РАДИОХИМИЯ, 2020, том 62, № 4, с. 345-348

УДК 100.02.3:546:547.15/17

МЕЧЕННЫЕ ТРИТИЕМ ПРОИЗВОДНЫЕ ДОФАМИНА,

СЕРОТОНИНА И ДОКСОРУБИЦИНА, СОДЕРЖАЩИЕ

НЕУСТОЙЧИВЫЕ В УСЛОВИЯХ ГИДРИРОВАНИЯ

ФРАГМЕНТЫ

Институт молекулярной генетики РАН, 123182, Москва, пл. Курчатова, д. 2

*e-mail: ATRegister@mail.ru

Получена 30.04.2019, после доработки 15.07.2019, принята к публикации 17.07.2019

Впервые синтезированы необходимые предшественники для получения меченных тритием Z-Gly-Pro-

DOPA, Z-Gly-Pro-Srt, Z-Gly-Pro-Dox, Ol-Gly-Pro-DOPA, Ol-Gly-Pro-Srt (Gly - глицин, Pro - пролин,

Ol - олеиновая кислота, DOPA - дофамин, Dox - доксорубицин, Srt - серотонин, Z - бензилоксикарбо-

нильная защита). С использованием меченных тритием пролина и глицина синтезированы пептидные

производные DOPA, Dox и Srt с разным распределением трития.

Ключевые слова: синтез, производные дофамина, серотонина, доксорубицина, тритий, пептиды

DOI: 10.31857/S0033831120040085

Для синтеза меченных тритием пептидных

Dox, Ol-Gly-[³Н]Pro-DOPA, Ol-Gly-[³Н]Pro-Srt, Ol-

производных биологически активных соединений

[³Н]Gly-Pro-DOPA, Ol-[³Н]Gly-Pro-Srt.

(БАС), содержащих неустойчивые в условиях ги-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

дрирования фрагменты, необходимо введение три-

тия в соответствующий предшественник с после-

Катализаторы, реагенты и растворители - ком-

дующим включением его в искомое соединение.

мерческие препараты. Нерадиоактивные стандар-

Синтез и использование предшественников для

ты синтезировали по методикам [5-8]. Тритий в

получения меченых соединений могут осущест-

глицин (27-31 Ки/ммоль) вводили по методу [9].

вляться разными методами. Например, меченные

Исходные и конечные продукты характеризова-

тритием бензойные кислоты использовались для

ли с использованием метода высокоэффективной

получения меченых нейротоксинов (7,8-дигидро-

жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Препараты

батрахотоксин, аконитин), которые необходимы

очищали методом ВЭЖХ. Анализ проводили на

для изучения быстрых натриевых каналов электро-

хроматографе Милихром А-02 с использованием

возбудимых мембран [1]. Этим же методом полу-

колонки ProntoSIL-120-5-C18 AQ DB-2003 (2×

чены меченые аналоги нуклеотидов и ряда других

75 мм, размер частиц 5 мкм), в градиенте метанола

БАС [2-4]. При получении меченых производных

в 0.1%-ной уксусной кислоте (см. таблицу). Ско-

дофамина, серотонина и доксорубицина, в состав

рость подачи элюента - 0.2 мл/мин. длины волны

которых входили ненасыщенные жирные кислоты

210 нм.

или бензилоксикарбонильная защита (Z), необхо-

Радиоактивность измеряли на сцинтилля-

димо было прибегнуть к подобному подходу. При

ционном счетчике LKB1215 с эффективностью

использовании [³Н]Pro и [³Н]Gly получены мече-

регистрации трития около 30% в диоксановом

ные соединения с разным распределением трития.

сцинтилляторе. Для сбора и обработки хромато-

Целью данной работы являлся синтез Z-Gly-

графических данных использовали систему Муль-

[³Н]Pro-DOPA, Z-Gly-[³Н]Pro-Srt, Z-Gly-[³Н]Pro-

тиХром 1.5 (ЗАО «Амперсенд», Россия).

345

346

ШЕВЧЕНКО и др.

Времена удерживания Z- и Ol-содержащих произво-

20 мкл Et₃N и 10 мкл ди-трет-бутилпирокарбона-

дных дофамина, серотонина и доксорубицина

та (Вос₂О) в 0.4 мл изопропанола и перемешивали

Времена удерживания,

реакционную смесь 17 ч. Растворитель и летучие

Соединение

мин (градиент, %)

вещества удаляли упариванием. Остаток лиофи-

Z-Gly-Pro-DOPA

4.97 (30-100)

лизировали, промывали петролейным эфиром (2×

Z-Gly-Pro-Srt

5.25 (30-100)

0.2 мл) и растворяли в 4 мл метанола. Выход

Z-Gly-Pro-Dox

9.18 (30-100)

Boc-[³H]Gly 90%.

Ol-Gly-Pro-DOPA

7.80 (70-100)

77 мКи (3 мкмоль) Boc-[³H]Gly растворяли в

Ol-Gly-Pro-Srt

7.76 (70-100)

0.5 мл сухого диоксана. Затем прибавляли 1.5 мг

Синтез [³H]Pro. Раствор 5 мг дегидропроли-

(7.3 мкмоль) ДЦГК и 1.1 мг (10 ммоль) N-окси-

на (ΔPro) в 0.15 мл воды в присутствии 10 мг 5%

сукцинимида. Через 7 ч раствор упаривали, рас-

PdO/BaSO₄ помещали в реакционную ампулу, за-

творяли осадок в 0.5 мл этанола и добавляли

мораживали жидким азотом и вакуумировали до

20 мкл Et₃N и 1.0 мг (6 мкмоль) HCl·ProOМе.

0.1 Па. Напускали 70-80%-ный газообразный три-

Раствор перемешивали 15 ч при комнатной тем-

тий (давление 400 гПа), и при комнатной темпера-

пературе. Раствор упаривали, остаток растворяли

туре перемешивали раствор 1.5 ч. Раствор вновь

в 4 мл этилацетата и промывали 1 мл 1 н. HCl и

замораживали жидким азотом и удаляли избы-

дважды водой. Анализ проводили на хроматогра-

точный тритий адсорбцией последнего на уране

фе Милихром А-02, как описано выше. Выделе-

с последующим вакуумированием. Катализатор

ние меченого соединения проводили ВЭЖХ, как

отфильтровывали и промывали метанолом (3×

описано выше. Вос-[³Н]Gly-ProОМе растворяли в

1 мл). Лабильный тритий удаляли упариванием

0.3 мл смеси хлороформа с трифторуксусной кис-

лотой и упаривали через 40 мин. Выход меченого

реакционной смеси с 80%-ным водным метанолом

[3Н]Gly-ProОМе 69%.

(3×3 мл). Выход меченого пролина 95% (молярная

активность 35-40 Ки/ммоль).

Синтез Ol-[³H]Gly-Pro и Ol-Gly-[³H]Pro. 43 мг

(0.14 ммоль) олеата натрия обрабатывали раство-

Синтез Z-Gly-[³H]Pro. К раствору

7.5 мг

ром 0.1 мл хлористого тионила в 0.4 мл хлорофор-

(30 мкмоль) Z-Gly в 0.5 мл диоксана прибавля-

ма. Через 2 ч упаривали и растворяли в 2 мл хло-

ли 6.2 мг (54 мкмоль) N-оксисукцинимида (Su) и

роформа.

7.6 мг (37 ммоль) N,N-дициклогексилкарбодиими-

да (ДЦГК). Через 7 ч 0.25 мл раствора отбирали и

а. Раствором 50 мкмоль хлорангидрида олеино-

упаривали. Остаток растворяли в 400 мкл этано-

вой кислоты (OlCl) обрабатывали 9 мг (0.1 ммоль)

ла и добавляли 15 мкл Et₃N. Реакцию с 15 мкмоль

солянокислого метилового эфира глицина в 2 мл

Z-Gly-Su начинали прибавлением

260 мКи

хлороформа с 0.1 мл триэтиламина и перемешива-

(7 мкмоль) [³Н]Pro в 250 мкл смеси воды и этано-

ли 2 ч. Упаривали, растворяли в 3 мл этилацетата и

ла (1 : 2) и вели при перемешивании 15 ч. Раствор

промывали 2 мл 1 н. HCl, затем три раза по 0.4 мл

упаривали, остаток растворяли в 4 мл этилацетата

воды. Органическую фазу упаривали, лиофилизи-

и промывали 1 мл 1 н. HCl и дважды водой. Анализ

ровали. Для удаления олеиновой кислоты раствор

проводили на хроматографе Милихром А-02, как

реакционной смеси в 2 мл эфира промывали 1 мл

описано выше. Выделение меченого соединения

0.2 н. NaOH. Эфирный раствор упаривали, оста-

проводили методом ВЭЖХ на колонке Kromasil

ток растворяли в 4 мл метанола и добавляли 1 мл

100C18 (8×150 мм, размер частиц 7 мкм). Элюент

0.2 н. NaOH. Через 1 ч образовался Ol-Gly. Выход

А - метанол-вода-AcOH-трифторуксусная кисло-

препарата 70%.

та (TFA) (20 : 80 : 0.1 : 0.01); элюент В - метанол;

б. К раствору 18.9 мг (56 мкмоль) Ol-Gly в 1 мл

линейный градиент от 0 до 100% В за 30 мин. Ско-

диоксана прибавляли 7 мг (61 мкмоль) N-оксисук-

рость подачи элюента 2 мл/мин, детектор по ради-

цинимида и 12.0 мг (58 мкмоль) ДЦГК, перемеши-

оактивности. Время удерживания 16.5 мин. Выход

вали смесь 7 ч и упаривали.

меченого Z-Gly-[³Н]Pro 69%.

25% полученного Ol-GlySu (14 мкмоль) рас-

Синтез Boc-[³H]Gly и [3H]Gly-ProОМе. К

творяли в 400 мкл этанола и добавляли 15 мкл

раствору 88 мКи глицина в 1 мл воды добавляли

Et₃N. Реакцию с Ol-GlySu начинали прибавлением

РАДИОХИМИЯ том 62 № 4 2020

МЕЧЕННЫЕ ТРИТИЕМ ПРОИЗВОДНЫЕ ДОФАМИНА

347

260 мКи (7 мкмоль) [³Н]Pro в 0.2 мл смеси воды

б. В аналогичных условиях проводили получе-

и этанола (1 : 3) и вели при перемешивании 15 ч.

ние и очистку Ol-[³H]Gly-Pro-Srt. Выход Ol-[³H]

Раствор упаривали, остаток растворяли в 4 мл

Gly-Pro-Srt 50%, время удерживания 30.9 мин.

этилацетата и промывали 1 мл 1 н. HCl и дважды

Синтез Ol-Gly-[³H]Pro-Srt, Ol-Gly-[³H]Pro-

водой. Анализ и очистку проводили, как описано

DOPA. К раствору 175 мКи (5 мкмоль) Ol-Gly-

выше. Выход Ol-Gly-[³Н]Pro 55%.

[3H]Pro и 1.2 мг (10 мкмоль) N-оксисукцини-

75% сукцинимидного производного Ol-Gly

мида в 0.5 мл сухого диоксана добавляли 2.3 мг

(42 мкмоль) растворяли в 400 мкл этанола и добав-

(11 мкмоль) ДЦГК и перемешивали 5 ч при 23°С. За-

ляли 50 мкл Et₃N. Реакцию с Ol-GlySu начинали

тем растворитель упаривали. Осадок растворяли в

прибавлением 10 мг (66 мкмоль) Pro·HCl в 0.2 мл

1 мл этанола.

смеси воды и этанола (1 : 3) и вели при перемеши-

К 0.5 мл этанольного раствора прибавляли

вании 15 ч. Продукт выделяли, как описано выше.

15 мкл триэтиламина и 10 ммоль дофамина или

Строение Ol-Gly-Pro подтверждено масс-спектро-

серотонина. Растворы перемешивали при комнат-

метрическими данными, полученными на прибо-

ной температуре в течение ночи. Соединения очи-

ре LCQ Advantage MAX (ThermoElectron, США)

щали, как описано выше. Выход Ol-Gly-[³H]Pro-

с ионизацией электрораспылением, прямым вво-

DOPA 42%, Ol-Gly-[³H]Pro-Srt 41%.

дом раствора образца с концентрацией 10 мкг/мл

Синтез Z-Gly-[³H]Pro-Dox, Z-Gly-[³H]Pro-

в 0.1%-ной уксусной кислоте и дальнейшей фраг-

Srt, Z-Gly-[³H]Pro-DOPA. К раствору 2.5 мг

ментацией молекулярного иона в анализаторе ме-

(8.2 мкмоль) Z-Gly-[³H]Pro и 1.2 мг (10 мкмоль)

тодом ионных соударений при 35 эВ.

N-оксисукцинимида в 0.5 мл сухого диоксана до-

в. К раствору OlCl (5 мкмоль) в 0.1 мл хлорофор-

бавляли 2.3 мг (11 мкмоль) ДЦГК и перемешивали

ма прибавляли 52 мКи (2 мкмоль) [³Н]Gly-ProО-

7 ч при 23°С. Затем растворитель упаривали. Оса-

Ме. Через 2 ч реакционную смесь обрабатывали

док растворяли в 1.5 мл этанола.

метанолом и лиофилизировали. К раствору Ol-

К 0.5 мл этанольного раствора прибавляли

[³Н]Gly-ProОСН₃ в 0.5 мл метанола при переме-

15 мкл триэтиламина и 10 ммоль дофамина, док-

шивании прибавляли 0.5 мл 2 н. NaОН. Через 7 ч

сорубицина или серотонина. Растворы переме-

раствор подкисляли 1 н. HCl и упаривали. Остаток

шивали при комнатной температуре 15 ч. Со-

растворяли в 3 мл этилацетата и промывали водой

единения очищали, как описано выше. Выход

до нейтрального рН. Выход Ol-[³Н]Gly-Pro 90%.

Z-Gly-[³H]Pro-DOPA 55%, Z-Gly-[³H]Pro-Srt 65%,

Синтез Ol-[³H]Gly-Pro-Srt, Ol-[³H]Gly-Pro-

Z-Gly-[³H]Pro-Dox 46%.

DOPA. а. При перемешивании к раствору 13 мк-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

моль Ol-[³H]Gly-Pro в 0.5 мл диоксана при комнат-

ной температуре прибавляли 2.3 мг (20 мкмоль)

Для введения трития в пептидные производные

N-оксисукцинимида и 4 мг (19 мкмоль) ДЦГК.

дофамина, серотонина и доксорубицина, которые

Через 7 ч растворитель упаривали, остаток раство-

содержат фрагменты, нестабильные в условиях

ряли в 1 мл этанола.

гидрирования, метку необходимо заблаговременно

К этанольному раствору (0.5 мл) прибавляли

вводить в аминокислоту с последующим встраива-

30 мкл Et₃N и 2.5 мг (13 мкмоль) DOPA. Пере-

нием ее в соединение. В пролин изотоп водорода

мешивание продолжали 16 ч. Этанол упаривали.

можно ввести гидрированием ΔPro [7], а в Gly -

изотопным обменом [9].

Хроматографическое выделение проводили на ко-

лонке Kromasil 100C18 (8×150 мм, размер частиц

При использовании

[³Н]Pro, полученного

7 мкм). Элюент А - метанол-вода-AcOH-TFA

из ΔPro, его конденсировали с Z-GlyOSu или с

(50 : 50 : 0.1 : 0.01); элюент В - метанол; линей-

Ol-GlyOSu. Z-GlyOSu синтезировали обработкой

ный градиент от 0 до 100% В за 30 мин, затем

Z-Gly N-оксисукцинимидом и ДЦГК. Для син-

100% B в течение 5 мин. Скорость подачи элюен-

теза Ol-GlyOSu сначала ненасыщенную жирную

та 2 мл/мин, детектор по радиоактивности. Выход

кислоту превращали в хлорангидрид, который

Ol-[³H]Gly-Pro-DOPA 45%, время удерживания

обрабатывали GlyОМе. Метиловый эфир уда-

30.5 мин.

ляли омылением Ol-GlyОМе. Образовавшийся

РАДИОХИМИЯ том 62 № 4 2020

348

ШЕВЧЕНКО и др.

Ol-Gly превращали в Ol-GlyOSu, который затем

зидиума РАН «Инновационные разработки в био-

обрабатывали [³Н]Pro. По той же методике Z-Gly-

медицине» и «Постгеномные технологии и пер-

[³Н]Pro и Ol-Gly[³Н]Pro превращали в Z-Gly-[³Н]·

спективные решения в биомедицине».

ProOSu и Ol-Gly[³Н]ProOSu. При использовании

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

этих реагентов искомые соединения получали кон-

денсацией с DOPA, доксорубицином и Srt. Недо-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

статком такой методики является необходимость

интересов.

проведения большого количества стадий с мече-

ными предшественниками.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

В результате проведенной работы получены

Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф. //

Z-Gly-Pro-DOPA, Z-Gly-Pro-Srt, Z-Gly-Pro-Dox,

Радиохимия. 1999. Т. 41, № 4. C. 289.

Ol-Gly-Pro-DOPA, Ol-Gly-Pro-Srt, содержащие

Coombs M.E., Kingston L.P., Lockley W.J.S.,

тритий в пролине. Молярная радиоактивность та-

Mather A.N., Wilkinson D.J. //Seventh Int. Symp. «The

ких препаратов 35-40 Ки/ммоль.

Synthesis and Applications of Isotopically Labelled

Получение соединений, меченных по глицину,

Compounds«: Abstracts., Dresden, Germany, 2000,

является более сложной задачей. С использовани-

P. 147.

ем [³H]Gly нельзя получить перечисленные выше

Gibbs A.R., Morimoto H., VanBrocklin H.F., Willi-

вещества с Z-защитой. Возможно лишь получение

ams Ph.G., Biegon A. // J. Label. Compd. Radiopharm.

соединений с ненасыщенными жирными кислота-

2002. Vol. 45, N 5. P. 395.

ми. Для этого необходимо предварительно изгото-

вить OlOSu. Затем провести реакцию с [³H]Gly.

Shevchenko V.P., Nagaev I.Yu., Myasoedov N.F.,

К сожалению, данная реакция проходит с низ-

Susan A.B., Switek K-H., Braunger H. // J. Label.

ким выходом. Более высокий выход удалось по-

Compd. Radiopharm. 2006. Vol. 49, N 5. P. 421.

лучить, конденсируя OlCl с [³Н]Gly-ProОМе. Но

Шевченко К.В., Андреева Л.А., Нагаев И.Ю., Шев-

для реализации этого подхода необходимо сначала

ченко В.П., Мясоедов Н.Ф. // Биомед. хим. 2019. Т. 65,

синтезировать Boc-[³H]Gly, затем сконденсировать

№ 6. С. 498

его с ProОМе и снять Вос-защиту. Удалить метиль-

Шевченко В.П., Андреева Л.А., Нагаев И.Ю., Мясое-

ную группу с пролина оказалось намного труднее,

дов Н.Ф. // Докл. АН. 2019. Т. 485, № 2. С. 182.

чем с глицина. Следующие стадии проводили ана-

логично синтезам пептидных производных дофа-

Шевченко В.П., Андреева Л.А., Нагаев И.Ю., Мясое-

мина и серотонина. Молярная радиоактивность

дов Н.Ф. // Докл. АН. 2019. Т. 487, № 1. С. 41.

препаратов 26 Ки/ммоль.

Гершкович А.А., Кибирев В.К. Химический синтез

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

пептидов. Киев: Наук. думка, 1992. 360 с.

Работа проведена при частичной поддержке

Шевченко В.П., Андреева Л.А., Нагаев И.Ю., Мясое-

Программ фундаментальных исследований Пре-

дов Н.Ф. // Докл. АН. 2018. Т. 483, № 2. С. 159.

РАДИОХИМИЯ том 62 № 4 2020