ЗООТЕХНИЯ

УДК 619:57.086.164;578.23

DOI: 10.31857/2500-2082/2023/3/95-97, EDN: QOBYVQ

СОЗДАНИЕ ГИБРИДИЗАЦИОННОГО ЗОНДА

ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ МЕТОДОМ FISH*

Алина Константиновна Комина, младший научный сотрудник

Виктория Васильевна Стаффорд, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

Алексей Михайлович Гулюкин, член-корреспондент РАН

ФГБНУ «Федеральный научный центр - Всероссийский исследовательский институт

экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук»,

г. Москва, Россия

E-mail: stafford.v.v@gmail.com

Аннотация. В статье представлены данные по созданию ДНК-зонда для применения во флуоресцентной гибридизации in situ

на криотомных гистологических срезах образцов внутренних органов свиней. Данный метод диагностики актуален при

инаппаратном течении инфекции, которая способствует поддержанию вирусной нагрузки внутри стада, не проявляясь вы-

раженными клиническими признаками. Кроме этого, метод способствует выявлению вируса в патологическом материале

в период поствиремии. В нашей работе отражены этапы создания ДНК зонда размером 173 п.о. соответствующего участку

гена гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней. Зонд проверяли на миндалинах от инфицированных вирусом свиней,

в качестве отрицательного контроля использовали миндалины от здоровых, не привитых от КЧС свиней. Получены хоро-

шие результаты применения зонда, отражающие его высокую специфичность и избирательность в образцах положительного

контроля. Экспериментальные данные легли в основу наших дальнейших исследований в области инфекционной патологии

сельскохозяйственных животных.

Ключевые слова: флуоресцентная гибридизация in situ, гибридизационный зонд, классическая чума свиней

CREATION OF A HYBRIDIZATION PROBE FOR THE DIAGNOSIS

OF CLASSICAL SWINE FEVER BY THE FISH METHOD

A.K. Komina, Junior Researcher

V.V. Stafford, PhD in Biological Sciences, Leading Researcher

A.M. Gulyukin, Corresponding Member of the RAS

Federal State Budget Scientific Institution «Federal Scientific Centre VIEV», Moscow, Russia

E-mail: stafford.v.v@gmail.com

Abstract. The article presents data creation of the DNA probe labeled with fluorescein-12-dUTP for its subsequent use in in-situ

hybridization in cryotomic histological sections from samples of internal organs of pigs. This diagnostic method is especially relevant

for the inapparate course of infection, which contributes to maintaining the viral load inside the herd without showing pronounced

clinical signs. In addition, the method helps to identify the viral genetic material in the pathological samples during the post-viremia

period. In this article the stages of creating a probe consisting of 173 pairs of nucleotide bases corresponding to the site of the gly-

coprotein E2 gene of the classical swine fever virus are shown. The final DNA probe was tested on tonsils from pigs infected with

the CSF virus as a positive control for the DNA probe and as a negative control for the DNA probe is tonsils from healthy pigs not

vaccinated against CSF were used. Finally, we obtained positive results of using the DNA probe, reflecting its high specificity and

selectivity in the studied samples of positive control. The data obtained by us formed the basis for our further research in the field of

infectious pathology of farm animals.

Keywords: hybridization probe, nucleotide pair, DNA, RNA, fluorescent mark, classical swine fever

Флуоресцентная гибридизация in situ (fluores-

при диагностике онкологических состояний у че-

cence in situ hybridization - FISH) - цитогенетиче-

ловека, на его основе создают медицинские базы

ский метод, при котором применяют меченные

данных. [2, 3] Бактериологи изучают почвенные

флуорохромами ДНК-зонды для детекции и опре-

бактерии и их эволюцию. [1] В РФ нет данных по

деления положения специфической последова-

использованию метода при диагностике болезней

тельности ДНК или РНК в гистологических, ци-

животных. Гибридизация in situ позволяет выявить

тологических и хромосомных препаратах. В совре-

генетический материал возбудителя в тканях орга-

менной медицине гибридизация in situ - стандарт

нов, определить его тропность и раскрыть вопро-

диагностики многих инфекционных, иммунных

сы патогенеза и иммунного ответа, особенно при

и функциональных расстройств в макроорганиз-

инаппаратном течении болезни. [4-8, 10] Одно

ме. В России широко используют данный метод

из таких заболеваний - классическая чума сви-

* Статья выполнена в рамках государственного задания и плана НИР ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН на 2021-2024 годы / The

article was carried out within the framework of the state task and the research plan of the Federal State Budgetary Institution of the

Federal Research Center RES RAS for 2021-2024.

ЗООТЕХНИЯ

ней (КЧС), которой характерно острое, подострое

Дополнительно нуклеотидную последователь-

и бессимптомное течение.

ность зонда определяли по методу Сэнгера с исполь-

Иностранные специалисты для гибридизации in

зованием набора «BigDye 3.1» (Applied Biosystems,

situ в органах и тканях от свиней, зараженных КЧС,

США).

применяют протокол, опубликованный в сборнике

В дальнейшем, для применения готового гибри-

Всемирной организации здоровья животных (МЭБ)

дизационного зонда (ГБ) в качестве компонента

«Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial

гибридизации in situ, готовили гибридизационную

Animals» (Глава 3.9.3). [9]

смесь (ГС), начиная с гибридизационного буфера

Учитывая современные геополитические во-

(рН = 7,2), состоящего из 15 мл формамида, 3 мл

просы, нам необходим отечественный доступный

50% раствора декстрана сульфата натрия на дис-

метод выявления генетического материала любого

тиллированной воде, 3 мл 0,1М ФСБ, 3 мл 20хЦСБ.

патогена в тканях животных.

К данному объему добавили необходимое количе-

Цель работы - создание гибридизационного

ство ГБ для получения ГС, которую использовали

зонда для диагностики КЧС методом гибридизации

в гибридизации in situ в гистологических срезах.

in situ.

В качестве патологического материала для ис-

пытания ГБ брали криотомные, нефиксированные

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

гистологические срезы миндалин от инфициро-

ванных свиней (положительный контроль) и ин-

Для получения специфичного фрагмента раз-

тактных, не вакцинированных (отрицательный

мером 173 п.н., соответствующего участку гена

контроль).

гликопротеина Е2, проводили гнездовую ПЦР.

Для детекции флуоресцентной метки зонда ис-

Выделение РНК вакцинного штамма «КС» ви-

пользовали микроскоп Axio Scope A1.0 (Zeiss) и осве-

руса КЧС осуществляли при помощи коммер-

титель HBO 50 с соответствующим светофильтром

ческого набора

«РИБО-преп»

(«ИнтерЛабСер-

при ок.х10, об.х63. Фотосъемку вели при помощи

вис», Россия) по методике производителя. На

фотоаппарата и программы AxioVision.

первом этапе ПЦР с обратной транскрипцией

(ОТ-ПЦР) использовали прямой праймер F1

РЕЗУЛЬТАТЫ

5'-ATATATGCTCAAGGGCGAGT-3' и обратный

R1 5'-ACAGCAGTAGTATCCATTTCTTTA-3' (10

Секвенированием по методу Сэнгера полу-

пМ). При этом реакционная смесь объемом 25 мкл

чили нуклеотидную последовательность ДНК-

содержала 5 мкл образца, 5 мкл буфера (5х) для ОТ-

зонда:

CTGTGGCTAATAGTGACCTACATAG

ПЦР (Диам, Россия), 0,5 мкл смеси dNTP (Диам,

TTCTAACAGAACAACCCGCCGCTGGTTTAC

Россия), 12,1 мкл воды без нуклеаз, 0,25 мкл

AGCTGGGCCAGGGTGAGGTAGTGTTAAT

Taq-полимеразы (Диам, Россия), 0,125 MMLV-

AGGGAACTTAATTACCCACACAGACATTGA

ревертазы. Термический цикл: 50°С - 30 мин.,

GGTTGTAGTATATTTCTTACTGCTCTATTT

94°С - 5 мин. Затем 25 циклов: 95°C - 30 с, 60,5°C -

GGTCATGAGAGATGAGCCTATAAAGAAATG.

30 с и 72°C - 90 с, в конце 72°C - 5 мин. На втором

После вшивания флуоресцеина-12-dUTP в ДНК-

этапе проводили ПЦР с прямым праймером F2

зонд методом ПЦР получили флуоресцентный ГБ,

5'-CTGTGGCTAATAGTGACCTAC-3' и обратным

который использовали в реакции гибридизации in

R2 5'-CATTTCTTTATGGGCTCATC-3' (по 10 пМ).

situ для определения расположения вируса класси-

Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала

ческой чумы свиней в криотомных гистологических

5 мкл образца, 2,5 мкл буфера (10х) для ПЦР (Диам,

срезах.

Россия), 0,5 мкл смеси dNTP (Диам, Россия), 14,6

Получены положительные результаты гибри-

мкл воды без нуклеаз, 0,25 мкл Taq-полимеразы

дизации зонда в криотомных срезах миндалины от

(Диам, Россия). Термический цикл: 94°С - 5 мин.

инфицированной вирусом КЧС свиньи (см. рису-

Затем 25 циклов: 94°C - 30 с, 55°C - 30 с и 72°C -

нок А, 2-я стр. обл.) по сравнению с гистологиче-

90 с, в конце 72°C - 5 мин. После амплификации

ским образцом от интактного животного (см. рису-

выполняли электрофорез в 1%-м агарозном геле,

нок Б, 2-я стр. обл.).

приготовленном на трис-ацетатном буферном рас-

При положительной гибридизации зонда в ги-

творе (рН = 8,0) с добавлением 40 мкл бромистого

стологических срезах мы наблюдаем характерное

этидия на литр буфера. ПЦР-фрагмент, соответ-

изумрудно-зеленое свечение (А), по характеру ко-

ствующий по электрофоретической подвижности

торого можно определить расположение генетиче-

размеру 173 п.н., вырезали и выделяли из геля при

ского материала вируса (ГБ в тканях расположен

помощи набора «LumiPure» (Lumiprobe, Россия)

избирательно, в виде отдельно лежащих глыбок и их

согласно инструкции производителя.

скоплений). Хорошо выражены цитоплазма клеток

Для мечения ДНК-зонда использовали ПЦР.

и ядро, что свидетельствует о целостности структуры

Реакционная смесь состояла из

4,0 мкл смеси

клетки, отдельно лежащие частицы свидетельствуют

флуоресцеина-12-dUTP 1/3, 2,5 мкл Taq-буфера

о внеклеточном расположении вируса.

(х10), по 1 мкл праймеров F2 и R2 до конечной

Таким образом, мы получили чувствительный

концентрации каждого праймера

0,1…1,0 мкМ,

гибридизационный ДНК-зонд, который может

0,25 мкл Taq-полимеразы, 5 мкл матричной ДНК

быть использован в качестве компонента для тако-

(0,02…0,15 мкг/25 мкл смеси), деионизированной

го диагностического теста как гибридизация in situ.

воды до 25 мкл. Программа амплификации состоя-

Дальнейшие исследования в этой области позволят

ла из 40 циклов: 94°C - 10 с, 55°C - 10 с, 72°C - 30 с,

нам расширить методы диагностики инфекционной

затем инкубирование при 72°C - 3 мин.

патологии животных.

ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ НАУКИ • № 3-2023

ЗООТЕХНИЯ

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ

REFERENCES

Величко Н.В., Рабочая Д.Е., Макеева А.С., Пине-

Velichko N.V., Rabochaya D.E., Makeeva A.S., Pinev-

вич А.В. Таксономическое разнообразие цианобакте-

ich A.V. Taksonomicheskoe raznoobrazie cianobakterij

рий в антарктических почвенных сообществах, выяв-

v antarkticheskih pochvennyh soobshchestvah, vyyavlen-

ленное методом флуоресцентной in situ гибридизации.

noe metodom fluorescentnoj in situ gibridizacii. V sb.:

В сб.: Микроорганизмы и плодородие почвы. Мат.

Mikroorganizmy i plodorodie pochvy. Mat. I Vseross.

I Всеросс. науч.-практ. конф. с межд. уч., посвящ.

nauch.-prakt. konf. s mezhd. uch., posvyashch. 90-letiyu

90-летию со дня рождения профессора Е.М. Панкра-

so dnya rozhdeniya professora E.M. Pankratovoj. 2022.

товой. 2022. С. 27-30.

S. 27-30.

Каракулов Р.К., Кайдарова Д.Р., Душимова З.Д. и др.

Karakulov R.K., Kajdarova D.R., Dushimova Z.D. i dr.

Дифференцированный подход к терапии диффузной

Differencirovannyj podhod k terapii diffuznoj V-krup-

В-крупноклеточной лимфомы с учетом статуса с-MYC

nokletochnoj limfomy s uchetom statusa s-MYC i BCL2.

и BCL2. Онкогематология. 2022. Т. 17. № 1. С. 37-42.

Onkogematologiya. 2022. T. 17. № 1. S. 37-42. DOI: 10.1

DOI: 10.17650/1818-8346-2022-17-1-37-42.

7650/1818-8346-2022-17-1-37-42.

Шкаврова Т.Г., Михайлова Г.Ф., Цепенко В.В., Голуб

Shkavrova T.G., Mihajlova G.F., Cepenko V.V., Golub

Е.В. База данных частоты стабильных аберраций хро-

E.V. Baza dannyh chastoty stabil’nyh aberracij hromosom

мосом у детей, проживающих на радиоактивно-загряз-

u detej, prozhivayushchih na radioaktivno-zagryaznennyh

ненных территориях после чернобыльской аварии.

territoriyah posle chernobyl’skoj avarii. Svidetel’stvo o

Свидетельство о регистрации базы данных 2022620536,

registracii bazy dannyh 2022620536, 15.03.2022. Zayavka

15.03.2022. Заявка № 2022620389 от 09.03.2022.

№ 2022620389 ot 09.03.2022.

Choi C., Chae C. Localization of classical swine fever virus

in male gonads during subclinical infection. J Gen Virol.

2002 Nov; 83 (Pt 11): 2717-2721. DOI: 10.1099/0022-

1317-83-11-2717.

Choi C., Chae C. Detection of classical swine fever virus in

the ovaries of experimentally infected sows. J Comp Pathol.

2003 Jan; 128 (1): 60-6. DOI: 10.1053/jcpa.2002.0607.

Fan Y-H, Lin Y-L, Hwang Y-C. et al. T-cell factor-4 and

MHC upregulation in pigs receiving a live attenuated classi-

cal swine fever virus (CSFV) vaccine strain with interferon-

gamma adjuvant. Vet J. 216. Р. 148-56. DOI: 10.1016/j.

gamma adjuvant. Vet J. 216. R. 148-56. DOI: 10.1016/j.

tvjl.2016.07.009.

Ha S.-K., Choi C., Chae C. Development of an optimized

protocol for the detection of classical swine fever virus in

formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by seminested

reverse transcription-polymerase chain reaction and com-

parison with in situ hybridization. Research in Veterinary

Science. 2004. 77. Р. 163-169.

Science. 2004. 77. R. 163-169

Nagarajan K., Saikumar G. Fluorescent in-situ hybridiza-

tion technique for the detection and localization of classi-

cal swine fever virus in infected tissues. Veterinarski Arhiv.

82 (5). 2012. P. 495-504.

URL: https://www.oie.int/en/what-we-do/standards/

codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/

10. Zhang Q., Xu Lu, Zhang Y. et al. A novel ViewRNA in situ

hybridization method for the detection of the dynamic dis-

tribution of Classical Swine Fever Virus RNA in PK15 cells.

Virology Journal. 2017. 14 (1): 81. DOI: 10.1186/s12985-

017-0734-4.

Поступила в редакцию 17.02.2023

Принята к публикации 03.03.2023