol.2018.03.030

P. 968. doi 10.3390/md8040968

21. Sawtariea N., Cai Y., Lapitsky Y. // Colloids and Surfaces:

5. Тютерев С.Л. Природные и синтетические индукто-

Biointerfaces. 2017. Vol. 157. P. 110. doi 10.1016/j.

ры устойчивости растений к болезням. СПб: ВИЗР,

colsurfb.2017.05.055

2014. 212 с.

22. Власов П.С., Киселев А.А., Домнина Н.С., Попова Э.В.,

6. El H.A., Adam L.R., Dayf F. // Marine Drugs. 2010.

Тютерев С.Л. // ЖПХ. 2009. Вып. 9. C. 1571; Vla-

Vol. 8. P. 968. doi 10.3390/md8040968

sov P.S., Kiselev A.A., Domnina N.S., Popova E.V.,

7. Wang J., Wang L., Yu H., Zain-Ul-Abdin, Chen Y.,

Tyuterev S.L. // Russ. J. Appl. Chem. 2009. Vol. 82.

P. 1675 doi 10.1134/S1070427209090298

Chen Q., Zhou W., Zhang H., Chen X. // Int. J. Biol.

Macromol. 2016. Vol. 88. P. 333. doi 10.1016/j.

23. Vauthier C., Cabane B., Labarre D. // Pharm. Biopharm.

ijbiomac.2016.04.002

2008. Vol. 69. P. 466. doi 10.1016/j.ejpb.2008.01.025

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 7 2020

1132

ПОПОВА и др.

24. Agarwal M., Agarwal M.K., Shrivastav N., Pandey S.,

29. Abdeltwab W.M., AbdelaliemY.F., MetryW.A., Eldeghe-

Das R., Gaur P. // Int. J. Life Sci. Sci. Res. 2018. Vol. 4.

dy M. // J. Adv. Lab. Res. Biol. 2019. Vol. 10. P. 8.

P. 1713. doi 10.21276/ijlssr.2018.4.2.17

30. Oh J.-W., Chun S.C., Chandrasekaran M. // Agronomy.

25. Hussain Z., Sahudin S. // Int. J. Pharm. Pharm. Sci.

2019. Vol. 9. P. 1. doi 10.3390/agronomy9010021

2016. Vol. 8. P. 297.

31. Погореленко А.Б., Домнина Н.С., Попова Э.В., Тюте-

26. Antoniou J., Liu F., Majeed H., Qi J., Yokoyama W.,

рев С.Л. // Вестн. СПбГУ. Сер. 4. 2003. Т. 20. С. 97.

Zhong F. // Colloids and Surfaces (A). 2015. Vol. 465.

32. Билай В.И. Методы экспериментальной микологии.

P. 137. doi: 10.1016/j.colsurfa.2014.10.040

Киев: Наукова думка, 1982. 275 c.

27. Hejjajia E.M.A., Smith A.M., Morris G.A. // Int. J.

Biol. Macromol. 2017. Vol. 95. P. 564. doi 10.1016/j.

33. Методические рекомендации по испытанию хими-

ijbiomac.2016.11.092

ческих веществ на фунгицидную активность /

28. Ing L.Y., Zin N.M., A., Katas H. // Int. J. Biomaterials.

Под ред. Е.И. Андреевой, В.С. Картомышева.

2012. Article ID 632698. doi 10.1155/2012/632698

НИИТЭХИМ. 1990. 52 с.

Chitosan-Tripolyphosphate Nanoparticles: Synthesis

by Ion Gelation Method, Properties, and Biological Activity

E. V. Popovaa,*, I. M. Zorin^b, N. S. Domnina^b, I. I. Novikova^a, and I. L. Krasnobaeva^a

^aAll-Russian Research Institute for Plant Protection, Pushkin, 196608 Russia

^b St. Petersburg State University, St. Petersburg, 199034 Russia

*e-mail: elzavpopova@mail.ru

Received February 3, 2020; revised February 3, 2020; accepted February 6, 2020

Nanoparticles with an average size of about 100 nm were obtained by ion gelation of chitosan (M 6.5×10³ and

60×10³ Da) in the presence of tripolyphosphate. Dispersion of nanoparticles showed high antimicrobial activity

against pathogenic organisms such as C. michiganensis bacteria (strain 101), F. graminearum and A. solani fungi.

Keywords: chitosan, ion gelation, nanoparticles, antimicrobial activity

ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ ХИМИИ том 90 № 7 2020