ЗНАМЕНАТЕЛЬНЫЕ ДАТЫ

М.А. Должикова, аспирант

А.В. Пикунова^,кандидат биологических наук

А.А. Толпекина

С.Д. Князев, доктор сельскохозяйственных наук, профессор

А.Ю. Бахотская

E-mail: pikuanna84@mail.ru

УДК 634.7:577.21

DOI: 10.30850/vrsn/2020/3/26-29

ИДЕНТИФИКАЦИЯ СОРТОВ СМОРОДИНЫ ЧЕРНОЙ (RIBES NIGRUM L.)

НА ОСНОВАНИИ ПОЛИМОРФИЗМА МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ*

В настоящее время Государственный реестр селекционных достижений РФ, допущенных к использованию, включает

198 сортов смородины черной. Учитывая достаточно большое количество сортов, актуальной является задача их иден-

тификации. В данной работе представлены генотипы 28 сортов черной смородины в 11 микросателлитных локусах,

полученные с применением наиболее современного метода детекции - фрагментного анализа путем капиллярного элек-

трофореза. Для всех сортов были получены уникальные профили. Мы предлагаем использовать в качестве сортов-кон-

тролей возможного сдвига размеров аллелей достаточно востребованные в производстве сорта разных оригинаторов

и различного происхождения - Ben Conan (оригинатор SCRI, UK), Искушение (оригинатор ВНИИСПК, РФ), Чародей

(Кокинский опорный пункт, РФ). Результаты исследований могут быть использованы для идентификации задейство-

ванных в анализе сортообразцов.

Ключевые слова: смородина черная, Ribes nigrum L., полиморфизм, идентификация, ДНК-маркеры, генотипирование, гене-

тические паспорта, микросателлитные локусы.

M.A. Dolzhikova, PhD student

A.V. Pikunova, PhD in Biological sciences

A.A. Tolpekina

S.D. Knyazev, Grand PhD in Agricultural sciences, Professor

A. Yu. Bakhotskaya

E-mail: pikuanna84@mail.ru

IDENTIFICATION OF BLACKCURRANT VARIETIES (RIBES NIGRUM L.) BASED

ON MICROSATELLITE LOCUS POLYMORPHISM

Currently, the State Register of breeding achievements approved for use includes 198 blackcurrant varieties. The urgent task is their

identification, given the large number of varieties. This paper presents the genotypes of 28 blackcurrant varieties at 11 microsatellite locus

obtained by using the most advanced detection method is fragment analysis by capillary electrophoresis. For all varieties unique profiles

are obtained. We propose to use, as controls, varieties of different originators and various origins Ben Conan (originator SCRI, UK),

Iskushenie (originator VNIISPK, RF), Charodey (Kokinsky base, Russia) that are quite popular in production. The research results can

be used to identify the variety samples involved in the analysis.

Key words: black currant, Ribes nigrum L., polymorphism, identification, DNA markers, genotyping, genetic pasportization,

microsatellite loci.

На долю черной смородины в России прихо-

STR - Simple Tandem Repeats) ДНК-маркеры.

дится половина площадей, занятых под ягодни-

Нельзя также не отметить всё большее развитие

ками. [2] По состоянию на 2019 год в Государ-

систем SNP маркирования и полногеномного

ственный реестр селекционных достижений РФ,

секвенирования. [7]

допущенных к использованию, вошло 198 сортов

Для изучения смородины первые микросател-

этой важнейшей ягодной культуры. [1] При таком

литные маркеры разработаны шотландскими уче-

большом количестве сортов их идентификация -

ными [9] (http://www.fruitbreeding.co.uk/RibesGe-

актуальная задача. Для этого используют класси-

nomicsSSRs.asp), 49 микросателлитных локусов

ческие методы апробации, которые в результате

были локализованы на разных группах сцепления

анализа фенотипа растений включают как коли-

генетической карты смородины черной. [10, 15]

чественные, так и качественные признаки. [6]

SSR-маркеры применяли также для оценки раз-

Наиболее перспективная система идентифи-

нообразия генетических коллекций Ribes в Ита-

кации, не зависящая от условий выращивания

лии и Северной Европе. [8, 11, 14]

и периода развития организма, основана на по-

Цель исследований - генотипирование сорто-

лиморфизме ДНК. В идентификации человека,

образцов смородины черной из коллекции ВНИ-

животных, растений наиболее востребованы ми-

ИСПК по микросателлитным локусам для даль-

кросателлитные (SSR - Simple Sequence Repeats,

нейшей генетической паспортизации.

* Работа выполнена при поддержке гранта РНФ «Изучение генома смородины (Ribes L.) с помощью ДНК маркеров» № 18-

76-0032.

ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ НАУКИ • № 3-2020

ЗНАМЕНАТЕЛЬНЫЕ ДАТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Таблица 1.

Микросателлитные локусы, задействованные в анализе

В данной работе приведены результаты геноти-

пирования 28 сортообразцов смородины черной из

коллекции ВНИИСПК по 11 микросателлитным

локусам.

ДНК выделяли из молодых листьев СТАВ-

методом. [12] ПЦР - анализ проводили в реакци-

g1-k04

TGT TCC CTG TTT CCT TCA

GGA CGT GGA CGA TGA

онной смеси объемом 20 мкл, содержащей 1 х ПЦР

AAA

GAG TT

буферный раствор, 200 мкМ нуклеотидов по 2 мкМ

g1-M07

TCC CGT TAC TGG AGT

CCA TGG TTT TCC GAT TTG TT

прямого и обратного праймера, 0,3 ед. Taq ДНК-

GGT GT

полимеразы и 10 нг ДНК.

e1-001

CCT TTC CAG AGA AAA CTC AAG TAT GGG AAC AAC

Реакцию амплификации выполняли в следу-

AAA CA

GGC AG

ющем режиме: предварительная денатурация

5 мин. при 95 °С; денатурация - 30 с при 95°С; отжиг

g2-H21

TGC CCT TTT TGG TCA TTT TC CAA TCG TCG ATG AAG GTC TG

праймера - 30 с при температуре, подобранной для

g2-g12

GTG ACC CAC CTA AAC

GGA GTG GAG GGT TGG

каждого маркера (табл. 1); синтез ДНК - 30 с при

CGT CC

AAA AT

72°С (всего 30 циклов); завершающий этап (элонга-

g2-L17

TTT GGA AAA CCT CCC

GAG CTG TTG CTG TTG CCA TA

ция) - 10 мин. при 72°С.

CTT TT

Фрагменты разделяли на приборе ABI prism

e1-O21

TCT CTC CAA CTG AGA AGG GAT TTG TTC TTG TGC AGC GA

Genetic Analyzer 3010. ПЦР-продукты нескольких

AAA A

локусов, отличающиеся по размерам и флуорес-

g1-L12

CGAAGGTTGAATCGGTGAGT TTGTGAGCCGTAACCACGTA

центной метке собирали в один мультиплекс (ана-

e3-b02

AAG ACG AAG ACG ACG

CTG ATC TTT GCC GAA TGG TT

лизировали на ABI prism Genetic Analyzer одновре-

ACG AT

менно). Для учета первичных данных использовали

g1-a01

CGA AGG TTG AAT CGG

CGT AGC CAC GTA GTT CCA CA

программу Peak Scanner Software_v01 (Peak Scan-

TGA GT

ner™ Software Version 1.0. Part Number 4382253 Rev.

gr2-j05

CAA AAC TGA TTA GGG

TTT GAA GAA GAG ATG GCG

A 12/2006).

GAT CA

AAA

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ученые Белоруссии [3] на основании полимор-

В большинстве случаев на ДНК каждого сорто-

физма 8 микросателлитных локусов разработали

образца в конкретном локусе амплифицировалось

методы ДНК-идентификации сортов смородины

не более двух фрагментов, но в некоторых локусах

черной и красной, крыжовника обыкновенного,

и три (табл. 2).

возделываемых в республике, применимые для

Амплификация более чем двух аллелей в некото-

практического использования и обладающие доста-

рых микросателлитных локусах у диплоидных форм

точной степенью информативности для определе-

связана с дупликацией этих локусов на одной и той

ния сортовой принадлежности, а также установле-

же или на разных хромосомах. [13]

ния родословных сортов. [3]

Для всех проанализированных сортообразцов

В рамках проекта RIBESCO более 800 сортоо-

получены уникальные микросателлитные профили,

бразцов генотипированы с помощью микросател-

которые могут быть использованы для генетической

литных маркеров, на основании полученных дан-

паспортизации.

ных вместе с фенотипическими отобраны образцы

При разработке систем идентификации гено-

для дальнейшей криоконсервации. [8]

типов важное значение имеет воспроизводимость

В качестве важного элемента системы иден-

результатов анализа, на которую существенно вли-

тификации стоит отметить использование сортов

яет методика детекции. В детекции полиморфизма

контролей. Несмотря на хорошую воспроизводи-

микросателлитных локусов наиболее точной, по

мость результатов микросателлитного анализа, не-

сравнению с ПААГ считают детекцию путем капил-

большие изменения в методике проведения (разные

лярного электрофореза, которая также позволяет

флуоресцентные метки, приборы - анализаторы,

автоматизировать и наиболее точно оцифровать ре-

наборы реактивов и др.) могут привести к сдвигу

зультаты исследований.

размеров аллелей. Например, в зависимости от цве-

Ранее впервые в России мы использовали ми-

та флуоресцентной метки ведущего праймера, по-

кросателлитные маркеры для оценки межсортового

лученные фрагменты могут оказаться больше или

полиморфизма, определения генетического сход-

меньше на несколько пар нуклеотидов.

ства и проверки родословных между сортообразца-

В последнее время в практику проведения ана-

ми черной смородины. [5] В данной работе, наце-

лиза входит использование сортов контролей с из-

ленной на генотипирование сортов для дальнейшей

вестными генотипами. Зная абсолютные размеры

паспортизации, существенно изменился набор про-

контрольного образца, легко вычислить фактор

анализированных сортов, перечень задействован-

конверсии (сдвига) для всех исследуемых геноти-

ных в анализе микросателлитных локусов и, самое

пов. Поэтому единый контроль необходим в каждой

главное, применен наиболее точный метод детек-

серии генотипируемых образцов. [4]

ции полиморфизма микросателлитных локусов -

Таким образом, в результате генотипирования

фрагментный анализ путем капиллярного электро-

28 сортов смородины черной по 11 микросател-

фореза.

литным локусам получены уникальные профили,

ЗНАМЕНАТЕЛЬНЫЕ ДАТЫ

Таблица 2.

Генотипы сортов черной смородины по 11 микросателлитным локусам

Локус

№

Сорт

g1-K04

g1-M07

e1-О01

g2-L17

g2-G12

g1-L12

gr2-j05

g1-a01

g2-H21

e1-O21

e3-B02

Ben Conan

310

206/214

142

143/162

191/197

214/218

244

295

165/170

Искушение

310

217/222

142/155

162

173/187

214/218

207/211

246

295

165/170

Чародей

310/312

200/214

144/146

146

187/193

213/216

169/196/198

207/210

247/251

295

165/170

Блакестон

310

206/214

142/144

146

189/193

217

211/222

247/251

295

165/168

Бурая сладкая

302/310

202/210/216

142/144

142/156

187/191

217

198/200

211

247

295

165/170

Гамаюн

310/316

202/214

142

156

191/197

217

196/198

207

247

295/298

165/170

Десертная

310

216/222

142/155

162

173/187

213

207/211

247

295

165/170

Огольцовой

Загляденье

310

206/214

142/144

156

189/195

213/217

169/173/196

207

247

295

165/168

Изюмная

312/316

210/214

142/146

162

187/197

213

192

207

247

292/295

165/170

Кипиана

310/316

214

142/155

156

179/195

213

169/196/198

207/211

247

295

165/170

Купалиниай

310/316

202/210/229

142/146

143/166

179/197

213/218

169/192

211

245/247

295

165/170

Лентяй

302/312

202/206/216

142/144

130/151

195/197

217

192

207/211

247

295/298

165/170

Мария Киевская

310/312

214/223

137/142

156

187/191

213/217

169/192

207

245/247

295

165/170

Мока

302/310

206/225

144/146

151

213

191/192

207/210

165/170

Монисто

310

206/214/

142/144

147/156

179/195

213

198

207/210

247/252

295

165/170

Нарианна

310/314

202/206

142/144

156/166

193/197

201/203/213

169/192

207/210

247

295

165/170

Ника

310

206/214

146/155

156

173/193

213/216

192

207

247

295

165/168

Нимфа

310

202/214/233

142/148

156

191/197

213

169

207/211

245/247

295

165/170

Орловская

310/312

210/222

142/155

146/156

191/197

213/217

192/198

211

245/247

298

165/170

серенада

Ртищевская

310/312

210/216/

144/146

144

195/197

217

169

207

247

295

168/170

Смольяниновская

310/317

202/214

142

156

191/197

214

207/211

247

295/298

165/170

Сокровище

310/312

216/233

138/144

144/146

191/197

214/217

192

210

245/247/251

295

165/170

Стрелец

310/312

202/217/233

138/144

144/146

191/197

216

192

210

245/247/251

295

165/170

Тсема

310

206/210

140/142

156

179/197

216

173/192

207/210

247

295

165/168

Фортуна

310

202/216

146/155

156/162

187/191

213/216

169/192/196

207

247

295

165/170

Черешнева

302/310

202/214/216

144

144/162

187

213

192

207

247

292/295

165/170

Черноокая

310/312

210/214/223

142/155

146/156

191/197

213

192/198

211

245/247

298

165/170

Ядрёная

310

201/214/233

148/155

156

187/197

217

169/198

207/211

245/247

295

165/170

Примечание. Выделены уникальные сочетания аллелей в пределах большой выборки сортообразцов - 73 сорта

красной смородины (Ribes rubrum), 54 черной (Ribes nigrum).

которые могут быть использованы в генетической

ставителей видов ягодных культур Fragaria L. и Ribes L: ав-

паспортизации. Мы предлагаем применять в каче-

тореф. … канд. биол. наук / О.А. Межнина - 2017. - 25 с.

стве сортов-контролей востребованные в производ-

4. Омашева, М.Е. Молекулярно-генетическая паспор-

стве сорта разных оригинаторов и различного про-

тизация сортов яблони / М.Е. Омашева, А.С. Пожар-

исхождения - Ben Conan (оригинатор SCRI, UK),

ский, Б.Б. Смайлов, Н.Н. Галиакпаров // Алматы. -

Искушение (оригинатор ВНИИСПК, РФ), Чародей

Научно-методические рекомендации института био-

(Кокинский опорный пункт, РФ).

логии и биотехнологии растений. - 2017. - 50 с.

5. Пикунова, А.В. Полиморфизм микросателлитных ло-

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ

кусов у сортов черной смородины (Ribes nigrum L.) из

1. Государственный реестр селекционных достижений,

коллекции ВНИИСПК /А.В. Пикунова, С.Д. Князев,

допущенных к использованию. Т. 1. Сорта растений.

А.Ю. Бахотская, А.А. Кочумова // Сельскохозяйствен-

М. - 2020.

ная биология. - 2015. - Т. 50. - № 1. - С. 46-54.

2. Князев, С.Д. Селекция смородины черной на совре-

6. Помология. Том IV. Смородина. Крыжовник / под

менном этапе / С.Д. Князев, Т.П. Огольцова - Орел:

ред. Е.Н. Седова. - Орел: ВНИИСПК. - 2009. - 468 с.

Изд-во Всероссийского научно-исследовательского

7. Хлесткина, Е.К. Молекулярные маркеры в генетиче-

института селекции плодовых культур. - 2004. -238 с.

ских исследованиях и в селекции / Е.К. Хлесткина //

3. Межнина, О.А. Оценка генетического разнообразия и

Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2015. -

разработка методов ДНК-идентификации сортов и пред-

Т. 17. - № 4/2. - С. 1044-1054.

ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ НАУКИ • № 3-2020

ЗНАМЕНАТЕЛЬНЫЕ ДАТЫ

8. Antonius, K. Development of the Northern European Ri-

B.B. Smajlov, N.N. Galiakparov // Almaty. Nauchno-

bes core collection based on a microsatellite (SSR) marker

metodicheskie rekomendacii instituta biologii i biotekh-

diversity analysis / K. Antonius, S. Karhu, H. Kaldm et al

nologii rastenij. - 2017. - 50 s.

// Plant Genetic Resources: Characterization and Utiliza-

5. Pikunova, A.V. Polimorfizm mikrosatellitnyh lokusov u

tion. - 2012. - P. 70-3.

sortov chernoj smorodiny (Ribes nigrum L.) iz kollekcii

9. Brennan, R. Development and characterization of SSR

VNIISPK /A.V. Pikunova, S.D. Knyazev, A.Yu. Bahots-

markers in Ribes species / R. Brennan, L. Jorgensen,

kaya i dr. // Sel’skohozyajstvennaya biologiya. - 2015. -

M. Woodhead, J. Russell // Molecular Ecology Notes. -

T. 50. - № 1. - S. 46-54.

2002. - V. 2. - №. 3. - P. 327-330.

6. Pomologiya. Tom IV. Smorodina. Kryzhovnik / pod red.

10. Brennan, R. The development of a genetic linkage map

E.N. Sedova. - Orel: VNIISPK. - 2009. - 468 s.

of blackcurrant (Ribes nigrum L.) and the identification of

7. Hlestkina, E.K. Molekulyarnye markery v geneticheskih

regions associated with key fruit quality and agronomic traits

issledovaniyah i v selekcii / E.K. Hlestkina // Vavilovskij

/ R. Brennan, L. Jorgensen, C. Hackett et al. // Euphytica. -

zhurnal genetiki i selekcii. - 2015. - T. 17. - № 4/2. -

2008. - V. 161 (1-2). - P. - 19-34.

S. 1044-1054.

11. Cavanna, M. Microsatellite-based evaluation of Ribes spp.

8. Antonius, K. Development of the Northern European Ri-

Germplasm / M. Cavanna, D.T. Marinoni, G.L. Beccaro et al.

bes core collection based on a microsatellite (SSR) marker

// Genome. - 2009. - V. 52. - №. 10. - P. 839-848.

diversity analysis / K. Antonius, S. Karhu, H. Kaldm et al

12. Doyle, J.J. Isolation of plant DNA from fresh tissue/ J.J. Doyle,

// Plant Genetic Resources: Characterization and Utiliza-

J.L. Doyle // Focus. - 1990. - V. 12. - P. 13-15.

tion. - 2012. - P. 70-73.

13. Galli, Z. Molecular identification of commercial apple

9. Brennan, R. Development and characterization of SSR

cultivars with microsatellite markers/ Z. Galli, G. Halász,

markers in Ribes species / R. Brennan, L. Jorgensen,

E. Kiss, L. Heszky, J. Dobránszki // HortScience. -

M. Woodhead, J. Russell // Molecular Ecology Notes. -

2005. - Т. 40. - №. 7. - С. 1974-1977.

2002. - V. 2. - №. 3. - P. 327-330.

14. Palmieri, L. Establishment of molecular markers for germplasm

10. Brennan, R. The development of a genetic linkage map of

management in a worldwide provenance Ribes spp. Collection

blackcurrant (Ribes nigrum L.) and the identification of re-

/ L. Palmieri, M.S. Grando, M. Sordo et al // Plant Omics. -

gions associated with key fruit quality and agronomic traits /

2013. - № 6 (3). - P. 165-174.

R. Brennan, L. Jorgensen, C. Hackett et al. // Euphytica. -

15. Russell, J. The use of genotyping by sequencing in blackcurrant

2008. - V. 161 (1-2). - P. 19-34.

(Ribes nigrum): developing high-resolution linkage maps

11. Cavanna, M. Microsatellite-based evaluation of Ribes spp.

in species without reference genome sequences /J. Russell,

Germplasm / M. Cavanna, D.T. Marinoni, G.L. Beccaro

C. Hackett, P. Hedley et al. // Molecular breeding. - 2014. -

et al. // Genome. - 2009. - V. 52. - №. 10. - P. 839-848.

№ 33 (4). - P. 835-849.

12. Doyle, J.J. Isolation of plant DNA from fresh tissue/

J.J. Doyle, J.L. Doyle // Focus. - 1990. - V. 12. - P. 13-15.

LIST OF SOURCES

13. Galli, Z. Molecular identification of commercial apple

1. Gosudarstvennyj reestr selekcionnyh dostizhenij, dopush-

cultivars with microsatellite markers/ Z. Galli, G. Ha-

chennyh k ispol’zovaniyu. T. 1. Sorta rastenij. M. - 2020.

lász, E. Kiss, L. Heszky, J. Dobránszki // HortScience. -

2. Knyazev, S.D., Selekciya smorodiny chernoj na sovremen-

2005. - Т. 40. - №. 7. - С. 1974-1977.

nom etape / S.D. Knyazev, T.P. Ogol’cova. - Orel: Izd-vo

14. Palmieri, L. Establishment of molecular markers for germ-

Vserossijskogo nauchno issledovatel’skogo instituta selekcii

plasm management in a worldwide provenance Ribes spp.

plodovyh kul’tur. - 2004. - 238 s.

Collection / L. Palmieri, M.S. Grando, M. Sordo et al //

3. Mezhnina, O.A. Ocenka geneticheskogo raznoobraziya i

Plant Omics. - 2013. - № 6 (3). - P. 165-174.

razrabotka metodov DNK-identifikacii sortov i predstavi-

15. Russell, J. The use of genotyping by sequencing in black-

telej vidov yagodnyh kul’tur Fragaria L. i Ribes L, avtoref.

currant (Ribes nigrum): developing high-resolution link-

… kand. biology. nauk / O.A. Mezhnina - 2017. - 25 s.

age maps in species without reference genome sequences

4. Omasheva, M.E. Molekulyarno-geneticheskaya paspor-

/J. Russell, C. Hackett, P. Hedley et al. // Molecular breed-

tizaciya sortov yabloni / M.E. Omasheva, A.S. Pozharskij,

ing. - 2014. - № 33 (4). - P. 835-849.