ЖУРНАЛ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2019, Том 55, № 1, с. 30-39

K 85-летнему юбилею академика РАН А.И. Коновалова

УДК 547.913.6

СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

1,1-АЛКИЛЕНДИФОСФОНАТОВ ДИТЕРПЕНОИДА

ИЗОСТЕВИОЛА

А. С. Сапунова, В. Е. Катаев*

ФГБУН Институт органической и физической химии им. А.Е.Арбузова, ФИЦ Казанский научный центр РАН,

420029, Россия, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Академика Арбузова 8

*e-mail: kataev@iopc.ru

Поступила в редакцию 3 декабря 2018 г.

После доработки 4 декабря 2018 г.

Принята к публикации 5 декабря 2018 г.

Реакцией алкиленбромидов дитерпеноида изостевиола с тетраэтилметиленбисфосфонатом синтезированы

соответствующие дифосфоновые кислоты, конъюгированные к дитерпеноидному каркасу полиметилено-

вым спейсером. Одно из синтезированных соединений проявило высокую (МИК 3.9 мкг/мл) антимикроб-

ную активность в отношении S.aureus и высокую (IC₅₀ 15-18 мкМ) цитотоксичность в отношении раковых

линий клеток человека M-Hela и MCF-7.

Ключевые слова: Изостевиол, фосфонаты, фосфоновые кислоты, антимикробная активность, цито-

токсичность.

DOI: 10.1134/S051474921901004X

Синтез новых алкилендифосфоновых кислот -

производных природного дитерпеноида изосте-

аналогов неорганических пирофосфатов является

виола (16-оксо-энт-бейеран-19-овая кислота) 1,

актуальным ввиду их потенциальной биологиче-

описано только два типа его производных с фос-

ской активности. Дифосфонаты используются для

форсодержащими заместителями, а именно, три-

лечения костных заболеваний, таких как остеопо-

фенилфосфониевые соли 2 [13], проявляющие

роз и болезнь Педжета [1-3]. В литературе описано

антимитотическое и кардиопротекторное дей-

их антибактериальное [4], противовоспалительное

ствие, и конъюгаты изостевиола с димефосфо-

[5, 6] и противоопухолевое действие [7, 8]. Фосфо-

ном 3, показавшие высокую антитуберкулезную

наты и дифосфонаты зачастую целенаправленно

активность, характеризуемую значениями МИК

синтезируются в качестве потенциальных ингиби-

5-10 мкг/мл [14]. В обзоре [12] не упомянуты

торов фарнезилпротеинтрансферазы и NS5B поли-

гидрофосфорильные производные изостевиола 4

меразы [9, 10]. Свойство метилендифосфонатной

[15, 16], кетофосфонаты изостевиола 5 [17], а так-

группы эффективно связываться с ионами Ca²⁺ и

же фосфаты изостевиола 6 [18], продемонстриро-

Mg²⁺используется для направленного синтеза фи-

вавшие умеренную цитотоксическую активность

зиологически активных соединений [11].

в отношении раковых линий клеток человека

В недавно опубликованном обзоре [12], по-

М-Hela, MCF-7, характеризуемую величинами

священном синтезу и биологической активности

IC₅₀ 40-72 мкМ.

СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

С целью проследить влияние на биологиче-

m/z 647.4 (C₃₂H₅₇O₉P₂, 647.4), 689.5 (C₃₅H₆₃O₉P₂,

скую активность производных изостевиола при-

689.4) и 717.5 (C₃₇H₆₇O₉P₂, 716.4), соответствен-

роды фосфорсодержащего заместителя, в настоя-

но. В спектрах ЯМР ³¹P соединениям 8а-8с со-

щей работе сообщается о синтезе и биологической

ответствовали синглеты в области δ_Р 24 м.д. Об-

активности 1,1-алкилендифосфонатов, в которых

разование дифосфонатов 8а-8с наглядно просле-

дифосфонатная группировка конъюгирована к ди-

живалось также в спектрах ЯМР ¹Н по наличию

терпеноидному каркасу полиметиленовым спейсе-

характерного сигнала в виде триплета триплетов

ром такой же протяженности, как и у ранее изучен-

в области δ 2.2 м.д., соответствующего протону

ных [18] фосфатов изостевиола.

группы PCHP, а также сигналов протонов эток-

Синтез 1,1-алкилендифосфонатов изостевиола

сильной группы: триплета в области δ 1.3 м.д. и

7-9 представлен на схеме 1. Сначала по извест-

мультиплета в области δ 4.1-4.2 м.д..

ной методике [13] кипячением изостевиола 1 в

В литературе описаны различные способы омы-

CH₃CN с двухкратным избытком дибромалканов

ления алкиловых эфиров дифосфоновых кислот:

в присутствии K₂CO₃ были получены алкиленбро-

либо нагреванием в среде сильных кислот [11], либо

миды изостевиола 7а-7с. Далее алкилированием

через триметилсилиловые эфиры с последующим

тетраэтилметилендифосфоната бромидами 7а-7с

алкоголизом [20]. В данной работе был выбран

в щелочной среде были синтезированы тетраэтил-

второй метод, характеризующийся более мягкими

дифосфонаты 8а-8с. Реакцию проводили по моди-

условиями, поскольку соединения 8a-8c в сильно

фицированной методике [19], добавляя к к раство-

кислых средах способны претерпевать гидролиз по

ру тетраметилендифосфоната в сухом ДМФА при

карбоксиалкильному фрагменту с образованием

0°С сначала NaH, а затем алкиленбромиды изосте-

исходного изостевиола 1. Оказалось, что легкость

виола 7а-7с.

расщепления эфиров 8а-8с существенно зависит

Тетраэтилдифосфонатные производные изо-

от длины алкиленового спейсера и концентрации

стевиола 8а-8с выделяли колоночной хроматогра-

соединений в растворе. Так, перемешивание 0.2 М

фией в виде прозрачных смол с выходами 23-29%.

растворов (1 ммоль в 5 мл) дифосфонатов 8a-8с в

В масс-спектрах МАЛДИ соединений 8а-8с на-

CH₂Cl₂ в течение 7 ч при комнатной температуре с

десятикратным избытком (CH₃)₃SiBr согласно [19]

ЖУРНАЛ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ том 55 № 1 2019

СТРОБЫКИНА и др.

Схема 1.

c последующим алкоголизом реакционных смесей

исходные тетраэтиловые эфиры 8a и 8b, а также

метанолом [20], позволило получить дифосфо-

моноэтиловые эфиры - продукты неполного рас-

новую кислоту только в случае эфира 8с (выход

щепления тетраэтилдифосфонатов. Согласно ли-

50%) с наиболее длинным алкиленовым спейсе-

тературным данным, в ряде случаев, расщепление

ром (n = 8). По данным масс-спектрометрии МАЛ-

алкиловых эфиров галогенсиланами проводят без

ДИ и ТСХ реакционные смеси на основе эфиров

растворителя [10, 21], но поскольку дифосфонаты

8b и 8c в указанных условиях содержали только

8b, 8c представляли собой густую смолу, раство-

исходные соединения. При увеличении общего

ритель был необходим для лучшего массообмена.

времени реакции до 15 ч и двукратного добавле-

Использование насыщенных растворов соедине-

ния избытка (10 экв) (CH₃)₃SiBr, после алкоголиза

ний 8b, 8c в CH₂Cl₂(1 ммоль в 1.5-2 мл) и дву-

и разработки реакционных смесей, кроме дифос-

кратное добавление избытка триметилбромсилана

фоновых кислот 9a и 9b, были идентифицированы

позволило после метанолиза получить искомые

ЖУРНАЛ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ том 55 № 1 2019

СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Таблица 1. Антимикробная активность соединений 8a-8c, 9a-9c^a

МИК, мкг/мл

Соединение

125 ± 11

125 ± 10

>500

31.3 ± 2.6

250 ± 22

>500

3.9 ± 0.3

62.5 ± 5.3

>500

250 ± 20

>500

Хлорамфеникол

62.5 ± 5.7

62.5 ± 5.6

125 ± 12

МБК, мкг/мл

МФК, мкг/мл

125 ± 10

125 ± 11

>500

250 ± 21

>500

15.6 ± 1.4

125 ± 12

>500

^a МИК - минимальная ингибирующая концентрация, МБК - минимальная бактерицидная концентрация, МФК - минимальная

фунгицидная концентрация. Sa - Staphylococcus aureus, Bс - Bacillus сereus, Ef - Enterococcus faecalis, Ec - Escherichia coli, Pa -

Pseudomonas aeruginosa, An - Aspergillus niger, Tm - Trichophyton mentagrophytes, Ca - Candida аlbicans.

дифосфоновые кислоты 9b и 9c с выходом 87% и

Соединения 8a-8c, 9a-9c были также исследо-

94%. В масс-спектрах МАЛДИ соединений 9a-9c

ваны на цитостатическую активность в отноше-

наблюдались пики молекулярных ионов [M - H]^-

нии опухолевых линий клеток человека М-Hela

m/z 533.6 (C24H39O9P2, 533.2) (соединение 9a),

(эпителиоидная карцинома шейки матки), MCF-7

m/z 575.6 (C₂₇H₄₅O₉P₂, 575.3) (соединение 9b), m/z

(аденокарцинома молочной железы), а также в от-

603.2 (C₂₉H₄₉O₉P₂, 603.3) (соединение 9c). В спек-

ношении эмбриональных клеток легкого человека

трах ЯМР ¹Н соединений 9а-9с наблюдались уши-

(WI-38) в качестве модели нормальных клеток. Из

ренные сигналы в области δ 8 м.д., соответствую-

приведенных в тaбл. 2 данных видно, что соеди-

щие протонам свободных фосфонатных групп.

нения 8a-8c обладают умеренными цитостатиче-

Соединения 8a-8c и 9a-9c были протестиро-

скими свойствами против всех использованных

ваны на антимикробную активность в отношении

в эксперименте опухолевых линий, характеризу-

грамположительных и грамотрицательных бакте-

емыми величинами IC₅₀ 14-37 мкМ. Причем те-

рий и грибов. Из приведенных в табл. 1 данных,

траэтилметилендифосфонаты 8a-8c оказались в

видно, что тетраэтилметилендифосфонаты 8a-8с

два и более раза активнее дифосфоновых кислот

проявляют антимикробную активность в отноше-

9a-9c. Длина полиметиленового спейсера играет

нии тест-штаммов грамположительных бактерий

не столь существенную роль. Так, наиболее актив-

Staphylococus aureus 209p и Bacillus cereus

8035.

ным из тестированных соединений в отношении

По бактериостатической активности соединение

опухолевых линий клеток является тетраэтилме-

8с превосходит препарат сравнения хлорамфени-

тилендифосфонат 8c, в котором дифосфонатная

кол в отношении S. aureus 209p в 16 раз, соеди-

группа конъюгирована с изостевиольным карка-

нение 8b в 2 раза. В экспериментах с грамотрица-

сом октаметиленовым спейсером. Заслуживает

тельными бактериями и грибами все соединения

внимания тот факт, что аналогичная по строению

в исследуемых концентрациях не проявляют анти-

эфиру 8с дифосфоновая кислота 9c не проявляет

микробных свойств.

цитостатическую активность в отношении M-Hela

ЖУРНАЛ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ том 55 № 1 2019

СТРОБЫКИНА и др.

Таблица 2. Цитотоксичность соединений 8a-8c, 9a-9cв отношении раковых (M-Hela, MCF-7) и нормальных (WI-38)

клеточных линий человека

IC₅₀, мкM

Соединение

M-Hela

MCF-7

WI-38

25 ± 1.9

36 ± 3.1

58 ± 4.3

14.2 ± 1.1

37 ± 3.1

37 ± 3.2

18.0 ± 1.5

15.2 ± 1.2

56.1 ± 4.4

55 ± 4.2

69.0 ± 5.2

82 ± 6.5

33 ± 2.8

>100

76.4 ± 5.5

>100

Доксорубицин

3.0 ± 0.2

3.0 ± 0.1

1.30 ± 0.09

Таблица 3. Гемолитическая активность соединений 8a-8c, 9a-9c

Гемолиз, %

Соединение

100 мкM

50 мкM

10 мкM

0.4 ± 0.03

63.4 ± 5.70

7.7 ± 6.20

0.2 ± 0.02

54.3 ± 4.8

22.7 ± 1.60

0.3 ± 0.02

0.7 ± 0.05

0.4 ± 0.03

0.1 ± 0.01

2.6 ± 0.10

1.2 ± 0.09

0.3 ± 0.02

4.7 ± 0.30

2.4 ± 0.20

0.9 ± 0.07

и MCF-7. Общим для всех изученных соединений

концентрациях, соответствующих значениям IC₅₀.

является несколько меньшая токсичность в отно-

Полученные результаты свидетельствуют о том,

шении нормальных клеток WI-38 по сравнению с

что цитотоксичность соединений 8a, 8c, 9a, 9b в

опухолевыми линиями клеток. В диапазоне МИК,

клетках культуры M-Hela и MCF-7 реализуется

МБК и МФК все исследованные соединения ха-

главным образом по апоптотическому пути.

рактеризуются низким гемолитическим индексом

(табл. 3).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

С использованием многофункциональной си-

стемы Cytell Cell Imaging были выполнены экспе-

Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С регистрировали на спек-

рименты по изучению способности соединений

трометрах Avance-400, Avance-600 (Bruker, Герма-

8a-8c, 9a, 9b вызывать апоптоз в клетках опухо-

ния). Масс-спектры МАЛДИ получены на время-

левых линий человека MCF-7 и M-Hela (табл. 4) в

пролетном масс-спектрометре UltraFlex III TOF/

TOF (Bruker Daltonik GmbH, Бремен, Германия)

Таблица 4. Апоптотический эффект соединений 8a-8c,

в линейном режиме. Лазер Nd: YAG, λ = 355 нм.

9a, 9b в отношении M-Hela и MCF-7

Данные обрабатывали с помощью программы

Апоптоз, %

FlexAnalysis 3.0 (Bruker Daltonik GmbH, Бремен,

Соединение

M-Hela

MCF-7

Германия). Измерения проводились в диапазоне

25.0 ± 1.9

m/z 200-6000. Фиксировались отрицательно или

2.4 ± 0.2

положительно заряженные ионы. В качестве ма-

21.9 ± 1.9

32.4 ± 2.5

трицы использовались 2,5-дигидроксибензойная

27.6 ± 2.1

25.1 ± 1.8

кислота (DHB) и п-нитроанилин (p-NA). Образцы

57.5 ± 4.3

25.9 ± 2.1

растворяли в хлористом метилене в концентра-

ЖУРНАЛ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ том 55 № 1 2019

СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

ции 10^-3 мг/мл. Раствор матрицы в ацетонитриле

щенного раствора NH₄Cl, перемешивали 5 мин,

готовили в концентрации 10 мг/мл. Нанесение

приливали 9 мл насыщенного раствора NaCl, экс-

образцов проводили методом “высушенных ка-

трагировали этилацетатом. Этилацетатные вы-

пель”. С помощью дозатора 0.5 мкл раствора ма-

тяжки промывали 1 раз насыщенным раствором

трицы наносили на мишень Anchor Chip (Bruker

NaHCO₃, 2 раза водой, cушили Na₂SO₄. Продукты

Daltonik GmbH, Бремен, Германия). После испа-

выделяли в виде прозрачных смол методом обрат-

рения растворителя на мишень наносили 0.5 мкл

ной хроматографии на силикагеле КСК (фракция

раствора аналита. Масс-спектры ионизации элек-

менее 0.063 мм) (элюэнт этилацетат - метанол от

трораспылением (ESI) получены на масс-спектро-

100 : 1 до 7 : 1).

метре AmazonX (Bruker Daltonik GmbH, Бремен,

Тетраэтил 4-(16,19-диоксо-энт-бейеран-19-

Германия). Измерения проводились в режиме ре-

илокси)бутан-1,1-дифосфонат

(8а).

Выход

гистрации отрицательных или положительных ио-

23%, [α]D20 -29.5°

(1.36, CH₂Cl₂). Спектр ЯМР

нов в диапазоне m/z от 100 до 2800. Напряжение

¹H, δ, м.д.: 0.70 с (3H, СH₃-20), 0.96 с (3Н, СH₃-

на капилляре -4500 В. В качестве газа-осушителя

17), 1.19 с (3Н, СH₃-18), 1.33 т (12Н, 4 OСН₂СН₃,

использовался азот с температурой 250°С и расхо-

J 7.1 Гц), 0.84-2.01 м (18Н, бейерановый скелет),

дом 8 л мин^-1. В качестве элюента использовали

2.17 д (1Н, Н-3_экв, J 13.0 Гц), 2.31 т.т (1Н, СH-4'',

раствор состава метанол/вода (70 : 30), скорость

J 24.0, 5.9 Гц), 2.61 д.д (1Н, Н-15a, J 18.6, 4.7 Гц),

элюента 0.2 мл/мин. Соединение разбавляли ме-

3.95-4.02 м (1Н, СН₂-1''), 4.05-4.12 м (1Н, СН₂-1''),

танолом до концентрации 10^-6 г/л. Объем вкалы-

4.13-4.23 м (8Н, 4 OСН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³C,

ваемой пробы 20 мкл. Данные обрабатывались

δ, м.д.: 13.29 с (СН₃-20), 16.30 д.д (4 OСН₂СН₃,

с помощью программы DataAnalysis 4.0 (Bruker

J 6,42, 2.38 Гц), 18.90 с (СН₂-2), 19.73 с (СН₃-17),

Daltonik GmbH, Бремен, Германия). Полноту про-

20.22 с (СН₂-11), 21.63 с (СН₂-6), 22.59 с (СН₂-2''),

текания реакций и чистоту веществ контролирова-

27.87 с (СН₂-3''), 28.88 с (СН₃-18), 36.48 т (СН-

ли методом тонкослойной хроматографии на пла-

4'', J 133.9 Гц), 37.20 с (СН₂-12), 37.81 с (СН₂-3),

стинах Sorbfil (ООО “Имид” Краснодар, Россия),

37.91 с (C-10), 39.34 с (C-13), 39.73 с (СН2-1),

вещества обнаруживали обработкой пластин 5%

41.43 с (СН₂-7), 43.73 с (C-4), 48.33 с (C-8), 48.57 с

раствором серной кислоты с последующим нагре-

(СН₂-15), 54.20 с (СН₂-14), 54.63 с (СН-9), 56.99 с

ванием до 120°C. Удельное вращение измеряли на

(CH-5), 62.45 д.д (4 OСН₂СН₃), J 16.32, 6,79 Гц),

поляриметре Model 341 (PerkinElmer, Inc, США) в

63.61 с (СН₂-1''), 177.07 с (С-19), 222.12 с (С-

термостатируемой ячейке при 20°C и l = 589 нм.

16). Спектр ЯМР ³¹Р, δ, м.д.: 23.92. Масс-спектр

Изостевиол 1 получали по методике [22] из

MALDI, m/z: 647.4 [M + H]⁺, 669.4 [M + Na]⁺. Най-

подсластителя Sweta (Stevian Biotechnology Corp.).

дено, %: С 59.62; Н 8.69; P 9.69. C₃₂H₅₆O₉P₂. Вы-

Т. пл. 235°С (лит. 231-233°С [23]), спектральные

числено, %: С 59.43; Н 8.73; P 9.58.

параметры 1 соответствуют литературным [24].

Тетраэтил

7-(16,19-диоксо-энт-бейеран-19-

Синтез бромидов 7a-7c проводили по методике,

илокси)гептан-1,1-дифосфонат (8b). Выход 26%,

приведенной в [13]. Спектральные параметры со-

[α]D20 -23.6° (1.0 , CH₂Cl₂). Спектр ЯМР ¹H, δ, м.д.:

ответствуют литературным [13].

0.67 c (3H, СH₃-20), 0.96 c (3Н, СH₃-17), 1.17 c

Общая методика синтеза тетраэтилдифосфо-

(3Н, СH₃-18), 1.32 т (12Н, 4 OСН₂СН₃, J 7.1 Гц),

натов 8a-8c. К раствору 1 ммоль тетраэтилмети-

0.85-1.96 м (18Н, бейерановый скелет), 2.16 д

лендифосфоната в 3 мл абсолютного ДМФА в ат-

(1Н, Н-3экв., J 13.8 Гц), 2.24 т.т (1Н, СH-7'', J 24.2,

мосфере Ar при 0°С присыпали при перемешива-

6.0 Гц), 2.61 д.д (1Н, Н-15a, J 18.5, 3.6 Гц), 3.93-

нии 1.3 ммоль NaH (60% суспензия в минеральном

4.05 м (2Н, CН₂-1''), 4.11-4.19 м (8Н, 4 OСН₂СН₃).

масле). После прекращения выделения водорода

Спектр ЯМР ¹³C, δ, м.д.: 13.25 с (СН₃-20), 16.24 с

прикапывали раствор 1.3 ммоля бромида 7a-7c в

(4 OСН₂СН₃), 18.83 с (СН₂-2), 19.69 с (СН₃-17),

10 мл ДМФА, прекращали внешнее охлаждение,

20.18 с (СН₂-11), 21.56 с (СН₂-6), 25.36, 25.65,

перемешивали при комнатной температуре 12 ч.

28.27, 28.82 с (5 СН2-2''-6''), 28.82 с (СН3-18),

Затем к реакционной смеси приливали 2 мл насы-

36.65 т (СН-7'', J 133.5 Гц), 37.17 с (СН₂-12), 37.80

ЖУРНАЛ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ том 55 № 1 2019

СТРОБЫКИНА и др.

с (СН₂-3), 37.87 с (C-10), 39.31 с (C-13), 39.71 с

ловому эфиру) при 0°С в атмосфере Ar приливали

(СН₂-1), 41.38 с (СН₂-7), 43.67 с (C-4), 48.27 с (C-

1 мл абс. метанола. Перемешивали 1 ч при 0°С, за-

8), 48.52 с (СН₂-15), 54.16 с (СН₂-14), 54.57 с (СН-

тем 4 ч при комнатной температуре. Метанол упа-

9), 56.95 с (CH-5), 62.28 д.д (4 OСН₂СН₃, J 11.8,

ривали досуха, остаток сушили в вакуумном экси-

6.2 Гц), 64.02 с (СН₂-1''), 177.11 с (С-19), 222.08 с

каторе над молекулярными ситами. Для получения

(С-16). Спектр ЯМР ³¹Р, δ, м.д.: 23.95. Масс-спектр

чистого дифосфоната 9c, реакционную смесь по-

MALDI, m/z: 689.5 [M + H]⁺, 711.6 [M + Na]⁺. Най-

сле удаления метанола растворяли в EtOAc, триж-

дено, %: С 60.82; Н 9.10; P 9.09. C₃₅H₆₂O₉P₂. Вы-

ды промывали водой, сушили над Na₂SO₄. Эти-

числено, %: С 61.03; Н 9.07; P 8.99.

лацетат упаривали, продукт сушили в вакуумном

Тетраэтил

9-(16,19-диоксо-энт-бейеран-19-

эксикаторе над молекулярными ситами. Получали

илокси)нонан-1,1-дифосфонат

(8с).

Выход

дифосфонаты 9a-9c в виде бесцветной пены.

29%, [α]D20 -40.3° (1.6, CH₂Cl₂). Спектр ЯМР ¹H,

4-(16,19-Диоксо-энт-бейеран-19-илокси)бу-

δ, м.д.: 0.69 c (3H, СH₃-20), 0.96 с (3Н, СH₃-17),

тан-1,1-дифосфоновая кислота (9а). Выход 87%,

1.17 с (3Н, СH3-18), 1.32 т (12Н, 4 OСН2СН3,

[α]D20 -59.8° (1.7, CH₂Cl₂). Спектр ЯМР ¹H, δ, м.д.:

J 7.1 Гц),

0.80-1.98 м

(18Н, бейерановый ске-

0.71 с (3H, СH₃-20), 0.96 с (3Н, СH₃-17), 1.19 с (3Н,

лет), 2.16 д (1Н, Н-3_экв, J 13.5 Гц), 2.24 т.т (1Н,

СH₃-18), 0.80-2.10 м (18Н, бейерановый скелет),

СН-9'', J 24.2, 6.0 Гц), 2.61 д.д (1Н, Н-15a, J 18.5,

2.17 д (1Н, Н-3_экв, J 12.9 Гц), 2.51 уш.т (1Н, СН-4'',

3.2 Гц), 3.92-4.06 м (2Н, СН₂-1''), 4.10-4.20 м (8Н,

J 24.2 Гц), 2.71 д (1Н, Н-15a, J 18.8 Гц), 3.98-4.16

4 OСН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³C, δ, м.д.: 13 34 с (СН₃-

м (2Н, СН₂-1''), 8.30 уш.с (4Н, POH). Спектр ЯМР

20), 16.34 д.д (4 OСН₂СН₃, J 3.07, 2.95 Гц), 18.93 с

¹³C, δ, м.д.: 13.42 с (СН₃-20), 18.93 с (СН₂-2), 19.77 с

(СН₂-2), 19.79 с (СН₃-17), 20.28 с (СН₂-11), 21.67 с

(СН₃-17), 20.31 с (СН₂-11), 21.80 с (СН₂-6), 22.44 с

(СН₂-6), 25.45, 25.49, 25.53, 26.06, 28.43, 29.10,

(СН₂-2''), 27.73 с (СН₂-3''), 28.91 с (СН₃-18),37.42 с

29.24 с (7 СН₂-2''-8''), 28.92 с (СН3-18), 36.76 т

(СН₂-12), 38.02 с (СН₂-3, 10), 39.70 с (C-13), 39.90 с

(СН-9'', J 133.5 Гц), 37.28 с (СН₂-12), 37.91 с (СН₂-

(СН₂-1), 41.27 с (СН₂-7), 43.92 с (C-4), 48.25 с (C-

3), 37.98 с (C-10), 39.42 с (C-13), 39.82 с (СН₂-1),

8), 49.00 (СН₂-15), 54.10 с (СН₂-14), 54.62 с (СН-9),

41.50 с (СН₂-7), 43.77 с (C-4), 48.39 с (C-8), 48.63 с

57.07 с (CH-5), 64.22 с (СН₂-1''), 178.00 с (С-19),

(СН₂-15), 54.26 с (СН₂-14), 54.67 с (СН-9), 57.06 с

226.09 с (С-16). Спектр ЯМР ³¹Р, δ, м.д.: 23.45.

(CH-5), 62.37 д.д (4 OСН₂СН₃, J 10.2, 6.8 Гц ),

Масс-спектр MALDI, m/z: 533.6 [M - H]^-. Найдено,

64.23 с (СН₂-1''), 177.28 с (С-19), 222.32 с (С-

%: С 53.48; Н 7.60; P 11.41. C₂₄H₄₀O₉P₂. Вычисле-

16). Спектр ЯМР ³¹Р, δ, м.д.: 24.05. Масс-спектр

но, %: С 53.93; Н 7.51; P 11.59.

MALDI, m/z: 717.5 [M + H]⁺, 739.6 [M + Na]⁺. Най-

7-(16,19-Диоксо-энт-бейеран-19-илокси)геп-

дено, %: С 62.12; Н 9.25; P 8.55. C₃₇H₆₆O₉P₂. Вы-

тан-1,1-дифосфоновая кислота (9b). Выход 94%,

числено, %: С 61.99; Н 9.28; P 8.64.

[α]D20 -30.3° (1.29, CH₂Cl₂). Спектр ЯМР ¹H, δ, м.д.:

0.71 с (3H, СH₃-20), 0.98 с (3Н, СH₃-17), 1.19 с (3Н,

Общая методика синтеза дифосфоновых

кислот (9a-9c). К охлажденному до 0°С раство-

СH₃-18), 0.80-2.05 м (18Н, бейерановый скелет),

ру 0.1 ммоль дифосфоната 8a-8c в 1.5-2 мл абс.

2.17 д (1Н, Н-3_экв, J 12.6 Гц), 2.46 уш.т (1Н, СН-

7'', J 24.4 Гц), 2.68 д (1Н, Н-15a, J 18.7 Гц), 3.95-

CH₂Cl₂ в атмосфере Ar добавляли шприцом через

септу 1 ммоль триметилбромсилана. Прекращали

4.11 м (2Н, СН₂-1''), 8.12 уш.с (4Н, POH ). Спектр

ЯМР ¹³C, δ, м.д.: 13.40 с (СН₃-20), 18.96 с (СН₂-2),

охлаждение и перемешивали при комнатной тем-

пературе 7 ч. Оставляли на ночь без перемешива-

19.77 с (СН₃-17), 20.31 с (СН₂-11), 21.73 с (СН₂-

ния. Затем добавляли еще 1 ммоль триметилбром-

6), 25.25, 25.88(2С), 28.32, 28.94 с (5 СН₂-2'' - 6''),

28.94 с (СН₃-18), 37.41 с (СН₂-12), 37.95 с (СН₂-

силана и перемешивали при комнатной темпера-

туре 8 ч. Отгоняли хлористый метилен досуха и

3), 38.02 с (C-10), 39.66 с (C-13), 39.87 с (СН₂-1),

41.33 с (СН₂-7), 43.89 с (C-4), 48.24 с (C-8), 48.97 с

двукратно добавляли и отгоняли при пониженном

давлении 1 мл абсолютного толуола, затем 1 мл

(СН₂-15), 54.10 с (СН₂-14), 54.56 с (СН-9), 57.07 с

абсолютного СН₂Cl₂, сушили на масляном насосе

(CH-5), 64.62 с (СН₂-1''), 177.90 с (С-19), 225.28 с

(С-16). Спектр ЯМР ³¹Р, δ, м.д.: 24.09. Масс-спектр

1 ч. К полученному полупродукту (триметилсили-

ЖУРНАЛ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ том 55 № 1 2019

СИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

MALDI, m/z: 575.6 [M-H]^-,

557.6

[M-H₂O-H]^-.

зы); и эмбриональные клетки легкого человека WI-

Найдено, %: С 55.98; Н 8.09; P 10.62. C₂₇H₄₆O₉P₂.

38 в концентрациях рекомендованных для скринин-

Вычислено, %: С 56.24; Н 8.04; P 10.74.

га новых противоопухолевых агентов (100-1 µМ).

Клеточные линии были получены из коллекций

9-(16,19-Диоксо-энт-бейеран-19-илокси)но-

Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Cте-

нан-1,1-дифосфоновая кислота (9с). Выход 50%,

пень подавления роста клеток под влиянием тести-

[α]D20 -25.0° (2.1, CH₂Cl₂). Спектр ЯМР ¹H, δ, м.д.:

руемого агента вычисляли по формуле:

0.70 с (3H, СH₃-20), 0.97 с (3Н, СH₃-17), 1.18 с (3Н,

СH₃-18), 0.80-1.95 м (18Н, бейерановый скелет),

N% = (1 - Опыт/Контроль) × 100,

2.17 д (1Н, Н-3_экв, J 12.2 Гц), 2.35 уш.с. (1Н, СН-

9''), 2.63 д (1Н, Н-15a, J 18.5 Гц), 3.90-4.08 м (2Н,

Затем по кривой зависимости роста культуры

СН₂-1''), 7.55 уш.с (4Н, POH ). Спектр ЯМР ¹³C,

клеток от концентрации соединения определяли

δ, м.д.: 13.43 с (СН₃-20), 19.00 с (СН₂-2), 19.85 с

IC₅₀, то есть концентрацию препарата, вызываю-

(СН₃-17), 20.33 с (СН₂-11), 21.71 с (СН₂-6), 28.47,

щие торможение роста клеток на 50%. Соединение

28.61, 28.99, 29.24, 29.32, 29.48, 29.67 с (7 СН₂-

нового класса считается цитотоксически актив-

2''-8''), 28.99 с (СН₃-18), 37.36 с (СН₂-12), 37.92 с

ным при IC₅₀ < 10^-4М. [28].

(СН₂-3), 38.01 с (C-10), 39.54 с (C-13), 39.85 с

Оценку гемолитеческой активности дифосфос-

(СН₂-1), 41.46 с (СН₂-7), 43.84 с (C-4), 48.40 с (C-

фонатов 8a-8c, 9a-9c проводили сравнением оп-

8), 48.83 с (СН₂-15), 54.20 с (СН₂-14), 54.64 с (СН-

тической плотности их растворов и взвеси эри-

9), 57.08 с (CH-5), 64.49 с (СН₂-1''), 177.55 с (С-

троцитов человека в физиологическом растворе

19), 223.74 с (С-16). Спектр ЯМР ³¹Р, δ, м.д.: 24.68.

с оптической плотностью крови при 100%-ном

Масс-спектр MALDI, m/z: 603.2 [M-H]^-. Найдено,

гемолизе по известной методике [29].

%: С 57.12; Н 8.29; P 10.51. C₂₉H₅₀O₉P₂. Вычисле-

но, %: С 57.61; Н 8.33; P 10.25.

Для изучения апоптоза использовали протокол

Apoptosis BioApp многофункциональной систе-

Антимикробную активность изучали мето-

мы Cytell Cell Imaging (GE Helthcare Life Science,

дом серийных разведений в жидких питательных

Швеция) и Alexa Fluor 647 Annexin V.

средах по методикам [25, 26], определяя мини-

мальную ингибирующую концентрацию (МИК),

Все биологические эксперименты проводили с

вызывающую задержку роста и размножения

трехкратным повторением.

тест-микроорганизмов. Использовали культуры

грамположительных бактерий: Staphylococcus

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

aureus АТСС 209p, Bacillus cereus АТСС 8035;

грамотрицательных бактерий Escherichia coli

Авторы благодарят ЦКП-САЦ ФИЦ КазНЦ

CDC F-50, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 и

РАН за проведенные исследования.

грибов Aspergillus niger BKMF-1119, Trichophyton

mentagrophytes var. gypseum 1773, Candida albiсans

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

855-653.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта ин-

Оценку цитотоксического действия проводили

тересов.

путем подсчета жизнеспособных клеток с помо-

щью многофункциональной системы Cytell Cell

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Imaging (GE Helthcare Life Science, Швеция), ис-

пользуя приложение Cell Viability BioApp, которое

1. Zhang S., Gangal G., Uludag H., Chem.Soc.Rev. 2007,

36, 507.

позволяет точно подсчитать количество клеток,

оценить их жизнеспособность на основании ин-

2. Rogers M.J., Crockett J.C., Coxon F.P., Monkkonen J.,

тенсивности флуоресценции [27]. Для экспери-

Bone, 2011, 49, 34.

ментов использовали опухолевые культуры клеток

3. Thompson, K., Roelofs, A.J., Jauhiainen, M.,

М-Hela клон 11 (эпителиоидная карцинома шейки

Mönkkönen H., Mönkkönen, J., Rogers, M.J., Advances

матки), MCF-7 (аденокарцинома молочной желе-

in Experimental Medicine and Biology. Ed. Y. Choi.

ЖУРНАЛ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ том 55 № 1 2019

СТРОБЫКИНА и др.

N.Y. London. Dordrecht. Heidelberg. Springer, 2010,

[Strobykina I.Yu., Khaibullin R.N., Sapunova A.S.,

658, 11.

Voloshina A.D., Sharipova R.R., Kravchenko M.A.,

Kataev V.E. Chem. Nat. Comp. 2018, 54 (4), 688.]

Leon A., Liu L., Yang Y., Hudock M. P., Hall P., Yin F.,

Studer D., Puan K.-J., Morita C.T., Oldfield E. J.Med.

19.

Houghton T.J., Tanaka K.S.E., Kang T., Dietrich E.,

Chem. 2006, 49, 7331.

Lafontaine Y., Delorme D., Ferreira S.S., Viens F.,

Arhin F.F., Sarmiento I., Lehoux D., Fadhil I.,

Abdou W.M., Barghash R.F., Bekheit M.S.,

Laquerre K., Liu J., Ostiguy V., Poirier H., Moeck G.,

Geronikaki A. ChemistrySelect, 2016, 1, 3797.

Parr T.R., Far A.R. J. Med. Chem. 2008, 51, 6955.

Santini D., Fratto M.E., Vincenzi B., La Cesa A.,

20.

Szajnman S.H., Rosso V.S., Malayil L., Smith A.,

Dianzani C., Tonini G. BioDrags, 2004, 18, 269.

Moreno S.N.J., Docampo R., Rodriguez J.B. Org.

Morgan G., Lipton A. Semin. Oncol. 2010, 37, S30.

Biomol.Chem., 2012, 10, 1424.

Green J.R. Oncologist, 2004, 9 (4), 3.

21.

Chiminazzo A., Sperni L., Damuzzo M., Strukul G.,

Holstein S.A., Cermak D.M., Wiemer D.F. Lewis K.,

Scarso A. Chem. Cat. Chem. 2014, 6, 2712.

Hohl R.J. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 687.

22.

Mosettig E., Nes W.R. J. Org. Chem. 1955, 20, 884.

10.

Январев Д.В., Коровина А.Н., Усанов Н.Н., Кочет-

23.

Хайбуллин Р.Н., Стробыкина И.Ю., Катаев В.Е.,

ков С.Н. Биоорг. хим. 2012, 38 (2), 257. [Yanvarev

Лодочникова О.А., Губайдуллин А.Т. ЖОХ. 2009,

D.V., Korovina A.N., Usanov N.N., Kochetkov S.N.

(5),

967.

[Khaibullin R.N., Strobykina I.Yu.,

Russ. J. Bioorg. Chem. 2012, 38 (2), 224.]

Kataev V.E., Lodochnikova O.A., Gubaidullin A.T.,

11.

Gałęzowska J., Czapor-Irzabek H., Chmielewska E.,

Musin R.Z. Russ. J. Gen. Chem. 2009, 79 (5), 795.]

Kafarski P. and Janek T.. New J. Chem. 2018, 42, 7723.

24.

Korochkina M., Fontanella M., Casnati A., Arduini A.,

12.

Wang M., Li H., Xu F., Gao X., Li J., Xu S., Zhang D.,

Sansone F., Ungaro R., Latypov Sh., Kataev V., and

Wu X., Xu J., Hua H., Li D. Eur. J. Med. Chem. 2018,

Alfonsov V. Tetrahedron. 2005, 61, 5457.

156, 885.

25.

National Committee for Clinical Laboratory Standards,

13.

Strobykina I.Yu , Belenok M.G., Semenova M.N.,

Methods for dilution antimicrobial susceptibility. Tests

Semenov V.V., Babaev V.M., Rizvanov I.Kh.,

for bacteria that grow aerobically—Sixth edition:

Mironov V.F., Kataev V.E. J. Nat. Prod. 2015,78,1300.

Approved standard. M7-A5, NCCLS, Wayne, PA.,

USA. 2000.

14.

Гарифуллин Б.Ф., Честнова Р.В., Миронов В.Ф.,

26.

National Committee for Clinical Laboratory Standards,

Катаев В.Е. ХПС, 2012, 5, 711. [Garifullin, B.F.,

Reference method for broth dilution antifungal

Chestnova, R.V., Mironov, V.F., Kataev, V.E. Chem.

susceptibility testing of conidium-forming filamentous

Nat. Comp. 2012, 48 (5), 794.]

fungi: Proposed standard. M38-P, NCCLS, Wayne,

15.

Mamedova V.L., Nikitina K.A., Mamedov V.A., Kataev

PA., USA. 1998.

V.E., Alfonsov V. A. Mendeleev Commun. 2005, 15 (3),

27.

Волошина А.Д., Семенов В.Э, Стробыкина А.С.,

98.

Кулик Н.В., Крылова Е.С., Зобов В.В., Резник В.С.

16.

Мамедова В.Л., Никитина К.А., Альфонсов В.А.

Биоорг. хим. 2017, 43 (2),

197.

[Voloshina A.D.,

Изв. АН. Сер .хим. 2012, 61 (8), 1605. [Mamedova

Semenov V.E., Strobykina A.S., Kulik N.V., Krylova

V.L., Nikitina K.A, Al’fonsov V.A. Russ. Chem. Bull.,

E.S., Zobov V.V., Reznik V.S., Russ. J. Bioorg. Chem.,

Intern. Ed. 2012, 61 (8), 1623.]

2017, 43, 170.]

17.

Мамедова В.Л., Никитина К.А., Альфонсов В.А.

28.

Миронов А.Н. Руководство по проведению докли-

Изв. АН. Сер. хим. 2009, 58 (1), 241. [Mamedova

нических исследований лекарственных средств.

V.L., Nikitina K.A, Al’fonsov V.A. Russ. Chem. Bull.,

2012. 1. 20.

Intern. Ed. 2009, 58 (1), 244.]

29.

Pashirova T.N., Lukashenko S.S., Zakharov S.V.,

18.

Стробыкина И.Ю., Хайбуллин Р.Н., Стробыки-

Voloshina A.D., Zhiltsova E.P., Zobov V.V.,

на А.С., Волошина А.Д., Шарипова Р.Р., Крав-

E.B. Souto E.B., Zakharova L.Ya., Coll. Surf B:

ченко М.А., Катаев В.Е. ХПС. 2018, 54 (4), 583.

Biointerfaces. 2015, 127, 266.

ЖУРНАЛ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ том 55 № 1 2019