Получение биомиметических материалов на основе коллагена и гидроксиапатита

365

Журнал прикладной химии. 2019. Т. 92. Вып. 3

УДК 54.01+666.9-129

ПОЛУЧЕНИЕ БИОМИМЕТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

НА ОСНОВЕ КОЛЛАГЕНА И ГИДРОКСИАПАТИТА

Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского

E-mail: vit-korokin@yandex.ru

Поступила в Редакцию 30 октября 2018 г.

После доработки 10 декабря 2018 г.

Принята к публикации 10 декабря 2018 г.

Описан новый подход к синтезу биомиметических материалов на основе наночастиц гидроксиапатита

и суспензии коллагена, полученной из отходов рыбного производства. В результате одновременного

совместного осаждения in vitro происходит образование частично минерализованных фибрилл коллаге-

на. Процесс аналогичен стадии минерализации при образовании костной ткани, происходящей in vivo.

Описанный способ получения биомиметического композитного материала коллаген-гидроксиапатит

может служить основой получения материалов для регенеративной медицины.

Ключевые слова: наногидроксиапатит, рыбный коллаген, золь-гель метод, минерализация, биоком-

позитный материал.

DOI: 10.1134/S0044461819030113

В настоящее время производство синтетических

Коллаген представляет собой фибриллярный бе-

аналогов костной ткани является особенно актуаль-

лок, который обеспечивает прочность и гибкость

ной задачей химического материаловедения. Во-

кости. В экспериментах по получению медицинских

первых, число людей, страдающих заболеваниями

материалов обычно используют коллаген, получен-

костей (остеопороз, остеосаркома), растет с каждым

ный из дермы (соединительно-тканная часть кожи у

годом. Ситуация осложняется также возрастающим

позвоночных животных и человека, расположенная

количеством травм, связанных с нарушением функ-

под эпидермисом) свиней, сухожилий крупного рога-

ций костной ткани. Во-вторых, современное развитие

того скота и хвостов крыс. Однако в последние годы

медицины требует качественно новых типов биомате-

все большее внимание уделяется рыбному коллагену:

риалов. В отличие от широко применяемых в настоя-

он гипоаллергенен, так как на 96% идентичен челове-

щее время титановых имплантатов такие материалы

ческому белку, обладает трансдермальными свойства-

должны не только временно заменять костный уча-

ми, т. е. способен проникать через эпидермальный

сток, но и срастаться с собственной костной тканью

барьер во внутренние слои кожи.

пациента [1-3].

Кроме того, дальнейший рост интереса к рыбному

В связи с вышесказанным пристальное внима-

коллагену обусловлен тем, что значительная часть

ние уделяется биомиметическим материалам — ма-

крупного рогатого скота подвержена различным ин-

териалам, имитирующим свойства биоматериалов

фекционным заболеваниям, в частности губчатой

или созданным на основе принципов, реализован-

энцефалопатии [4, 5].

ных в живой природе. Костная ткань представля-

Извлечение и использование рыбного коллагена

ет собой органо-неорганический композит, со-

решает еще одну важную отраслевую задачу — сокра-

стоящий в основном из коллагена первого типа,

щение отходов рыбного производства, включающих

гидроксиапатита (ГАП) и воды. Создание наиболее

помимо прочего большое количество белоксодержа-

полного аналога костной ткани человека является

щих частей (костей, чешуи, внутренних органов),

важнейшей целью современных исследований в дан-

которые составляют от 30 до 70% сырья. Отсутствие

ной области.

рационального использования отходов приводит,

366

Корокин В. Ж. и др.

с одной стороны, к потере чрезвычайно важного бел-

чение которого большая часть коллагена из исходного

кового продукта, а с другой — к загрязнению окружа-

материала растворяется) и, периодически помешивая,

ющей среды и нарушению Международной конвен-

отфильтровывали через два слоя капроновой ткани

ции о предотвращении загрязнения моря сбросами

(размер пор 0.45 мкм).

отходов и других материалов [6].

В результате была получена коллагеновая диспер-

ГАП представляет собой неорганическое соедине-

сия с содержанием коллагена 6-8% и молекулярной

ние идеализированного состава Ca₅(PO₄)₃OH. Будучи

массой 300-350 кДа, которую можно хранить в тече-

полным химическим и кристаллохимическим анало-

ние нескольких месяцев в холодильнике при темпе-

гом минерального компонента костной ткани, ГАП

ратуре 2-8°С. Выход коллагена составляет 40-70%

не вызывает иммунной реакции организма и поэто-

относительно массы обезвоженного сырья [10].

му широко используется в медицине (стоматология,

Получение композитного материала на основе

хирургия, косметология) [7-9]. В настоящей работе

коллагена и ГАП. Процесс минерализации пред-

представлен новый подход к извлечению суспензии

ставляет собой «сборку» нанокристаллов ГАП не-

коллагена из отходов производства рыбы, а также

посредственно на поверхности фибрилл коллагена.

к in vitro получению биокомпозитных материалов

В связи с вышесказанным процесс проводили сле-

(коллагеновых фибрилл, минерализованных ГАП) в

дующим образом: 0.15 М раствор нитрата кальция в

качестве первой стадии производства материалов для

бидистиллированной воде смешивали с дисперсией

замены костной ткани.

коллагена в ортофосфорной кислоте (концентрация

кислоты 1.47 моль·л^-1) для достижения значения

Са/Р = 1.67, соответствующего стехиометрическому

Экспериментальная часть

составу.

Приготовление суспензии рыбного коллагена.

Поскольку фибриллогенезис коллагена происхо-

Для реализации метода получения суспензии рыб-

дит при температуре тела человека (37-40°С), а ГАП

ного коллагена использовали отходы рыбного про-

начинает формироваться при значении кислотности

изводства — шкуры рыбы лосося атлантического

среды выше pH>5, данные условия были воспроиз-

Salmo salar. На первом этапе шкуры очищали от

ведены в текущем эксперименте с помощью нагрева

чешуи, мышечной ткани и жира, измельчали элек-

системы в термостате Lauda Alpha A24 и добавления

трическим диспергатором с диаметром пор 3.5 мм.

1 М раствора NaOH.

Коллагенсодержащее сырье 3 раза промывали водо-

Полученную смесь термостатитровали в течение 1

проводной водой в течение 30-50 мин, что обеспе-

ч, затем центрифугировали и высушивали без допол-

чивало растворение минеральных солей исходного

нительного термического воздействия. Химический

материала. После этого сырье заливали 3%-ным рас-

процесс, происходящий при получении первичной

твором ортофосфорной кислоты при жидкостном

гомогенной смеси, можно описать следующим урав-

коэффициенте 5, оставляли на 15-18 ч (время, в те-

нением реакции:

5Ca(NO₃)₂∙4H₂O + 3H₃PO₄(коллаген) + 10NaOH → Ca₅(PO₄)₃OH(коллаген) + 10NaNO₃ + 29H₂O.

Фазовую индивидуальность полученного не-

Анализ проб на общее содержание углерода, во-

органического вещества контролировали с помо-

дорода и азота осуществляли с использованием эле-

щью рентгеновского дифрактометра XRD-6000

ментного анализатора Vario EL cube для одновремен-

Shimadzu (CuKα-излучение, геометрия θ-2θ) в ин-

ного определения углерода, водорода и азота.

тервале 2θ = 10-60° с шагом сканирования 0.02°.

Регистрацию ИК-спектров образцов, приготовленных

Обсуждение результатов

в виде таблеток с бромидом калия, проводили на ИК-

Фурье-спектрометре FTIR-8400S Shimadzu в области

В результате проведения реакции по описанной

4000-400 см^-1 с разрешением 1 см^-1 и накоплением

выше методике были получены образцы биокомпо-

сигнала 20 сканов.

зитных материалов — минерализованных фибрилл

Для аттестации параметров структуры и морфоло-

коллагена. В синтезированном композитном матери-

гии образцов использовался растровый электронный

але, как следует из рис. 1, основным неорганическим

микроскоп JEOL JSM-IT300LV Jeol с энерго- и волно-

компонентом является ГАП, а наличие сопутствую-

дисперсионными приставками Oxford Inst.

щих или примесных фаз не выявлено.

Получение биомиметических материалов на основе коллагена и гидроксиапатита

367

групп соответственно, также были идентифицирова-

ны в спектрах.

Полоса поглощения при 675 см^-1 соответствует

колебаниям амидных групп в белке. Колебания связи

C-N в пирролидиновом кольце пролина и гидрокси-

пролина обнаружены при 1443 см^-1 [12].

Кроме того, в дополнение к полосам, характерным

для коллагена, в спектрах также наблюдаются поло-

сы, типичные для ГАП. Полосы поглощения при 1030

(ν₃), 561 (ν₄) и 606 см^-1 (ν₄) соответствуют валентным

Рис. 1. Порошковая рентгенограмма биокомпозита на

асимметричным колебаниям групп PO₄. Широкая

основе коллагена и гидроксиапатита (1) и материала

полоса при 3505 см^-1 относится к колебаниям гидрок-

природного происхождения (2).

сильной группы [13].

Также в спектрах композита и имплантата природ-

Другим подходом к определению фазового состава

ного происхождения были обнаружены полосы по-

исследуемых материалов была ИК-спектроскопия.

глощения карбонатной группы [ν₂(C-O)] при 873 см^-1

ИК-спектроскопические исследования подтверди-

и [ν₃(C-O)] при 1550 см^-1, подтверждающие обра-

ли сходство функционального состава полученного

зование карбонатгидроксиапатита. Таким образом,

композитного материала и материала имплантата

исследованные образцы содержали некоторое коли-

природного происхождения (рис. 2).

чество групп CO_32-. Согласно литературным данным,

Для исследуемых материалов в ИК-спектрах

карбонат-ионы частично замещают фосфат-ионы, т. е.

наблюдались типичные амидные полосы, харак-

образуются карбонатгидроксиапатиты типа Б [14].

терные для коллагена. Полоса при 1650 см^-1,

Слабая полоса при 750 см^-1 относится к коле-

соответствующая амиду I, обусловлена валентными

баниям связи Ca-O [15]. Наличие данной полосы в

колебаниями связи C=O карбонильных групп и явля-

композитном материале свидетельствует о том, что

ется чувствительным маркером вторичной структуры

между ионами кальция Ca²⁺ ГАП и ионами -COO^-

пептида. Деформационные колебания связи N-H при

карбонильной группы аминокислот в коллагене об-

1547 см^-1 соответствуют амиду II. Обнаруженные

разуется химическая связь.

полосы поглощения характеризуют колебания

Данный факт подтверждает наличие химического

пептидной связи белка и подтверждают коллагено-

взаимодействия двух фаз с образованием органо-не-

вую природу изучаемых образцов [11]. Типичные

органического композиционного материала, кото-

полосы поглощения при 2930, 2852, 1740 см^-1, кото-

рый играет важную роль в улучшении механических

рые относятся к валентным колебаниям метиленовой

свойств конечного материала [16].

(-CH₂-), метильной (-CH₃) и ацетильной (-C=O)

Результаты CHN-анализа показали общее количе-

ство органического компонента на уровне 20 мас%

в материале имплантата природного происхождения

и около 10 мас% в полученном композите. Общий

элементный состав исследуемых образцов был уста-

новлен с использованием микрозондового анализа.

Молярное отношение кальция к фосфору составило

1.58 для композитного материала, что меньше со-

ответствующей величины для стехиометрического

апатита 1.67.

При образовании нестехиометрических кристал-

лов может потребоваться более длительное время

для встраивания ионов кальция в кристаллическую

решетку апатита для достижения стехиометриче-

ского состава. Этот факт может объяснить дефицит

кальция в полученных композитных материалах, т. е.

полученный ГАП представляет собой дефектный

Рис. 2. ИК-спектр материала природного происхожде-

ния (1) и биокомпозита на основе коллагена и гидрок-

гидроксиапатит с размером кристаллов около 30 нм.

сиапатита (2).

Это обусловливает более низкую кристалличность

368

Корокин В. Ж. и др.

Рис. 3. Микрофотографии образцов природного материала (1) и биокомпозита (2).

Увеличение: а — 400, б — 800.

и более высокую растворимость по сравнению со

разрыва фибрилл коллагена, которые формируют во-

стехиометрическим ГАП и делает его аналогичным

локна ткани, возникают точки роста кристаллов ГАП.

ГАП нативной кости человека [17].

Такие разрывы, как и точки роста ГАП, встречают-

Следует также отметить, что коллагеновые фи-

ся периодически и обусловливают кристаллические

бриллы выступают в роли каркаса для осаждения

домены, повторяющиеся на протяжении всего волок-

кристаллов ГАП. Образование коллагеновых фи-

на (рис. 3). Такие минерализованные коллагеновые

брилл и их дисперсия будут определять гомогенность

волокна сами формируют различные ткани, в том

композитного материала. Когда раствор коллагена в

числе костную и другие соединительные ткани.

фосфорной кислоте контактирует с Са-содержащим

раствором, образование коллагеновых фибрилл про-

Выводы

исходит в результате локального увеличения значения

рН на дне реакционного сосуда. Одновременно про-

Композитные материалы на основе коллагена и

исходит осаждение кристаллов ГАП на поверхности

гидроксиапатита были получены с использованием

коллагеновых волокон с образованием наногранул.

метода совместного осаждения in vitro. Этот метод

В случае проведения синтеза при перемешивании

позволяет объединить процесс образования коллаге-

локальная концентрация, размер и форма гранулята

новых фибрилл и гидроксиапатита в одностадийном

могут варьироваться.

процессе, где обе реакции протекают одновременно.

В живых организмах костная ткань формируется

Коллагеновые фибриллы выступают в качестве кар-

при выходе минеральных компонентов и коллагена в

каса для осаждения наногидроксиапатита в процессе

межклеточное пространство [18]. При этом в местах

совместного осаждения. Описанный способ может

Получение биомиметических материалов на основе коллагена и гидроксиапатита

369

приводить к образованию гомогенного костно-ими-

[4] Heidaria F., Razavib M., Ghaedid M., Forooghia M.,

тационного коллаген-апатитного композита. Однако

Tahririe M., Tayebie L. // J. Alloys Compd. 2017.

точное управление такими параметрами, как гомоген-

V. 693. P. 1150-1156.

[5] Zahn D., Hochrein O., Kawska A., Brickmann J., Kni-

ность и дефектность гидроксиапатита на поверхности

ep R. // J. Mater. Sci. 2007. V. 42. P. 8966-8973.

коллагеновых фибрилл, остается актуальной задачей,

[6] http://www.imo.org/en/OurWork/Environment/LCLP/

заслуживающей дальнейшего изучения. Используя

Documents/LC1972.pdf (дата обращения:

современные методы исследования, мы доказали,

30.10.2018).

что процесс его образования аналогичен процессу

[7] Weiner S., Wagner H. D. // Annu. Rev. Mater. Sci.

минерализации коллагена в живом организме.

1998. V. 28. P. 271-298.

[8] Yano K., Namikawa T., Uemura T., Wakitani S., Taka-

oka K., Nakamura H. // Bone. 2011. V. 48. P. s166.

Благодарности

[9] Bulanov E. N., Boldin M. S., Knyazev A. V., Koro-

Автор выражает благодарность сотрудникам ком-

kin V. Zh., Popov A. A. // High Temperature Mater.

бината питания ННГУ Л. А. Пановой и Н. И. Фе-

Processes. 2018. V. 37. P. 613-617.

дянцевой за предоставленные материалы для иссле-

[10] Пат. РФ 2567171 (опубл. 2015). Способ получения

дования, а также Е. А. Потаниной за предоставление

уксуснокислой дисперсии высокомолекулярного

рыбного коллагена.

приборов во временное пользование и техническую

[11] Vidal B. // Acta Histochem. 2014. V. 116 (8). P. 1359-

помощь в оформлении статьи.

1366.

[12] Lacerda C., Plepis A. M. G., Goissis G. // Quím. Nova.

Финансирование работы

1998. V. 21. P. 267-271.

[13] Knyazev A. V., Chernorukov N. G., Bulanov E. N. //

Работа выполнена с использованием оборудования

Mater. Chem. Phys. 2012. V. 132. P. 773-781.

ЦКП «Новые материалы и ресурсосберегающие тех-

[14] LeGeros R. Z., LeGeros J. P., Trautz O. R., Shirra W. P.

нологии» (Нижегородский государственный универ-

// Adv. X-ray Anal. 1971. V. 14. P. 57-65.

ситет им. Н. И. Лобачевского), а также при финансо-

[15] Socrates G. Infrared and Raman Characteristic Group

вой поддержке Российского фонда фундаментальных

Frequencies. Tables and Charts. Wiley, England, 2001.

исследований (проект № 16-33-601721 мол_а_дк).

347 p.

[16] Alonso-Sierra S., Velázquez-Castillo R., Millán-

Malo B., Nava R., Bucioc L., Manzano-Ramírez A.,

Список литературы

Cid-Luna H., Rivera-Muñoz E. M. // Mater. Sci. Eng.

[1] Ben-Nissan B. // Current Opinion Solid State Mater. Sci.

C. 2017. V. 80. P. 45-53.

2003. V. 7. P. 283-288.

[17] Wang J., Liu C. // J. Bionic Eng. 2014. V. 11. P. 600-

[2] Wei D., Zhou Y., Jia D., Wang Y. // Surface Coatings

609.

Technol. 2007. V. 201. P. 8715-8722.

[18] Aparicio C., Ginebra M. P. Biomineralization and Bio-

[3] Best S. M., Porter A. E., Thian E. S., Huang J. // J. Eur.

materials: Fundamentals and Applications. Woodhead

Ceram. Soc. 2008. V. 28. P. 1319-1327.

Publ., UK, 2015. 482 p.