РАДИОХИМИЯ, 2021, том 63, № 4, с. 395-400

УДК 547.995.15+546.11.027*3

ПОЛУЧЕНИЕ МЕЧЕННОЙ ТРИТИЕМ

ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ МЕТОДОМ

ТЕРМИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ ТРИТИЯ

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3

*e-mail: badunga@yandex.ru

Получена 28.03.2020, после доработки 28.03.2020, принята к публикации 15.04.2020

Показана принципиальная возможность получения меченной тритием гиалуроновой кислоты с помо-

щью метода термической активации. Рассматривается влияние условий подготовки препаратов и про-

ведения реакции изотопного обмена на удельную активность меченого продукта и равномерность рас-

пределения трития по молекулам с разной молекулярной массой. Показано, что при мягких условиях

проведения эксперимента и двойной диализной очистке препаратов (перед и после введения трития)

удается получить меченную тритием гиалуроновую кислоту с удельной активностью 26-52 ГБк/г без

существенного изменения молекулярно-массового распределения.

Ключевые слова: тритий, гиалуроновая кислота, метод термической активации трития, меченые сое-

динения

DOI: 10.31857/S0033831121040122

Гиалуроновая кислота (ГК) - природный био-

ГК можно определять спектрофотометрически

полимер, состоящий из остатков D-глюкуроновой

в комплексе с энзимом по модифицированному

кислоты и D-N-ацетилглюкозамина, соединенных

методу Моргана-Эльсона [6], однако этот подход

поочередно β-1,4- и β-1,3-гликозидными связями.

сильно осложняется для окрашенных образцов и в

присутствии веществ, обладающих схожими с ГК

ГК применяется в косметологии и регенеративной

химическими свойствами. Для определения ГК в

медицине [1], обладает высоким сродством к био-

сложных объектах, включая живые системы, можно

логическим тканям, в которых содержится в значи-

использовать радиоактивные индикаторы в составе

тельном количестве [2]. Обнаружено, что ГК также

лигандов, образующих комплекс с ГК [7]. Известно

обладает высоким сродством к рецепторам CD44,

о введении трития в ГК методом Вильцбаха, одна-

которые переэкспрессируются клетками некоторых

ко при этом образуется большой набор меченных

видов рака и локализуются на их поверхности [3, 4].

тритием олигомеров, отличающийся по составу от

Известно о модификации поверхности углеродных

исходного препарата [8].

наноматериалов гиалуроновой кислотой. Частицы

Для введения радиоактивной метки непосред-

углерода луковичной структуры, нековалентно мо-

ственно в ГК видится перспективным метод терми-

дифицированные ГК, лучше захватывались рако-

ческой активации трития [9]. При использовании

выми клетками [5]. Таким образом, с помощью ГК

мягких условий проведения реакции удается полу-

возможно улучшить средства доставки лекарствен-

чить меченные тритием биополимеры и природные

ных препаратов или диагностических средств для

смеси сложного неопределенного состава без изме-

терапии или диагностики рака на основе углерод-

нения их физико-химических свойств [10]. С помо-

ных наноматериалов.

щью этого метода успешно вводили тритий в саха-

395

396

СИНОЛИЦ и др.

ра и соединения на их основе [11, 12]. С помощью

Для введения трития в препараты гиалуроновой

данного метода удалось получить меченный трити-

кислоты в реакционный сосуд вносили раствор, со-

ем хитозан (М_w 210 кДа) с удельной активностью

держащий 1 мг ГК, равномерно распределяли его

9.5 ТБк/ммоль [13], что позволило использовать

по внутренней поверхности, быстро замораживали

его для количественного определения связывания с

при охлаждении жидким азотом и удаляли воду ли-

коллагеновыми матрицами и следить за сохранно-

офилизацией. Продолжительность лиофилизации

стью получаемых покрытий в экспериментах как in

изменяли в пределах от 30 до 75 мин. Далее сосуд с

vitro, так и in vivo [14].

пленкой вещества на внутренней поверхности под-

соединяли к установке для работы с газообразным

При разработке методик введения трития в ГК

тритием и удаляли воздух до остаточного давления

с помощью метода термической активации трития

0.005 Па в течение 30-60 мин при комнатной тем-

необходимо учитывать свойства этого соединения.

пературе стенок сосуда, а также при нагревании в

ГК очень хорошо растворима в воде, при высокой

водяном термостате до 80°С. Затем стенки реакци-

концентрации сильно повышает вязкость. Вода

онного сосуда охлаждали жидким азотом, заполня-

прочно удерживается молекулами ГК, поэтому пол-

ли сосуд газообразным тритием до давления 0.5 Па

ное удаление воды при высушивании практически

и инициировали реакцию изотопного обмена нагре-

невозможно и может влиять на результат взаимо-

ванием вольфрамовой проволоки электрическим

действия препаратов ГК с атомами трития при про-

током до температуры 1730-1960 K.

ведении реакции изотопного замещения водорода.

Меченное тритием вещество смывали со стенок

Известно, что ГК при длительном хранении в во-

реактора 4 мл воды. После выдерживания не менее

дных растворах способна уменьшать молекуляр-

1 сут раствор упаривали досуха на роторном испа-

ную массу за счет гидролиза гликозидных связей.

рителе. На всех стадиях работы определяли ради-

Этот процесс ускоряется при повышении темпера-

оактивность растворов с помощью жидкостного

туры выше 60°C, в присутствии сильных кислот и

сцинтилляционного спектрометра RackBeta 1215.

под действием ультразвука [15, 16]. Препараты ГК

Для дополнительной очистки от лабильной метки

получают из различных природных источников, и

и низкомолекулярных продуктов реакции использо-

они отличаются не только средней молекулярной

вали диализ через мембрану Serva MWCO 12 кДа

массой, но и стабилизирующими компонентами,

и с помощью диализной системы Float-A-Lyzer G2

которые также будут вступать в реакцию с атомами

(Spectra/Por) с мембраной MWCO 8-10 кДа против

трития. Цель данной работы заключалась в опреде-

дистиллированной воды при температуре 4°C в те-

лении условий получения меченной тритием ГК с

чение 7 сут.

помощью метода термической активации трития.

Для определения молекулярно-массового соста-

ва препаратов ГК и распределения трития по компо-

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

нентам проводили гель-проникающую хроматогра-

фию на хроматографе Waters с УФ детектором. Ана-

В работе использовали ГК в форме натриевых со-

лиз проводили с использованием хроматографиче-

лей производства Lifecore (препараты с средней мо-

ской колонки Ultrahydrogel 1000 размером 300 ×

лекулярной массой (M_w) 100 и 200 кДа), Aromashka

7.8 мм, заполненной гелем на основе гидроксилат-

(препарат M_w 350 кДа).

полиметакрилата с размером пор 1000 Å (Waters).

Для подготовки препаратов к введению трития в

В качестве подвижной фазы использовали фос-

первой серии экспериментов их растворяли в воде

фатный буфер состава K₂HPO₄ 6.303 г/л, KH₂PO₄

и использовали без дополнительной очистки. Для

0.513 г/л (рН 7.7 ± 0.1). Регистрацию компонентов

повышения эффективности введения трития во вто-

ГК в элюате проводили с помощью УФ детектора

рой серии экспериментов препараты подвергали

при длине волны 210 нм. Фракции элюата собирали

предварительной очистке с помощью диализа от 21

и измеряли их радиоактивность.

до 28 сут через мембрану MWCO 8-10 кДа Float-

Особенности подготовки препаратов ГК к вве-

A-Lyzer G2 (Spectra/Por) против дистиллированной

дению трития и условия их очистки приведены в

воды при температуре 4°C.

табл. 1. Удельную активность очищенных препа-

РАДИОХИМИЯ том 63 № 4 2021

ПОЛУЧЕНИЕ МЕЧЕННОЙ ТРИТИЕМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

397

Таблица 1. Подготовка препаратов ГК к введению трития и условия их очистки

Параметры введения трития и активность [³H]гиалуроновой кислоты

варьируемые параметры подготовки

изменение активности

препаратов и проведения реакции изо-

препарата при очистке,

топного обмена

A_i/A₀

номер

M_w,

удельная активность

препарата

кДа

препарата^а, ГБк/г

100

1850

350

1850

16%

100

1850

28%

21%

350

1850

39%

31%

200

1960

40%

22%

7 (65^б)

200

1850

40%

16%

200

1730

53%

27%

^аУдельная активность нормирована на исходное содержание трития в газе.

^бВ составе низкомолекулярных фракций препарата.

ратов рассчитывали для основного пика профиля

паратов ГК. Поэтому на первом этапе работы иссле-

радиоактивности. Так как при введении трития в

довали влияние продолжительности лиофильной

ГК использовали протий-тритиевые смеси с содер-

сушки (остаточное давление около 1 Па) и последу-

жанием трития от 20 до 80%, удельную активность

ющего вакуумирования с помощью диффузионного

нормировали на исходное содержание трития в сме-

насоса (остаточное давление 0.005 Па) на долю три-

си.

тия в лабильной форме. Оказалось, что доля трития

в лабильной форме уменьшается при увеличении

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

продолжительности вакуумирования мишени с 30

до 60 мин на каждой стадии подготовки препара-

Для проведения реакции с атомарным тритием

тов. В предварительных экспериментах было так-

использовали температуру мишени 77 K и давле-

же показано, что использование нагревания стенок

ние газа 0.5 Па, когда для большинства химических

реактора до 80°C при вакуумировании приводит

соединений образование побочных продуктов ми-

к увеличению доли меченых низкомолекулярных

нимально. Продолжительность атомизации трития

фракций, вероятно за счет деполимеризации препа-

на вольфрамовой проволоке составляла 10 с, что

рата при таком режиме высушивания. Поэтому при

также способствовало уменьшению образования

подготовке препаратов нагревание в дальнейшем не

побочных продуктов. Температуру атомизатора из-

использовали.

меняли от 1730 до 1960 K.

Анализ с помощью ВЭЖХ меченых препара-

Содержание связанной воды является важным

тов после упаривания растворов досуха показал,

условием, влияющим на удельную активность пре- что, помимо пика по радиоактивности, который

РАДИОХИМИЯ том 63 № 4 2021

398

СИНОЛИЦ и др.

100

0.16

0.12

0.08

0.04

t, мин

Рис. 1. Профили активности при ВЭЖХ препарата № 1:

100

200

300

400

500

1 - после удаления лабильной метки упариванием рас-

t, ч

твора, 2 - после диализной очистки.

Рис. 2. Изменение активности препаратов [³H]ГК во вре-

мя диализа. Препарат: 1 - №1 (M_w 100 кДа без предвари-

соответствует времени выхода основной фракции

тельного диализа), 2 - №2 (M_w 350 кДа без предваритель-

ГК, наблюдаются дополнительные пики, соответ-

ного диализа), 3 - №3 (M_w 100 кДа с предварительным

диализом), 4 - №4 (M_w 350 кДа с предварительным ди-

ствующие меньшей молекулярной массе. Диализ-

ализом).

ная очистка препарата через мембраны MWCO

8-10 кДа приводила к удалению низкомолекуляр-

ных фракций. На рис. 1 представлены профили ак-

которые не удаляются при высушивании раствора.

тивности элюата препарата ГК 100 кДа до диализ-

Существенного изменения молекулярно-массового

ной очистки и после нее (табл. 1, препарат № 1).

распределения препарата, определяемого по опти-

Кинетика изменения активности меченых пре-

ческому поглощению элюата, не было зафиксиро-

паратов при диализе показана на рис. 2. Упарива-

вано. Это было подтверждено в независимом экспе-

нием досуха внешнего раствора было показано,

рименте, когда исходный препарат ГК (М_w 350 кДа)

что в первые 3 сут диализа происходит преимуще-

хранился при 4°С в течение 60 и 90 сут (рис. 3).

ственно переход через мембрану тритиевой воды,

Вероятно, при диализе удаляются сопутствующие

а при больших сроках диализа возрастает доля ра-

диоактивности в низкомолекулярных компонентах,

низкомолекулярные компоненты, однако, нельзя

(а)

(б)

Время, мин

Рис. 3. Хроматографические профили препаратов ГК. (а) 1 - препарат №3 (100 кДа), 2 - препарат №6 (200 кДа), 3 - препарат

№4 (350 кДа); (б) немеченый препарат ГК (350 кДа) после хранения в водном растворе при 4°С 60 (1) и 90 сут (2).

РАДИОХИМИЯ том 63 № 4 2021

ПОЛУЧЕНИЕ МЕЧЕННОЙ ТРИТИЕМ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

399

исключать их образование в процессе обработки

0.3

препаратов атомами трития.

Для выяснения того, присутствуют ли низкомо-

0.25

лекулярные компоненты в препарате изначально и

0.2

как они влияют на удельную активность очищенно-

го препарата, провели предварительную диализную

0.15

очистку препаратов в течение 28 сут. Такая предва-

рительная подготовка позволила уменьшить актив-

0.1

ность продуктов, удаляемых при диализе (рис. 2),

а удельная радиоактивность очищенного препарата

0.05

возрастала (табл. 1).

Для выяснения того, как влияет температура

вольфрамовой проволоки (T_w) на эффективность

t, мин

введения трития в ГК для препарата М_w 200 кДа

(табл. 1, препараты 5-7, ), провели эксперимен-

Рис. 4. Профили активности препаратов [³H]ГК (препа-

ты при температуре атомизатора T_w = 1730, 1850

раты № 5-7), полученных при температуре вольфрамо-

вой проволоки, К: 1 - 1730, 2 - 1850, 3 - 1960.

и 1960 K. Препарат предварительно очищали от

сопутствующих компонентов диализом в течение

21 сут. После введения трития удаляли лабильную

введению трития необходимо максимально удалить

метку упариванием растворов, а затем проводили

воду из препаратов вакуумированием при остаточ-

диализ в течение 7 сут. Профили активности очи-

ном давлении 0.005 Па в течение не менее 1 ч, одна-

щенных препаратов приведены на рис. 4.

ко без нагрева, чтобы избежать деполимеризации.

Для препаратов, обработанных атомами трития,

Обработку препаратов атомами трития следует про-

полученными при температуре атомизатора 1730 и

водить при температуре мишени 77 K и давлении

1850 K, наблюдался один пик по активности, совпа-

трития 0.5 Па в течение 10 с. Для уменьшения фраг-

дающий с пиком по УФ поглощению элюата. При

ментации молекул температура атомизатора долж-

анализе препарата, полученного при температуре

на быть не выше 1850 K. Для удаление лабильной

атомизатора 1960 K, пик по активности соответство-

метки и низкомолекулярных меченых фрагментов

вал молекулярной массе меньшей, чем в исходном

можно использовать диализ в течение 7 сут при 4°С.

препарате. Таким образом, использование жестких

условий введения трития (T_w = 1960 K) приводит к

БЛАГОДАРНОСТИ

фрагментации молекул биополимера. Хотя от фраг-

ментированных молекул можно избавиться с по-

Выражаем благодарность д.б.н. И.Д. Гроздовой,

мощью диализа или фильтрацией препарата через

д.х.н. Н.С. Мелик-Нубарову, к.ф.-м.н. И.С. Чащину

мембрану с соответствующим диаметром пор, для

за предоставление препаратов и полезное обсужде-

получения препаратов с максимально близким к

ние.

исходному составу не рекомендуется использовать

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

такой температурный режим.

В ходе проведенной работы было показано, что

Работа выполнена при поддержке Российско-

метод термической активации является удобным

го фонда фундаментальных исследований (грант

способом получения меченной тритием гиалуро-

№ 18-33-20147-мол-а-вед и № 19-33-90151).

новой кислоты. Определены основные факторы,

позволяющие ввести тритий в ГК с сохранением ее

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

свойств и повысить удельную активность [³Н]ГК.

Для этого требуется предварительная очистка ГК от

низкомолекулярных компонентов с помощью диа-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта ин-

лиза водных растворов при 4°С. При подготовке к

тересов.

РАДИОХИМИЯ том 63 № 4 2021

400

СИНОЛИЦ и др.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Badun G.A., Chernysheva M.G., Ksenofontov A.L. //

Radiochim. Acta. 2012. Vol. 100. P. 401-408.

Bukhari S.N.A., Roswandi N., Waqas M. et al. // Int. J.

10. Badun G.A., Chernysheva M.G., Tyasto Z.A. et al. //

Biol. Macromol. 2018. Vol. 120. P. 1682-1695.

Radiochim. Acta. 2010. Vol. 98. P. 161-166.

Schaefer L., Schaefer R.M. // Cell Tissue Res. 2010.

11. Бадун Г.А., Ксенофонтов А.Л., Лукашина Е.В. и др. //

Vol. 339. P. 237-246.

Радиохимия. 2005. Т. 47, № 3. С. 281-283.

Dosio F., Arpicco S., Stella B., Fatta E. // Adv. Drug

12. Сидоров Г.В., Бадун Г.А., Баитова Е.А. и др. // Радио-

Deliv. Rev. 2016. Vol. 97. P. 204-236.

химия. 2005. Т. 47, № 3. С. 284-288.

Edelman R., Assaraf Y.G., Levitzky I. et al. // Oncotarget.

13. Gallyamov M.O., Chaschin I.S., Khokhlova M.A. et al. //

2017. Vol. 8. P. 24337-24353.

Mater. Sci. Eng. C. 2014. Vol. 37. P. 127-140.

d’Amora M., Camisasca A., Boarino A. et al. // Colloids

Surf. B: Biointerfaces. 2020. Vol. 188. 110779.

14. Gallyamov M.O., Chaschin I.S., Bulat M. et al. // J.

Biomed. Mater. Res. Part B: Appl. Biomater. 2018.

Pepeliaev S., Hrudíková R., Jilková J. et al. // Eur.

Vol. 106. P. 270-277.

Polym. J. 2017. Vol. 94. P. 460-470.

Laurent B.G., Tengblad A. // Anal. Biochem. 1980.

15. Simulescu V., Kalina M., Mondek J., Pekař M. // Polym.

Vol. 394. P. 386-394.

Degrad. Stab. 2015. Vol. 111. P. 257-262.

Highsmith S., Chipman D.M. // Anal. Biochem. 1974.

16. Mondek J., Kalina M., Simulescu V., Pekař M. // Polym.

Vol. 566. P. 557-566.

Degrad. Stab. 2015. Vol. 120. P. 107-113.

РАДИОХИМИЯ том 63 № 4 2021