РАДИОХИМИЯ, 2020, том 62, № 2, с. 169-174

УДК 546.110.23

ВЛИЯНИЕ ОКСИДА ГРАФЕНА И УГЛЕРОДНЫХ

НАНОТРУБОК НА РЕАКЦИЮ АТОМОВ ТРИТИЯ

С ДАЛАРГИНОМ

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, химический факультет, кафедра радиохимии,

119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, строение 10.

e-mail: *chernysheva@radio.chem.msu.ru; **badunga@yandex.ru

Получено 27.03.2019, после доработки 18.04.2019, принята к публикации 25.04.2019

В работе проведено изучение влияния углеродных подложек (оксид графена, восстановленный оксид

графена, одностенные углеродные нанотрубки) на результат введения трития в пептид даларгин с помо-

щью метода термической активации. Показано, что при нанесении даларгина на углеродные подложки

существенно меняется распределение трития по аминокислотным остаткам по сравнению с толстой

мишенью, нанесенной непосредственно на стеклянные стенки сосуда. Показано, что при нанесении

монослоя даларгина на изученные углеродные материалы происходит существенное увеличение со-

держание трития в фенилаланине, что свидетельствует о протекании реакции изотопного обмена по

электрофильному механизму. Также было обнаружено значительное изменение содержания трития в

других аминокислотных остатках, что связано с различием структур адсорбционных слоев пептида,

образующихся на рассматриваемых углеродных материалах.

Ключевые слова: Изотопный обмен, тритий, метод термической активации трития, даларгин

DOI: 10.31857/S0033831120020112

Использование радиоактивной метки позволяет

дить радиоактивную метку в различные вещества

изучать метаболизм различных веществ в живых

и материалы, включая аминокислоты, пептиды,

организмах [1]. Среди радионуклидов биогенных

полимеры, вирусы и углеродные наноматериалы

[17-19]. Ниже приведена схема (схема 1) протека-

элементов, применяемых для in vitro и in vivo ис-

ющих в системе реакций:

следований белков и пепетидов, тритий имеет ряд

несомненных преимуществ: период полураспада

Только реакции (1.2) и (1.4) приводят к полу-

чению меченого материнского соединения, в то

(12,3 лет) обуславливает высокую удельную ра-

диоактивность однократно-меченных соединений

Схема 1. Радикальные реакции, протекающие при тер-

1 ПБк/моль и позволяет проводить достаточно

мической активации трития.

длительные исследования; а низкая энергия β-ча-

стиц (E_max = 18.6 кэВ) и отсутствие γ-квантов не

(1.1)

требует использования защиты от внешнего облу-

(1.2)

чения. Существует множество способов введения

(1.3)

трития в органические молекулы, которые можно

разделить на химические, которые описаны в об-

(1.4)

зорах [2-4] и исследовательских статьях [5-12], и

(1.5)

физико-химические методы, включающие обра-

ботку вещества тритием в условиях высокочастот-

(1.6)

ного разряда [13], плазмы [14], ионного пучка [15]

(1.7)

и метод термической активации трития [16].

(1.8)

Метод термической активации трития, основы

которого изложены в работе [17], позволяет вво-

169

170

ЧЕРНЫШЕВА и др.

время как результатом остальных реакций являет-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ся образование побочных продуктов или рекомби-

Материалы. В работе использовали олиго-

нация атомов трития [реакция (1.8)]. Вероятность

пептид

тирозил-D-аланил-глицил-фенилала-

протекания реакций зависит от условий проведе-

нил-лейцил-аргинина диацетат (ООО «Эллара»,

ния эксперимента, таких как температура воль-

Россия) коммерчески известный как даларгин

фрамового катализатора, давление газа, время

(PubChem CID 6917894). Использовали одностен-

экспонирования, температура мишени-вещества.

ные углеродные нанотрубки и монослойный оксид

Распределение трития в молекулах определяется

графена компании CheapTubes. Удельная поверх-

как химической природой групп, так и их стери-

ность материалов, определенная по сорбции азо-

ческой доступностью, что позволило использовать

та и рассчитанная по теории Брюнера-Эммета-

взаимодействие атомов трития с белками для ис-

Теллера, составила 570 и 60 м²/г для нанотрубок и

следования их пространственной организации -

оксида графена соответственно. Восстановленный

метод тритиевой планиграфии [20-22].

оксид графена получали по методике, описанной

Для получения высокой радиоактивности мече-

ниже. Для приготовления суспензий и растворов

ного соединения требуется полное покрытие сте-

использовали воду, очищенную с помощью систе-

клянных стенок реакционного сосуда веществом,

мы Milipore.

но часто это удается осуществить при использова-

Получение восстановленного оксида графе-

нии количества вещества много больше, чем тре-

на. Восстановление оксида графена проводили по

буется для равномерного монослойного покрытия.

модифицированной методике, описанной в работе

Как следствие не все молекулы вещества доступ-

ны для реакции с атомарным тритием, и не удает-

[27]. 30 мг оксида графена суспендировали в 15 мл

воды, добавляли 300 мг аспарагиновой кислоты,

ся получить предельно высокую удельную ради-

нагревали суспензию до 90°С и выдерживали при

оактивность меченого материнского соединения.

этой температуре 3 ч. По окончании реакции цвет

Решением проблемы может быть предварительное

нанесение вещества на подложки с развитой по-

суспензии менялся от исходно коричневого до чер-

верхностью.

ного. В качестве контроля проводили нагревание

суспензии оксида графена без добавки аспараги-

Влияние подложки на выход меченого продук-

новой кислоты. В этом случае суспензия остава-

та ранее подробно не изучалось, однако в работе

лась коричневой. Суспензию с восстановленным

[23] проведено сравнение распределения трития

оксидом графена центрифугировали в течение

в олигопептиде даларгин при активации реакции

30 мин при 21000 об./мин. Осадок декантировали,

на вольфрамовой проволоке, а также палладии и

промывали водой и высушивали.

платине, нанесенных на активированный уголь и

малослойный графит. Было показано увеличение

Введение трития в даларгин. 1 мг даларгина

содержания трития в ароматических аминокислот-

растворяли в 6.7 мл метанола. К 1 мл раствора до-

ных остатках при монослойном нанесении пепти-

бавляли 5 мг углеродного материала и подвергали

да на активированный уголь для двух способов

ультразвуковой обработке. Затем суспензию рав-

активации реакции.

номерно распределяли по стенкам реакционного

сосуда и удаляли метанол током газа.

Для дальнейшего выявления влияния подложки

на взаимодействие атомов трития с даларгином в

Сосуд с готовой мишенью присоединяли к

данной работе использовали углеродные нанома-

специальной вакуумной установке для работы с

териалы с разным содержанием функциональных

газообразным тритием и заполняли протий-трити-

групп и отличающихся структурой (оксид графе-

евой смесью, содержащей 60% трития до давления

на, восстановленный оксид графена, однослойные

0.5 Па. Вольфрамовую проволоку, расположенную

углеродные нанотрубки). Выбор даларгина обу-

в центре реакционного сосуда, нагревали электри-

словлен его строением - наличием ароматических

ческим током до 1850 K в течение 10 с. Затем отка-

и алифатических аминокислотных остатков, а так-

чивали остаточный газ с помощью форвакуумного

же его важностью в биохимических процессах в

насоса, заполняли сосуд новой порцией газовой

организме [24-26].

смеси и повторяли нагрев катализатора.

РАДИОХИМИЯ том 62 № 2 2020

ВЛИЯНИЕ ОКСИДА ГР

АФЕНА И УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК

171

Схема 2. Получение дериватов аминокислот.

R₂

H₂N

NEt₃

R₁

C₂H

OH, H₂O

O^-

Материал диспергировали в воде, удаляли три-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

тий из лабильных положений молекул двукратным

В результате обработки даларгина, нанесенно-

упариванием с помощью роторного испарителя и

го на углеродные наноматериалы, атомами трития

повторного суспендирования в воде.

в течение 10 с при температуре атомизатора 1850 К

Анализ распределения трития в аминокис-

была достигнута удельная радиоактивность от

лотных остатках даларгина. Проводили гидро-

0.57 Ки/ммоль (оксид графена) до 0.84 Ки/ммоль

лиз даларгина без удаления с углеродных нанома-

(восстановленный оксид графена и нанотрубки).

териалов [28]. Высушенный углеродный материал

Значение удельной радиоактивности хотя и выше

с нанесенным пептидом суспендировали в смеси

полученного для даларгина, нанесенного на ак-

соляной и трифторуксусной кислот (2:1 по объему)

тивированный уголь (0.47 Ки/ммоль [30]), оно

с добавкой 0.001% β-меркаптоэтанола. Гидролиз

сильно уступает величинам, достигнутым при на-

проводили в запаянных стеклянных ампулах при

несении даларгина на стеклянные стенки реакци-

155°С в течение 1 ч. Отделяли гидролизат от угле-

онного сосуда (8.4 и 31 Ки/ммоль для температуры

родного материала и удаляли компоненты гидро-

стенок 77 и 295 К [23]).

лизной смеси двукратной лиофилизацией.

Наиболее высокая удельная радиоактивность

Предколоночную дериватизацию аминокислот

даларгина была получена в работе [31] при ис-

проводили по модифицированной методике [29].

пользовании высокотемпературного твердофаз-

Лиофильно высушенную смесь аминокислот рас-

ного каталитического изотопного обмена, когда

творяли в смеси этанол-триэтиламин 2:1 по объе-

пептид наносили на Al₂O₃, а в качестве актива-

му и высушивали с помощью роторного испарите-

ции реакции использовали нагрев системы до

ля. Затем растворяли аминокислоты в 100 мкл сме-

140-190°С в течение 10-60 мин в присутствии 5%

си этанол-триэтиламин-вода-фенилизотиоцианат

Rh/Al₂O₃. При моделировании реакции на смеси

7:1:1:1 по объему и выдерживали при комнатной

водорода и трития в соотношении 1000:1 при тем-

температуре в темноте в течение ночи. Реакция де-

пературе 190°С указана удельная радиоактивность

риватизации показана на схеме 2.

323 Ки/ммоль, хотя это значение кажется завышен-

Жидкие компоненты реакционной смеси уда-

ным, так как молярная радиоактивность глицина

ляли с помощью роторного испарителя при 40°C.

70 Ки/ммоль в составе пептида превышает теоре-

Осадок растворяли в 0.5 мл воды и проводили

тически достижимую. Эксперимент с тритием при

экстракцию побочных продуктов реакции сме-

150°С позволил получить пептид с удельной ради-

сью гексан-этилацетат 7:1 по объему. При этом

оактивностью 52 Ки/ммоль.

дериваты аминокислот оставались в водной фазе.

Помимо величины удельной радиоактивности

Органическую фазу отбрасывали и экстракцию

важно знать внутримолекулярное распределение

повторяли до тех пор, пока водная фаза не станови-

трития, так как оно определяется механизмом изо-

лась прозрачной. Затем водный раствор упаривали

с помощью роторного испарителя, осадок раство-

топного обмена и зависит от химической природы

ряли в 50 мкл воды и проводили анализ с помощью

вступающего в реакцию трития. Рассмотрим изме-

высокоэффективной жидкостной хроматографии с

нение этого параметра для различных подложек,

контролем радиоактивности выходящих фракций.

на которые был нанесен пептид. Для удобства со-

Анализ проводили на колонке C₁₈ (NovaPark), в

поставления результатов распределения трития по

качестве подвижной фазы использовали градиент

аминокислотным остаткам пептида используем

буфера AccQ Tag Eluent (Waters) и 60% ацетони-

нормирование удельной радиоактивности каждо-

трила в воде.

го остатка на удельную радиоактивность пептида,

РАДИОХИМИЯ том 62 № 2 2020

172

ЧЕРНЫШЕВА и др.

(а)

(б)

Tyr Ala Gly Phe Leu Arg

Рис. 1. Распределение трития в аминокислотных остатках даларгина на углеродных поверхностях: (1) активированный уголь

по данным работы [23], (2) оксид графена, (3) восстановленный оксид графена, (4) одностенные углеродные нанотрубки:

(а) нормирование удельной радиоактивности остатка на удельную радиоактивность пептида; (б) нормирование на число

необменных атомов водорода (С-Н) в аминокислотном остатке.

определенную как сумму удельных радиоактивно-

рованного угля - 32%. В эксперименте, описанном

стей всех остатков:

в работе [31], в фенилаланине содержалось около

30% радиоактивности. Этим самым подтвержда-

моль

×100%,

(2)

ется, что при нанесении пептида разреженным

∑

моль_i

монослоем на углеродные материалы реализуется

удельная радиоактивность i-го аминокис-

где a_моль

электрофильный механизм реакции изотопного

лотного остатка.

обмена, что связано с взаимодействием поступа-

Для учета способности атомов водорода к изо-

ющих на мишень атомов с материалом подложки.

топному обмену в составе различных остатков ис-

В работе [23] высказано предположение, что при-

пользуем также нормировку на число необменных

сутствие значительного количества кислорода на

атомов водорода (С-Н) в аминокислотном остатке

поверхности активированного угля приводит или

к поляризации атома трития, либо к образованию

моль

×100%,

(3)

протона на поверхности активированного угля, за

∑

моль_i

счет чего возрастает вероятность протекания ре-

где n_i

- число необменных атомов водорода в i-ом

акции замещения по электрофильному механизму.

аминокислотном остатке.

То же самое можно сказать о поверхности оксида

На рис. 1а и 1б приведено распределение три-

графена и восстановленного оксида графена. При

тия по аминокислотным остаткам даларгина в рас-

попадании атома трития на углеродную поверх-

сматриваемых единицах.

ность происходит реакция с кислородными груп-

Важно отметить, что для всех использованных

пами поверхности с образованием кислотных цен-

углеродных наноматериалов наблюдается высо-

тров Бренстеда (-О³Н) [32], на которых возможен

кое (от 29 до 34%) содержание трития в остатке

изотопный обмен по электрофильному замеще-

фенилаланина. Ранее было показано, что при на-

нию в ароматических аминокислотных остатках

несении даларгина на стеклянные стенки в ана-

пептида. Таким образом, углеродная подложка,

логичных условиях проведения эксперимента в

адсорбируя активированный тритий, влияет на

фенилаланине содержится только 4% трития, а

механизм изотопного обмена. При образовании

при использовании в качестве подложки активи-

плотного слоя пептида на стекле реакция протека-

РАДИОХИМИЯ том 62 № 2 2020

ВЛИЯНИЕ ОКСИДА ГР

АФЕНА И УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК

173

(а)

(б)

(в)

Рис. 2. Структура даларгина (а), и даларгина на углеродной поверхности: (б) оксид графена; (в) углеродные нанотрубки.

ет по радикальному механизму. Если стекло при

Для оценки расположения даларгина на по-

температуре жидкого азота адсорбирует водород

верхности углеродных материалов провели мо-

посредством образования химических или Ван-

делирование методом молекулярной механики с

дер-Ваальсовых связей [33], то углеродная поверх-

помощью программы HyperChem 8.0 [38] в сило-

ность способствует перемещению активных форм

вом поле AMBER. Результаты расчета приведены

водорода [34-37].

на рис. 2. Структура молекулы даларгина без уча-

Важно отметить, что доля трития в остатке фе-

стия подложки удерживается за счет образования

нилаланина мало меняется для всех рассмотрен-

внутримолекулярных водородных связей между

ных углеродных материалов. Вместе с тем обна-

остатками аргинина и глицина, а также остатками

ружено большое различие по включению трития

аргинина и фенилаланина. На поверхности оксида

в остатки глицина, лейцина и тирозина. При обра-

графена внутримолекулярные водородные связи

ботке атомами трития даларгина, нанесенного на

заменяются водородные связи между кислородом

оксид графена и восстановленный оксид графена,

поверхности и NH-группами аргинина, лейцина и

резко снижалась радиоактивность остатков лейци-

тирозина. за счет этого молекула даларгина плоско

на и тирозина, но возрастала радиоактивность гли-

«лежит» на поверхности оксида графена. Так как в

цина. Такое синхронное снижение радиоактивно-

остатке глицина расстояние между атомами азота

сти для алифатического и ароматического остатков

и углерода карбонильной группы увеличивается

нельзя объяснить только изменением механизма

от 2.49 Å (свободная молекула) до 2.68 Å (на ок-

реакции из-за изменения химического состояния

сиде графена), атомы водорода в остатке глицина

вступающего в реакцию трития. Вероятно, здесь

становятся более доступны для взаимодействия

может сказываться структурная организация моле-

с атомами трития, как поступающим из газовой

кул в адсорбционном слое.

фазы, так и диффундирующим по поверхности

Принимая во внимание площадь поверхно-

оксида графена. Также при адсорбции даларгина

сти, занимаемую даларгином, равную 2.93 нм²

на поверхности оксида графена остатки фенилала-

(PubChem CID 6917894) и удельную поверхность

нина и лейцина испытывают достаточное сильное

углеродных материалов, можно оценить плотность

взаимодействие с атомами подложки, что способ-

покрытия: оксид графена покрывается монослоем

ствует изменению механизма реакции на элек-

даларгина, а в случае нанотрубок образуется не-

трофильный. Кроме того, из-за уменьшения угла

насыщенный слой. Если молекулам даларгина до-

между ароматическим кольцом фенилаланина и

ступно только 100 м²/г поверхности нанотрубок,

алкильным радикалом лейцина от 107° (свободная

то толщина образующегося слоя близка к монос-

молекула) до 93° (на оксиде графена) возможно

лою, что видится более реалистичным для моле-

некоторое экранирование атомов водорода в остат-

кул с молекулярной массой 725.8 г/моль.

ках лейцина.

РАДИОХИМИЯ том 62 № 2 2020

174

ЧЕРНЫШЕВА и др.

При контакте даларгина с углеродной нано-

11.

Egan J.A., Filer C.N. // J. Radioanal. Nucl. Chem.

Springer Netherlands, 2016. Vol. 307, № 1. P. 549.

трубкой молекула «обворачивается» вокруг труб-

12.

Pająk M. et al. // J. Radioanal. Nucl. Chem., 2018.

ки (рис. 2в). На поверхности нанотрубок образу-

Vol. 317, № 2. P. 643.

ются внутримолекулярные водородные связи меж-

13.

Нейман Л.А., Смоляков В.С., Шишков А.В. // Итоги

ду остатками аргинина и фенилаланина, аргинина

науки и техники. Москва. Москва: Москва, 1985.

и глицина, а также тирозина и аланина. В резуль-

P. 193.

14.

Girard H.A. et al.T // Chem. Commun., 2014. Vol. 50.

тате все аминокислотные остатки не испытывают

№ 22. P. 2916.

стерических и других затруднений для реакции с

15.

Bush G.A. et al. // J. Biol. Chem., 1981. Vol. 256,

тритием и распределение трития по остаткам ста-

№ 23. P. 12213.

новится гораздо более равномерным.

16.

Филатов Э.С., Симонов Е.Ф. Физико-химические

и ядерно-химические способы получения меченых

Представленные данные показывают слож-

соединений и их идентификация. Москва: Энергоа-

ность процессов изотопного обмена трития при

томиздат, 1987. 348 p.

нанесении соединений мономолекулярным слоем

17.

Badun G.A., Chernysheva M.G., Ksenofontov A.L. //

на подложки. В результате взаимодействия атомов

Radiochim. Acta., 2012. Vol. 100. № 6. P. 401.

трития с углеродной подложкой они приобрета-

18.

Badun G.A. et al. // Radiochim. Acta., 2016. Vol. 104,

№ 8, P. 593.

ют свойства протонов, которые могут вступать в

19.

Badun G.A. et al. // Radiochim. Acta., 2014. Vol. 102,

реакцию изотопного обмена по механизму элек-

№ 10. P. 941.

трофильного замещения. Во фрагментах молеку-

20.

Tsetlin V.I. et al. T // Eur. J. Biochem., 1988. Vol. 178,

лы, не контактирующих с подложкой, возможен

№ 1. P. 123.

изотопный обмен по радикальному механизму.

21.

Agafonov D.E., Kolb V.A., Spirin A.S. // Proc. Natl.

Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences,

Поэтому для объяснения результатов необходимо

1997. Vol. 94, № 24. P. 12892.

учитывать межмолекулярные взаимодействия и

22.

Bogacheva E.N. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. National

структурную организацию адсорбционного слоя.

Acad. Sci., 1998. Vol. 95, № 6. P. 2790.

23.

Разживина И.А. et al. // Радиохимия., 2019. Vol. 61,

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

№ 1. P. 56.

Работа выполнена при поддержке Российского

24.

Plotnikov E.Y. et al. // Toxicol. Lett. Elsevier Ireland

фонда фундаментальных исследований (грант

Ltd, 2013. Vol. 220. № 3. P. 303.

№ 18-33-20147-мол-а-вед).

25.

Schroeder U., Sommerfeld P., Sabel B.A. // Peptides.,

1998. Vol. 19, № 4. P. 777.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

26.

Tadzhibova L.T. et al. // Bull. Exp. Biol. Med., 2011.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

Vol. 150. № 3. P. 304.

27.

Tran D.N.H., Kabiri S., Losic D. // Carbon N. Y. Elsevier

интересов.

Ltd, 2014. Vol. 76. P. 193.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

28.

Chernysheva M.G. et al. // Colloids Surfaces A

1. Lee A.J. et al. // Amino Acids., 2015. Vol. 47, № 5. P. 91.

Physicochem. Eng. Asp., 2017. Vol. 520. P. 1.

2. Saljoughian M., Williams P. // Curr. Pharm. Des., 2000.

29.

Степанов К.В. et al. // Вест. Моск. унив., Серия 2.

Vol. 6, № 10. P. 1029.

Химия, 2005. Vol. 46, № 6. P. 395.

3. Myasoedov N.F. // J. Label. Compd. Radiopharm., 1993.

30.

Разживина И.А. // Дисс. кан. хим. наук, Москва,

Vol. 33, № 5. P. 391.

2019.

4. Lockley W.J.S. // J. Label. Compd. Radiopharm., 2007.

31.

Zolotarev Y.A. et al. // Amino Acids., 2003. Vol. 24,

Vol. 50. № 5-6. P. 256.

№ 3. P. 325.

5. Shevchenko V.P., Nagaev I.Y., Myasoedov N.F. // J.

32.

Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. //

Label. Compd. Radiopharm., 2010. Vol. 53, № 11-12.

Радиохим., 2018. Vol. 60. № 2. P. 97.

P. 693.

33.

Филатов Э.С., Симонов Е.Ф., Орлова М.А. // Усп.

6. Kopylov A.T. et al. // Rapid Commun. Mass Spectrom.,

химии., 1981. Vol. 50. № 12. P. 1134.

2016. Vol. 30. № 11. P. 128.

34.

Prins R. // Chem. Rev., 2012. Vol. 112, № 5. P. 2714.

7. Hickey M.J. et al. // J. Label. Compd. Radiopharm.,

35.

Lipson A.G. et al. // Int. J. Hydrogen Energy. Elsevier

2007. Vol. 50. № 5-6. P. 286.

Ltd, 2012. Vol. 37, № 7. P. 5676.

8. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. // Ра-

36.

Pham V.H. et al. // J. Mater. Chem. A., 2013. Vol. 1,

диохим., 2012. Vol. 54, № 1. P. 75.

№ 4. P. 1070.

9. Kozlowska M., Kanski R., Kanska M. // J. Label. Compd.

37.

Silambarasan D. et al. // ACS Appl. Mater. Interfaces.,

Radiopharm., 2005. Vol. 48, № 3. P. 23.

2013. Vol. 5, № 21. P. 11419-11426.

10. Zhang Y. // J. Label. Compd. Radiopharm., 2017. Vol.

38.

Pazun J.L. // J. Chem. Inf. Model., 1993. Vol. 33,

60. № 13. P. 608.

№ 6. P. 931.

РАДИОХИМИЯ том 62 № 2 2020