ЗНАМЕНАТЕЛЬНЫЕ ДАТЫ

Е.В. Безлепкина, кандидат биологических наук

А.А. Гуляева, кандидат сельскохозяйственных наук

А.В. Пикунова, кандидат биологических наук

E-mail: Bezlepkina@vniispk.ru

УДК 634.23:631.52

DOI: 10.30850/vrsn/2020/4/26-28

АЛЛЕЛЬНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА CАМОНЕСОВМЕСТИМОСТИ

У СОРТОВ ЧЕРЕШНИ СЕЛЕКЦИИ ВНИИСПК

Самонесовместимость при опылении - это важнейший механизм предотвращения самооплодотворения у покрытосеменных

растений, а, следовательно, обеспечения генетического разнообразия популяции. У представителей Prunus самонесовмести-

мость контролируется как минимум двумя генами: S (self-incompatibility) и SFB (S haplotype-specific F-box protein). Ген S

представлен в популяциях серией множественных аллелей. Совместимость сортов черешни определяется аллельным набо-

ром гена S. При опылении пыльцой несущей аллель гена S, присутствующий в генотипе материнского растения, завязыва-

ния не происходит. Таким образом, предотвращается как самооплодотворение, так и оплодотворение пыльцой близкород-

ственных, имеющих идентичный аллельный набор гена S, растений. Этот механизм может нарушаться в случае мутаций

в гене S или SFB, что приводит к появлению самоплодных сортов, а также при полиплоидизации как, например, у вишни. В

рамках изучения генофонда коллекции косточковых культур ВНИИСПК проведен анализ аллельного полиморфизма гена S

у сортов черешни селекции ВНИИСПК. Для амплификации были использованы как консенсусные (PaConsI, PaConsII), так

и аллельспецифичные (S1, S5, S9, S10) праймеры. Установлен аллельный набор гена S у сортов Аделина (S3/S5), Поэзия (S3/

S5), Сияна (S3/S6), Орловская фея (S3/S5) и Троснянская (S5/S6). Для сортов Малыш, Подарок Орлу, Орловская розовая

и Орловская янтарная аллельный набор был определен частично, так как эти сорта несут уникальные неописанные ранее

или очень редкие аллели. Сорт Подарок Орлу несет аллели S9 и неописанный ранее аллель. Сорта Малыш и Орловская ян-

тарная - аллель S6 и предположительно аллель S17 или S30, для которых еще не разработаны аллельспецифичные праймеры,

сорт Орловская розовая - аллели S6 и неописанный ранее.

Ключевые слова: черешня, Prunus avium L., совместимость при опылении, ген самонесовместимости S, консенсусные и ал-

лельспецифичные праймеры.

E.V. Bezlepkina, PhD in Biological sciences

A.A. Gulyaeva, PhD in Agricultural science

A.V. Pikunova, PhD in Biological sciences

E-mail: Bezlepkina@vniispk.ru

ALLELIC POLYMORPHISM OF THE SELFINCOMPATIBILITY GENE

IN CHERRY VARIETIES IN SELECTION

OF ALL-RUSSIAN RESEARCH INSTITUTE FOR FRUIT CROP BREEDING

Self-incompatibility is one of the most important mechanisms used by flowering plants to prevent self-fertilization and, consequently,

to provide the genetic diversity of population. The self-incompatibility in Prunus is controlled by two genes as minimum: S (self-

incompatibility) and SFB (S haplotype-specific F-box protein). S gene is represented in the population by a multiple allele series.

Compatibility in pollination is dependent on the S allele combination of the cultivars. When S allele in the pollen is identical with one of

the S alleles of the mother plant fertilization is arrested. Thus, both self-fertilization and fertilization by pollen of closely related plants

(having identical S alleles) are prevented. This mechanism may be interrupted in the case of mutations in the S or SFB gene, which

leads to the appearance of self-compatibility cultivars, and polyploidization, such as in sour cherry. The investigation of the S gene allele

polymorphism of sweet cherry cultivars of VNIISPK breeding was performed as a part of the study of the gene collection of stone crops.

Both consensus (PaConsI, PaConsII) and allele-specific (S1, S5, S9, S10) primers were used. The S-genotype of cultivars Adelina (S3/

S5), Poezia (S3/S5), Siana (S3/S6), Orlovskaia feia (S3/S5) and Trosnianskaia (S5/S6) were established. The S-genotype

of cultivars Malish, Podarok Orlu, Orlovskaia rozovaia and Orlovskaia yantarnaia was determined partially, as these cultivars have

unique previously undescribed or very rare S alleles. Podarok Orlu variety has S9 allele and undescribed one. Malish and Orlovskaia

yantarnaia varieties have S6 allele and S17 or S30 alleles supposedly, for these alleles specific primers have not yet been developed.

Orlovskaya rozovaia has S6 allele and undescribed previously one.

Key words: sweet cherry, Prunus avium L., pollination compatibility, self-incompatibility gene S, consensus and allele-specific primers.

Самонесовместимость - широко распространен-

трубке отличается от аллельного набора гена S тка-

ный у цветковых растений механизм предотвращения

ни пестика. Молекулярный механизм самонесовме-

самоопыления. Для черешни, как и для всех пред-

стимости еще изучается. По мнению ряда авторов,

ставителей Prunus, характерен гаметофитный тип

существует пока неопределенный ингибитор рибону-

самонесовместимости. Совместимость при опыле-

клеаз S, активность которого блокируется геном SFB

нии определяется взаимодействием мультиаллель-

при распознавании «своей» рибонуклеазы S, таким

ного гена S, кодируещего рибонуклеазу, и гена SFB,

образом предотвращается рост пыльцевой трубки. [3]

кодирующего S специфичный F-box протеин. [8]

Развитие молекулярно-генетических методов

Рост пыльцевой трубки и формирование завязи

определения совместимости черешни при опыле-

возможны, только если аллель гена S в пыльцевой

нии стимулировало активное генотипирование и

ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ НАУКИ • № 4-2020

ЗНАМЕНАТЕЛЬНЫЕ ДАТЫ

Рис. 1. Электрофоретические профили при амплификации

Рис.2. Электрофоретические профили при амплификации

с консенсусными праймерами PaConsI:

с консенсусными праймерами PaConsII:

1 - Аделина, 2 - Поэзия, 3 - Малыш, 4 - Орловская розовая;

1 - Аделина, 2 - Поэзия, 3 - Малыш, 4 - Орловская розовая,

5 - маркер молекулярной массы ДНК MWM-50RL (Диалат);

5 - Орловская янтарная; 6 - маркер молекулярной массы ДНК

сортообразцы: 6 - Орловская янтарная, 7 - Орловская фея,

MWM-100RL (Диалат); 7 - Сияна, 8 - Подарок Орлу,

8 - Сияна, 9 - Подарок Орлу.

9 - Орловская фея, 10 - Троснянская.

группирование сортов черешни по признаку совме-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

стимости на основе данных ДНК анализа.

В 2017 году М. Schuster обобщил результаты

Для установления аллельного набора гена S про-

S генотипирования сортообразцов черешни бо-

ведена амплификация с консенсусными праймера-

лее чем из 20 стран. [4] Обзор включает данные о

ми PaConsI и PaConsII.

1203 сортообразцах, сгруппированных в 60 групп

Анализ электрофореграмм ПЦР с праймера-

по признаку совместимости при опылении. Также

ми PaConsI позволил определить присутствие

были выделены группы универсальных доноров (0)

аллеля S3 у сортов Аделина, Поэзия, Орловская фея

с уникальными S аллелями и самоплодных чере-

и Сияна, так как только в данном случае образуется

шен (SC). Данная классификация включает всего

продукт размером 330 п.н. Однозначных результа-

несколько сортов российской селекции. Аллельный

тов по остальным аллелям получено не было. Одна-

набор гена S определен для сортов: Ипуть (S3/S13),

ко были идентифицированы продукты ПЦР близ-

Брянская розовая (S3/S6), Анонс (S5/S9), Крупноплод-

кого размера: 456/462 п.н., соответствующие алле-

ная (S5/S9), Краса Кубани (S1/S6), Кавказская (S3/

лям S1/S5, 518/523 п.н. - S4/S6 и 419…428 п.н. - S2/

S6) и Василиса (S3/S9). [1, 4]

S7//S9/S12 (рис. 1).

Результаты молекулярно-генетического анализа

В результате дальнейшего анализа результатов

полиморфизма гена S могут быть использованы для

ПЦР с консенсусными праймерами PaConsII уста-

прогнозирования успешности опыления, подбора

новлено присутствие аллеля S6 (577 п.н.) в геноти-

сортов опылителей, а также при планировании ги-

пах сортов Малыш, Орловская розовая, Орловска ян-

бридизации.

тарная, Троснянская и Сияна (рис. 2).

Цель работы - определение аллельного набо-

Проведенного анализа оказалось недостаточно

ра гена S у сортов черешни селекции ВНИИСПК.

для того, чтобы определить присутствуют ли в гено-

Были использованы консенсусные праймеры

ме части сортов аллели S1 или S5.

PaConsI и PaConsII, позволяющие амплифици-

Таким образом, на основании результатов ПЦР с

ровать высоковариабельные зоны интронов 1 и 2,

праймерами PaConsI и PaConsII установлен аллель-

соответственно, а также специфичные праймеры,

ный набор гена S только у сортов Сияна и Троснян-

с помощью которых возможно идентифицировать

ская - S3/S6 и S5/S6 соответственно. Для остальных

аллели S1, S5, S9, S10. [5, 6]

сортов потребовалось подтверждение либо уточне-

ние результатов амплификацией со специфически-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ми праймерами к аллелям S1, S5, S9 и S10.

Аллельспецифичной амплификацией было уста-

Объекты исследования - 9 сортов черешни се-

новлено присутствие аллеля S5 у сортов Аделина,

лекции ВНИИСПК: Аделина, Поэзия, Малыш, По-

Поэзия, Орловская фея и Троснянская (рис. 3), а так-

дарок Орлу, Орловская розовая, Орловская янтарная,

же аллеля S9 у сорта Подарок Орлу. Аллели S1 и S10

Орловская фея, Троснянская, Сияна.

Выделяли ДНК из листьев согласно протоколу

Porebski S., разработанному для ДНК раститель-

ной ткани с высоким содержанием полисахаридов

и фенольных соединений. [2] Матрицей для ПЦР

служила геномная ДНК в количестве100 нг. Реак-

цию амплификации проводили с консенсусными -

PaConsI, PaConsII [6] и аллель специфичными - S1,

S5, S9, S10 праймерами [5, 6] к гену S. Условия

проведения ПЦР соответствовали опублико-

ванным работам. [5, 6]

Рис. 3. Электрофоретические профили при амплификации

Продукты амплификации разделяли электро-

с праймерами специфичными к аллелю S5:

форезом в 2 %-м агарозном геле (1×TВE буфер). В

1 - маркер молекулярной массы ДНК MWM-100RL (Диалат);

качестве маркера молекулярной массы продуктов

сортообразцы: 2 - Аделина, 3 - Поэзия, 4 - Малыш,

ПЦР использовали MWM-50RL и MWM-100RL

5 - Подарок Орлу, 6 - Орловская розовая, 7 - Орловская

(Диалат).

янтарная, 8 - Орловская фея, 9 - Троснянская, 10 - Сияна.

ЗНАМЕНАТЕЛЬНЫЕ ДАТЫ

Таблица 1.

Julius Kuhn-Institut, Federal Research Center for Cul-

Результаты идентификации аллелей гена S

tivated Plants, Institute for Breeding Research on Fruit.

Germany. 2017.

Сорт

Аллели

Сорт

Аллели

5. Sonneveld, T. Cloning of six cherry self-incompartibility

Аделина

S3/S5

Орловская янтарная S6/(S17/S30)?

alleles and development of allele specific PCR detection /

Поэзия

S3/S5

Орловская фея

S3/S5

T. Sonneveld, T. Robbins, R. Boskovic, K. Tobutt// Theor

Малыш

S6/(S17/S30)? Троснянская

S5/S6

Appl Genet. - 2001. - 102 - P. 1046-1055.

Подарок Орлу

S9/S?

Сияна

S3/S6

6. Sonneveld, T. Allele-specific PCR detection of sweet

Орловская розовая

S6/S?

cherry self-incompatibility (S) alleles S1 to S16 using con-

sensus and allele-specific primers/ T. Sonneveld, K. To-

по результатам ПЦР анализа у изученных сортов от-

butt, T. Robbins// Theor Appl Genet. - 2003. - 107 -

сутствовали.

P. 1059-1070.

Установлен аллельный набор гена S для сортов

7. Vaughan, S.P. Characterization of novel S-alleles from

Аделина, Поэзия, Орловская фея, Сияна и Троснянская

cherry (Prunus avium L.)/ S.P. Vaughan, R.I. Boskovic,

(см. таблицу). У сортов Малыш и Орловская янтарная

A. Gisbert-Climent et all// Tree Genetics & Genomes -

на основе размера образующихся продуктов можно

2008. - 4 - P. 531-541.

предположить наличие аллеля S17 или S30. [8] Оба

8. Yamane, H. A pollen-expressed gene for a novel protein

аллеля встречаются редко. По сводным данным [4]

with an F-box motif that is very tightly linked to a gene

из 1203 проанализированных сортообразцов только

for S-RNase in two species of cherry, Prunus cerasus

два имеют аллель S17 и один - S30. Они отнесены к

and P. avium/ H. Yamane, K. Ikeda, K. Ushijima, H. Sas-

нулевой группе и считаются универсальными опы-

sa and R. Tao// Plant Cell Physiology - 2003 - 44 (7) -

лителями для других сортов. Специфичные к дан-

P. 764-769.

ным аллелям праймеры не разработаны, поэтому

какой именно аллель присутствует, пока точно не

LIST OF SOURCES

установлено. Аллельный набор гена S сортов Подарок

Suprun, I.I. Ispol’zovanie molekulyarno-genetichesk-

Орлу и Орловская розовая был определен частично.

ogo analiza i fenotipicheskoj ocenki dlya opredeleniya

На основе сопоставления электрофоретических

sovmestimosti sortov chereshni pri opylenii/ I.I. Sup-

профилей можно предположить присутствие в ге-

run, E.M. Alyohina, S.V. Tokmakov // Sadovodstvo i

нотипах данных сортов неописанных ранее аллелей

vinogradаrstvo - 2015 - № 6. - S. 35-39.

гена S. Эта информация требует своего подтвержде-

Porebski, S. Modification of a CTAB DNA extrac-

ния секвенированием.

tion protocol for plants containing high polysaccharide

По данным аллельного полиморфизма гена S со-

and polyphenol components/ S. Porebski, L.G. Bailey,

рта Аделина, Поэзия, Орловская фея (S3/S5) относят-

B.R. Baum// Plant Molecular Biology Reporter - 1997 -

ся при опылении к группе совместимости VII, Трос-

15 (1) - P. 8-15.

нянская (S5/S6) - XV, Сияна (S3/S6) - VI. [4] Сорта

Sassa, H. Molecular mechanism of the S-RNase-based ga-

Малыш, Подарок Орлу, Орловская розовая и Орлов-

metophytic self-incompatibility in fruit trees of Rosaceae/

ская янтарная согласно классификации относятся

H. Sassa//Breeding science - 2016 - 66 - P. 116-121.

к группе универсальных доноров. Необходимо про-

Schuster, M. Self-incompatibility (S) genotypes of culti-

анализировать встречаемость предположительно

vated sweet cherries - An overview 2017/M. Schuster//

редких аллелей среди сортов российской селекции,

Julius Kuhn-Institut, Federal Research Center for Cul-

так как накопленные данные о встречаемости алле-

tivated Plants, Institute for Breeding Research on Fruit.

лей гена S базируются преимущественно на работах

Germany. 2017.

зарубежных ученых.

Sonneveld, T. Cloning of six cherry self-incompartibility

alleles and development of allele specific PCR detection /

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ

T. Sonneveld, T. Robbins, R. Boskovic, K. Tobutt// Theor

1. Супрун, И.И. Использование молекулярно-генетиче-

Appl Genet. - 2001. - 102 - P. 1046-1055.

ского анализа и фенотипической оценки для опреде-

Sonneveld, T. Allele-specific PCR detection of sweet cher-

ления совместимости сортов черешни при опылении/

ry self-incompatibility (S) alleles S1 to S16 using consen-

И.И. Супрун, Е.М. Алёхина, С.В. Токмаков // Садо-

sus and allele-specific primers/ T. Sonneveld, K. Tobutt,

водство и виноградарство - 2015 - № 6. - С. 35-39.

T. Robbins// Theor Appl Genet. - 2003. - 107 - P. 1059-

2. Porebski, S. Modification of a CTAB DNA extraction proto-

1070.

col for plants containing high polysaccharide and polyphe-

Vaughan, S.P. Characterization of novel S-alleles from

nol components/ S. Porebski, L.G. Bailey, B.R. Baum//

cherry (Prunus avium L.)/ S.P. Vaughan, R.I. Boskovic,

Plant Molecular Biology Reporter - 1997 - 15(1) -

A. Gisbert-Climent et all// Tree Genetics & Genomes -

P. 8-15.

2008. - 4 - P. 531-541.

3. Sassa, H. Molecular mechanism of the S-RNase-based ga-

Yamane, H. A pollen-expressed gene for a novel protein

metophytic self-incompatibility in fruit trees of Rosaceae/

with an F-box motif that is very tightly linked to a gene for S-

H. Sassa//Breeding science - 2016 - 66 - P. 116-12.

RNase in two species of cherry, Prunus cerasus and P. avium/

4. Schuster, M. Self-incompatibility (S) genotypes of culti-

H. Yamane, K. Ikeda, K. Ushijima, H. Sassa and R. Tao//

vated sweet cherries - An overview 2017/M. Schuster//

Plant Cell Physiology - 2003 - 44 (7) - P. 764-769.

ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ НАУКИ • № 4-2020