РАДИОХИМИЯ, 2021, том 63, № 2, с. 185-192

УДК 544.722.22+546.11.027*3

МЕТОД ТРИТИЕВОГО ЗОНДА В ИССЛЕДОВАНИИ

АДСОРБЦИОННЫХ СЛОЕВ ЛИЗОЦИМА

НА ПОВЕРХНОСТИ ДЕТОНАЦИОННЫХ

НАНОАЛМАЗОВ

А. Г. Попов^а, А. Л. Ксенофонтов^b

^а Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,

119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3

^б Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета

им. М.В. Ломоносова, 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40

*e-mail: chernysheva@radio.chem.msu.ru

Получена 10.10.2019, после доработки 06.11.2019, принята к публикации 13.11.2019

С помощью меченного тритием лизоцима определена его адсорбция на поверхности наноалмазов

детонационного синтеза. Обнаружено, что количество адсорбированного белка зависит от заряда

поверхности наноалмазов. На исходных положительно заряженных наноалмазах образуется монослойное

покрытие, а на отрицательно заряженных наноалмазах, полученных из исходных в результате отжига

на воздухе, адсорбция возрастала в 4-5 раз. По данным ИК спектрометрии, в результате адсорбции

лизоцима уменьшается количество петель и поворотов в структуре белка при адсорбции на двух типах

наноалмазов. С помощью тритиевого зонда не обнаружено существенной разницы в структуре молекулы

белка при адсорбции на наноалмазах с разным функциональным составом поверхности, и ориентация

молекул в поверхностном слое оказалась одинаковой: участки белка, содержащие аминокислотные

остатки фенилаланина, контактируют с сорбентом, а аминокислотные остатки пролина, входящие в

состав петель, находятся на поверхности адсорбционного слоя.

Ключевые слова: тритиевый зонд, лизоцим, наноалмазы, адсорбция.

DOI: 10.31857/S0033831121020118

ВВЕДЕНИЕ

В качестве твердой подложки использовали

наноалмазы детонационного синтеза (ДНА). От-

Обработка атомарным тритием органических

метим, что в настоящее время ДНА активно ис-

мишеней сложного состава с последующим ана-

пользуются в научных исследованиях, поскольку

лизом распределения трития по компонентам ми-

их уникальные свойства, такие как наличие ал-

шени является информативным методом для опре-

мазного ядра размером 4-6 нм и высокая удельная

деления структуры белковой оболочки вирусов

поверхность с большим количеством различных

[1, 2], структурной организации молекул в адсор-

функциональных групп, открывают перспективы

бционных слоях на границе раздела водный рас-

использования этого материала в различных сфе-

твор-воздух [3, 4]. В данной работе такой подход

рах, включая косметологию и медицину [5-9]. По-

впервые применен для анализа структуры белка в

этому изучение взаимодействия белков с наноал-

адсорбционном слое, образовавшемся на межфаз-

мазами и строения образующихся адсорбционных

ной границе водный раствор-твердое тело.

слоев является актуальной научной задачей. Обра-

185

186

ЧЕРНЫШЕВА и др.

зование белковой «короны» на поверхности ДНА

Таким образом, несмотря на интерес к ДНА и,

определяется рядом факторов, такими как набор

в частности, к его биологическому применению,

функциональных групп на поверхности, размер

ряд вопросов, касающихся взаимодействия ДНА с

белками, до сих пор неясен. В работе использова-

частиц ДНА в суспензии, их поверхностный заряд,

ли лизоцим куриного яйца, поскольку данный бе-

заряд белковой глобулы, а также pH и ионная сила

лок мало подвержен денатурации при адсорбции

среды. В ряде работ показано, что образование ад-

[13, 14] и хорошо изучен, в том числе с помощью

сорбционных комплексов между белком и поверх-

тритиевого зонда, в составе адсорбционных слоев,

ностью ДНА в случаях одноименно заряженных

образованных на границе раздела фаз водный рас-

сорбента и сорбата, а также для случая нейтрально

твор-воздух [3, 4, 15]. Белок в водных растворах

заряженного ДНА происходит преимущественно

при нейтральных значениях pH имеет положитель-

за счет гидрофобных взаимодействий [10, 11]. На-

ный заряд. Целью настоящего исследования было

ряду с этим существуют работы, в которых сказа-

выявить влияние поверхностного заряда алмазных

но об электростатическом механизме образования

наночастиц на адсорбцию лизоцима и специфику

адсорбционного комплекса белок-наноалмаз [12,

организации получаемых адсорбционных слоев.

13].

Таблица 1. Характеристики наноалмазов

Основные полосы в

Отнесение ИК полос,

Удельная поверх-

ζ-Потенциал

Наноалмаз

ИК спектре

по данным работы

ность по БЭТ, м²/г

в воде, мВ

[19]

Широкая полоса 3400

ОН-группы воды

2800-2900

СН₂- и СН₃-группы

Aldrich

280

1730

С=О карбонил

37 ± 5

1630

Вода

1100

С-О-С

Широкая полоса 3400

ОН-группы воды

2800-2900

СН₂- и СН₃-группы

1795 слабый сигнал

С=О лактон

1723

С=О карбонил

1631

Вода

PlasmaChem

250

1452

СН_х асимметриче-

21 ± 3

1319

ские

1117

С=О депротониро-

1063

ванный карбоксил

С-О-С

С-О гидроксил

Широкая полоса 3400

ОН-группы воды

2800-2900

СН₂- и СН₃-группы

1723

С=О карбонил

AdamasNano

270

1631

Вода

27 ± 3

1319

С=О депротониро-

1117

ванный карбоксил

С-О-С

Широкая полоса 3400

ОН-группы воды

2800-2900

СН₂- и СН₃-группы

Aldrich подвер-

1790

С=О лактон

гнутые отжигу

280

1630 слабый сигнал

Вода

-46 ± 4

на воздухе

1269

С-О эфир,

1112

эпоксигруппа

С-О-С

РАДИОХИМИЯ том 63 № 2 2021

МЕТОД ТРИТИЕВОГО ЗОНДА

187

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ризовали с помощью метода динамического све-

торассеяния и определяли распределение частиц

по размеру и распределение электрокинетического

В работе использовали лизоцим куриного яйца

потенциала.

(MP Biomedicals). Тритиевую метку в лизоцим для

Адсорбция лизоцима на наноалмазах. K су-

исследования его адсорбции на наноалмазах вво-

спензии ДНА, содержащей 1 мг твердой фазы, до-

дили с помощью метода термической активации

бавляли раствор меченного тритием лизоцима до

трития [16]. Для удаления трития из лабильных

конечной удельной радиоактивности 1.5 мКи/л и

положений молекулы использовали диализ через

концентрации от 0.4 до 4 г/л раствора. Суспензии

мембраны с диаметром пор 12 кДа против фосфат-

инкубировали в течение 48 ч, затем осаждали цен-

ного буферного раствора (0.018 М, pH 7.3 ± 0.1).

трифугированием и измеряли активность надосад-

[³H]Лизоцим выделяли методом эксклюзионной

чного раствора. Осадок декантировали, промывали

хроматографии с использованием ВЭЖХ систе-

водой, суспендировали в сцинтилляционной жид-

мы Waters (Breeze) на колонке Suerdex200 Increase

кости Ultima Gold (Perkin Elmer) и измеряли актив-

10/300 GL (GE Healthcare), в качестве подвиж-

ность [17, 18]. Значения равновесной концентрации

ной фазы использовали фосфатно-солевой буфер

лизоцима и его количество на ДНА рассчитывали

(рН 7.3 ± 0.1). Детектирование проводили по УФ

по уравнениям (1) и (2) соответственно:

поглощению при длине волны 280 нм, радиоактив-

ность элюата измеряли с помощью жидкостного

(1)

сцинтилляционного спектрометра RackBeta 1215.

Очищенный [³H]лизоцим обладал удельной радио-

активностью 1 Ки/г.

(2)

Порошки наноалмазов производства компа-

ний Aldrich, PlasmaChem (Германия), AdamasNano

где I₁ и I₂ - скорость счета надосадочного раствора

(США) использовали как без дополнительной об-

и осадка ДНА соответственно, V - объем аликвоты

работки, так и после отжига на воздухе при 450°С

надосадочного раствора, ε - эффективность реги-

в течение 1 ч [17]. Наноалмазы характеризовали с

страции β-излучения трития, а_уд - молярная радио-

помощью просвечивающей электронной микроско-

активность лизоцима, m_ДНА - масса наноалмаза.

пии и ИК спектрометрии, удельную поверхность

Определение структуры лизоцима на поверх-

определяли методом низкотемпературной адсорб-

ности наноалмаза. По описанной выше методике

ции азота. Методики характеризации нанаолмазов

получали адсорбционные комплексы ДНА-лизо-

были описаны ранее [17, 18]. Основные характери-

цим, которые затем суспензировали в воде, наноси-

стики использованных наноалмазов приведены в

ли на стенки реакционного сосуда, замораживали

табл. 1.

жидким азотом и высушивали с помощью лиофи-

Порошки ДНА супензировали в воде по разра-

лизации. Сосуд с готовой мишенью присоединя-

ботанной ранее методике [18]. Суспензии характе-

ли к системе для работы с газообразным тритием,

Таблица 2. Значения параметров адсорбции в уравнении, аналогичном уравнению Ленгмюра, для необратимой ад-

сорбции лизоцима на наноалмазах

Максимальная адсорбция

Константа адсорбции в уравнении

Наноалмаз

R²

(Г_max), мг/г

Ленгмюра (A), л/г

Aldrich

452 ± 54

1.0 ± 0.4

0.934

PlasmaChem

321 ± 26

0.4 ± 0.1

0.981

AdamasNano

364 ± 32

0.4 ± 0.1

0.974

Aldrich, подвергнутые

2060 ± 109

0.8 ± 0.1

0.992

отжигу на воздухе

РАДИОХИМИЯ том 63 № 2 2021

188

ЧЕРНЫШЕВА и др.

раствора или с помощью спектрофотомерии оказа-

1600

лось невозможным. Поэтому в работе определяли

1400

только связывание лизоцима с ДНА, который не

удаляется при промывке осадка водой в течение

1200

1-2 ч. Данные представлены на рис. 1.

1000

Зависимости удельного содержания лизоцима в

комплексе с ДНА от его объемной концентрации

800

были описаны уравнением, аналогичным уравне-

600

нию Ленгмюра:

400

max

200

Здесь с - концентрация вещества в растворе, Г и

Г_max - адсорбция при концентрации с и максималь-

ная адсорбция соответственно, А - константа.

[лизоцим] (г/л)

Рассчитанные параметры приведены в табл. 2, а

Рис.

1. Зависимость удельного содержания лизоцима

результат аппроксимации показан сплошной лини-

в комплексе с ДНА от его равновесной концентрации в

ей на рис. 1.

водном растворе. Наноалмазы Aldrich (1), PlasmaChem

(2), AdamasNano (3) и Aldrich, подвергнутые отжигу на

Для всех исходных наноалмазов адсорбция лизо-

воздухе (4).

цима была близка, однако после отжига на воздухе

у ДНА Aldrich изменялся электрокинетический по-

вакуумировали и обрабатывали атомами трития в

тенциал в воде с положительного на отрицательный

следующих условиях: температура стенок реактора

(табл. 1), что увеличивало адсорбцию лизоцима в

25°С, температура атомизатора 1850 K, время об-

4.5 раза.

работки 10 с, давление трития 1 Па [16, 20]. После

реакции мишень суспендировали в воде, выдержи-

Для оценки величины удельного покрытия ча-

вали несколько часов и воду отгоняли на роторном

стиц наноалмаза белком надо принимать во вни-

испарителе для удаления обменного трития. Затем

мание структуру агломератов, существующих в

твердую фазу суспендировали в гидролизной сме-

водном растворе [22]. По данным метода динами-

си, состоящей из смеси соляной и трифторуксусной

ческого светорассеяния, в водном растворе сред-

кислот в объемном соотношении 2 : 1 и содержа-

ний диаметр наночастиц составляет 150 ± 30 нм,

щей 0.001% β-меркаптоэтанола. Полученную смесь

и они состоят из алмазных зерен диаметром 5 нм.

переносили в стеклянную ампулу, запаивали и на-

По данным БЭТ, средний диаметр пор исходного

гревали до 155°C в течение 1 ч. Отделяли раствор

наноалмаза Aldrich составляет 10 нм, а отожженно-

от осадка, дважды лиофилизовывали, а лиофилизат

го - 11 нм, так как отжиг приводит к деагломера-

растворяли в 0.1 н. HCl. Аминокислотный анализ

ции наноалмазов [23]. Для двух типов наноалмаза

проводили на анализаторе Amino Acid Analyzer

основная часть пор имеет диаметр более 20 нм и

Hitachi L-8800 с определением количества амино-

доступна для адсорбции лизоцима, размер глобу-

кислот [21] и их активности с помощью проточ-

лы которого 3×3×4.5 нм. Известно, что при плот-

ного счетчика Radiomatic 150TR Flow Scintillation

ной упаковке и вертикальной ориентации молекул

Analyzer (Packard Instrument Co., США).

(большая ось молекулы перпендикулярна поверх-

ности) лизоцим занимает на поверхности 9.0 нм²,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

а при горизонтальной ориентации - 13.5 нм² [24].

Тогда удельное покрытие поверхности при мак-

Меченный тритием лизоцим использовали для

симальной адсорбции на исходном наноалмазе

получения изотерм адсорбции белка на поверхности

450 мг/г составит 1.5 мг/м², и на одну молекулу бу-

наноалмазов. Отметим, что адсорбция лизоцима на

дет приходиться 16 нм². Можно предположить, что

ДНА, не подвергнутых окислению, мало изменяла

при адсорбции лизоцима на исходных ДНА обра-

концентрацию белка в растворе, и ее определение с

зуется адсорбционный слой с плотной упаковкой и

приемлемой точностью по изменению активности

ориентацией молекул параллельно поверхности.

РАДИОХИМИЯ том 63 № 2 2021

МЕТОД ТРИТИЕВОГО ЗОНДА

189

(а)

(б)

(в)

(г)

Рис. 2. ПЭМ изображения наноалмазов и комплексов наноалмаз-лизоцим. (a) наноалмаз (Aldrich); (б) наноалмаз (Aldrich)

подвергнутый отжигу; (в) ДНА-лизоцим; (г) ДНА (отожженный)-лизоцим.

На отожженном наноалмазе Aldrich при макси-

Изменения структуры лизоцима при его адсорб-

мальной адсорбции 2060 мг/г удельное покрытие

ции на поверхности наноамазов можно оценить из

достигает 7.1 мг/м², что соответствует образова-

ИК спектра (рис. 3).

нию полислоев. Действительно, «корона» белка на

Полосы в ИК спектрах при 1662 и 1527 см^-1

отожженном на воздухе наноалмазе обнаружена с

соответствуют колебаниям связей амид I и амид

помощью просвечивающей электронной микро-

II соответственно [25-27]. Полоса при 1662 см^-1

скопии (рис. 2).

чувствительна к изменениям вторичной структуры,

РАДИОХИМИЯ том 63 № 2 2021

190

ЧЕРНЫШЕВА и др.

Лизоцим

а-спирали

β-складки

петли

1662

1527

1500

1600

1640

1680

1720

1740

Волновое число, см^-1

3060

Лизоцим на

1804

наноалмазах

1787

1560

1600

1640

1660

1700

Волновое число, см^-1

Лизоцим на

отожженных

наноалмазах

1737

1797

1598

3500

3000

2500

2000

1500

Волновое число, см^-1

1560

1600

1640

1660

1700

Волновое число, см^-1

Рис. 3. ИК-спектры лизоцима (1) и его адсорбционных комплексов с наноалмазами: (2) лизоцим - отожженный наноалмаз,

(3) отожженный наноалмаз, (4) лизоцим - наноалмаз, (5) наноалмаз. Справа приведено разложение полосы при 1662 см^-1 на

компоненты, отвечающие определенным структурным элементам белка.

поэтому этот сигнал можно разложить на компо-

алмаза оказалось сходным, что позволяет пред-

ненты, отвечающие тем или иным структурным

положить отсутствие принципиальной разницы в

элементам белка [26, 28]. Наши результаты сви-

структурной организации адсорбционных слоев.

детельствуют об изменениях в структуре белка,

Информацию об ориентации молекулы относи-

когда он адсорбируется как на положительных,

тельно поверхности можно получить, анализируя

так и на отрицательных ДНА: адсорбция на обоих

отношение молярных активностей фенилалани-

типах поверхностей приводит к изменению кон-

на и пролина, которые располагаются на разных

формации петель. Кроме того, сдвиг полосы при

участках глобулы [рис. 4, (б)] [15]. Для поверх-

1804 см^-1 отожженных ДНА до 1787 см^--1 после

ностей обоих типов удельная активность фенила-

адсорбции лизоцима указывает на взаимодействие

ланина была пренебрежимо мала по сравнению с

поверхностных карбоксильных групп с положи-

активностью пролина. Аминокислотные остатки

тельно заряженными сайтами белка.

пролина входят в состав петель, структура кото-

Для определения ориентации белка на поверх-

рых из данных, полученных методом ИК спек-

ности наноалмазов адсорбционные комплексы ли-

трометрии, меняется при адсорбции на алмазной

зоцим-наноалмаз и лизоцим-отожженный наноал-

поверхности (рис. 4). Можно предположить, что

маз подвергли обработке атомами трития и провели

молекулы белка взаимодействуют с наноалмазами

анализ распределения трития по аминокислотам

участками, содержащими фенилаланин, а амино-

после тотального гидролиза белка (рис. 4).

кислотные остатки пролина, входящие в состав

Распределение трития по типам аминокислот-

петель, остаются на поверхности адсорбционного

ных остатков для исходного и отожженного нано-

слоя.

РАДИОХИМИЯ том 63 № 2 2021

МЕТОД ТРИТИЕВОГО ЗОНДА

191

(а)

(б)

Pro

Phe

Рис. 4. Распределение радиоактивности трития, нормированное на радиоактивность белка, в аминокислотных остатках

лизоцима при реакции с адсорбционными комплексами лизоцима на исходном (1) и отожженном (2) наноалмазах (а).

Структура лизоцима (PDB 6LYZ), в которой выделены аминокислотные остатки фенилаланина (Phe) и пролина (Pro), а

также черным цветом отмечены петли (б).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

низмах и откроет новые перспективы их приме-

нения в медицине.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование с применением меченных три-

тием соединений как радиоактивных индика-

Работа выполнена при финансовой поддержке

торов с целью определения состава комплекса

Российского фонда фундаментальных исследова-

лизоцим-ДНА и с обработкой атомным тритием

ний (грант № 17-03-00985-а, 18-33-20147-мол-а-

комплексов с целью получения информации об

вед).

их структурной организации показало, что устой-

чивый комплекс лизоцим-ДНА образуется даже

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

на положительно заряженных частицах ДНА.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

При этом происходит образование плотного ад-

интересов.

сорбционного слоя, заполняющего как внешнюю

поверхность, так и внутренние поры частиц.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

При использовании отожженных на воздухе ча-

стиц ДНА связывание лизоцима увеличивалось

1. Nemykh M.A. et al. // Virology. 2008. Vol. 373, N 1.

до образования полислоев белка на поверхно-

P. 61-71.

сти частиц. Вместе с тем расположение молекул

2. Ksenofontov A.L. et al. // PLoS One 2019. Vol. 14, N 5.

лизоцима в слое не зависело от заряда частиц с

P. e0216905.

преимущественной ориентацией каталитическим

3. Chernysheva M.G. et al.

// Colloids Surf. A:

центром фермента наружу. Полученный резуль-

Physicochem. Eng. Asp. 2018. Vol. 537. P. 351-360.

тат стимулирует изучение ферментативной ак-

4. Lukashina E.V., Badun G.A., Chulichkov A.L. // Biomol.

тивности лизоцима в составе рассматриваемого

Eng. 2007. Vol. 24, N 1 Spec. issue. P. 125-129.

комплекса, что поможет выявить некоторые осо-

5. Schrand A.M. et al. // J. Phys. Chem. B. 2007. Vol. 111,

бенности поведения наночастиц в живых орга-

N 1. P. 2-7.

РАДИОХИМИЯ том 63 № 2 2021

192

ЧЕРНЫШЕВА и др.

6. Wehling J. et al. // ACS Nano. 2014. Vol. 8, N 6.

18. Chernysheva M.G., Myasnikov I.Y., Badun G.A. //

P. 6475-6483.

Diam. Relat. Mater. 2015. Vol. 55. P. 45-51.

7. Schrand A.M., Hens S.A.C.C., Shenderova O.A. // Crit.

19. Petit T., Puskar L. // Diam. Relat. Mater. 2018. Vol. 89.

Rev. Solid State Mater. Sci. 2009. Vol. 34, N 1-2.

P. 52-66.

P. 18-74.

20. Badun G.A. et al. // Radiochim. Acta. 2014. Vol. 102,

8. Долматов В.Ю. и др. // ФТТ. 2004. Т. 46, № 4.

N 10. P. 941-946.

С. 596-600.

21. Лукашина Е.В. и др. // Радиохимия. 2002. Т. 44, № 1.

9. Яковлев Р.Ю. и др. // Рос. хим. журн. 2012. Т. 56, №

С. 78-82.

3-4. С. 114-125.

22. Wang H.-D. et al. // Nanotechnology. 2011. Vol. 22,

10. Wang H.D. et al. // Nanotechnology. 2011. Vol. 22,

N 14. P. 145703.

23. Dideikin A.T. et al.

// Carbon.

2017. Vol. 122.

11. Eldawud R. et al. // Nanotechnology. 2016. Vol. 27,

P. 37-745.

N 8. P. 085107.

24. Lu J.R., Su T.J., Howlin B.J. // J. Phys. Chem. B. 1999.

12. Huang L.-C.L.C.L., Chang H.-C.C. // Langmuir. 2004.

Vol. 103, N 28. P. 5903-5909.

Vol. 20, N 14. P. 5879-5884.

25. Boyaci I.H. et al. // RSC Adv. 2015. Vol. 5, N 70.

13. Aramesh M. et al. // Nanoscale. 2015. Vol. 7, N 13.

P. 56606-56624.

P. 5726-5736.

26. Miller L.M., Bourassa M.W., Smith R.J. // // Biochim.

14. Nepal D., Geckeler K.E. // Small. 2006. Vol. 2, N 3.

Biophys. Acta - Biomembr. Elsevier B.V.,

2013.

P. 406-412.

Vol. 1828, N 10. P. 2339-2346.

15. Chernysheva M.G. et al.

// Colloids Surf. A:

Physicochem. Eng. Asp. 2017. Vol. 520. P. 1-8.

27. Yeung P.S.W., Eskici G., Axelsen P.H. // Biochim.

Biophys. Acta-Biomembr.

2013. Vol. 1828, N 10.

16. Badun G.A., Chernysheva M.G., Ksenofontov A.L. //

Radiochim. Acta. 2012. Vol. 100, N 6. P. 401-408.

P. 2314-2318.

17. Chernysheva M.G. et al.

// Colloids Surf. A:

28. Kretlow A. et al. // Biochim. Biophys. Acta-Biomembr.

Physicochem. Eng. Asp. 2019. Vol. 565. P. 25-29.

2006. Vol. 1758, N 7. P. 948-959.

РАДИОХИМИЯ том 63 № 2 2021