ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ И

СИСТЕМЫ ЖИЗНЕОБЕСПЕЧЕНИЯ

УДК 577.32, 577.352.3

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСПОЛОЖЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЗНЫХ

КОМПЛЕКСОВ В МАТРИКСЕ МИТОХОНДРИЙ СЕРДЦА КРЫСЫ

С ПОМОЩЬЮ КРИОГЕННОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ ТОМОГРАФИИ

Л.С. Ягужинский^2,3,4, Р.Г. Василов¹

¹Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, Россия

² Московский физико-технический институт, Долгопрудный

³ НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва

⁴ Институт цитохимии и молекулярной фармакологии, Москва

* E-mail: konstantin.plokhikh@phystech.edu

В данной работе исследуется локализация пируватдегидрогеназных комплексов (ПДК) и α-кетоглутаратдеги-

дрогеназных комплексов (КГДК) внутри матрикса митохондрий клеток сердца крысы методом криогенной

электронной томографии. Такой подход позволил исследовать данные ферменты в своем естественном окру-

жении. На восстановленных томограммах частично разрушенных митохондрий удалось визуализировать ПДК

и КГДК, расположенные вблизи внутренней мембраны митохондрий. По результатам субтомографического

усреднения получены трехмерные реконструкции ПДК и КГДК, с разрешением 31 Å и 46 Å соответственно.

Полученные данные указывают на специфичность локализации ПДК и КГДК в окрестности комплексов дыха-

тельной цепи внутренней мембраны митохондрий.

ВВЕДЕНИЕ

восстанавливается NAD⁺ до NADH, который яв-

Настоящая работа входит в цикл работ, посвя-

ляется субстратом комплекса I дыхательной цепи

щенных изучению структуры полиферментных

митохондрий. ПДК достаточно хорошо изучен [4],

систем, в частности системы клеточного дыхания.

он состоит из трех ферментов, представленных в

Задачей работы являлось исследование окружения

нем в большом количестве копий. У млекопитаю-

внутренней мембраны митохондрий с помощью

щих жесткое ядро составляют 60 копий фермента

криогенной электронной томографии. В качестве

пируватдегидрогеназы (E₁), упорядоченные в доде-

объекта были рассмотрены митохондрии, выделен-

каэдр диаметром примерно 25 нм. Общий диаметр

ные из желудочков сердца крысы. Ранее они уже

комплекса с учетом периферических нековалентно

использовались авторами работы в других исследо-

связанных ферментов (E₂, E₃) составляет пример-

ваниях [1, 2].

но 50 нм. В процессе работы привлекли внимание

Поскольку состав матрикса митохондрий

также КГДК - похожие по структуре и размеру на

очень обширен, в первую очередь внимание

ПДК [4]. Основное структурное отличие - кубиче-

было обращено на достаточно большие ком-

ское ядро, состоящее из 24 копий α-кетоглутаратде-

плексы, в частности, на ПДК. Давно известно,

гидрогеназы. КГДК осуществляет окислительное

что этот глобулярный комплекс находится в ма-

декарбоксилирование альфа-кетаглутаровой кис-

триксе митохондрий [3] и катализирует реак-

лоты с образованием NADH и сукцинил-кофермен-

цию окислительного декарбоксилирования пи-

та А, который далее в цикле Кребса превращается

рувата - процесса, который предшествует циклу

в сукцинат - субстрат комплекса II дыхательной

трикарбоновых кислот в основном пути синтеза

цепи. Таким образом, работа ПДК и КГДК тесно

АТФ. В результате функционирования ПДК об-

сопряжена с работой дыхательной цепи митохон-

разуется ацетил-кофермент А, используемый в

дрий - они являются для нее ключевыми произво-

цикле Кребса для образования цитрата, а также

дителями субстратов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСПОЛОЖЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ В МАТРИКСЕ...

Хотя на данный момент существуют трехмер-

и получения льда оптимальной толщины и немед-

ные модели данных комплексов с высоким разре-

ленно погружалась в жидкий этан при температуре

шением, полученные in vitro [5, 6, 7], их простран-

жидкого азота для фиксации в тонком слое аморф-

ственное расположение в матриксе митохондрий

ного льда.

практически не изучалось. Исследование струк-

Исследования проводились с помощью криоген-

турных контактов сопряженных метаболических

ного электронного микроскопа Titan Krios 60-300

систем может позволить найти ранее неизвестные

(Thermo Fisher Scientific, США) при ускоряющем

механизмы развития патологических процессов.

напряжении 300 кВ. С использованием программ-

Так, например, изменения во взаимном располо-

ного обеспечения Tomography 4 (Thermo Fisher

жении ферментных комплексов в митохондриях

Scientific, США) было собрано 11 томографиче-

могут быть важной частью процессов, обеспечи-

ских серий, состоящих из 61 изображения, полу-

вающих метаболический сдвиг в сторону анаэроб-

ченных при наклоне образца от -60° до 60° с шагом

ного пути утилизации глюкозы, который проис-

в 2°. Увеличение составляло 18000, а дефокусиров-

ходит при ишемии, старении [8] и онкогенезе [9].

ка варьировалась от -6 до -8 мкм. Суммарная доза

Кластеризация ферментов одного метаболического

облучения образца не превышала 120 e^-/Å².

пути в так называемые метаболоны, внутри кото-

Полученные серии изображений были восста-

рых происходит прямая передача промежуточных

новлены с использованием программного обеспе-

метаболитов от одного активного центра к друго-

чения IMOD [10]. Добавленные в раствор образ-

му, позволяет значительно повысить их скорость

ца наночастицы золота были использованы для

и эффективность, а также устойчивость к неблаго-

выравнивания угловых серий. Процедура томо-

приятным внешним факторам. В то время как ПДК

графического восстановления трехмерной струк-

и КДГК сами по себе являются метаболонами, их

туры производилась методом одновременной ите-

структурное взаимодействие с сопряженными ме-

рационной реконструкции (Simultaneous Iterative

таболическими системами неизвестно. Современ-

Reconstruction Technique, SIRT) и методом обратно

ные подходы криогенной электронной микроско-

взвешенных проекций (Weighted Back Projection,

пии, в частности метод криогенной электронной

WBP). В дальнейшем томограммы, полученные

томографии, позволяют восполнить этот пробел

методом SIRT, использовались для определения

и исследовать макромолекулярную организацию

положения частиц на них, а томограммы, полу-

белковых комплексов в живых системах.

ченные методом WBP, - для субтомографического

усреднения.

МЕТОДЫ

На томограммах, полученных методом SIRT,

Митохондрии для исследований были выделены

с помощью программного пакета IMOD в ручном

из самок крыс линии Wistar по стандартной проце-

режиме были отобраны 2 типа частиц, соответству-

дуре [2]. В эксперименте использовалась суспензия

ющих различным дегидрогеназным комплексам, и

митохондрий с концентрацией около 0.3 мг/мл. За

определены координаты 48 частиц ПДК и 24 части-

10 минут до витрификации был запущен процесс

цы КГДК. Далее производилась экстракция субто-

окислительного фосфорилирования.

мограмм из томограмм, полученных методом WBP,

Митохондрии были смешаны с раствором нано-

содержащих интересующие комплексы с помощью

частиц золота (10 nm Colloidal Gold Labeled Protein

программного пакета RELION2 [11, 12] с последу-

A, UMC Utrecht, Нидерланды) в соотношении 20:1.

ющими оценкой функции передачи контраста при

3 мкл образца было нанесено на сетку с углеро-

помощи CTFFIND4 [13]. В RELION2 было прове-

дом, содержащим отверстия, предварительно обра-

дено субтомографическое усреднение - итерацион-

ботанную в тлеющем разряде с помощью PELCO

ный алгоритм, включающий в себя выравнивание

easiGlow (Ted Pella, США) в течение 30 с при токе

частиц друг относительно друга с последующим

25 мА для придания поверхности гидрофильных

усреднением. Первоначальное усреднение про-

свойств. Витрификания осуществлялась при по-

изводилось без применения априорных знаний о

мощи Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific,

симметрии комплексов. После подтверждения на-

США) при температуре 4°C и относительной влаж-

личия симметрии у полученных реконструкций,

ности 95-100% внутри камеры прибора. Далее сет-

было произведено субтомографическое усредне-

ка подвергалась одновременному двустороннему

ние с икосаэдрической симметрией для ПДК и с

промакиванию фильтровальной бумагой в течение

октаэдрической - для КГДК. Для визуализации по-

2.5 с для удаления излишков раствора с образцом

лученных трехмерных моделей был использован

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

К.С. ПЛОХИХ и др.

программный пакет UCSF Chimera [14]. Для ПДК

пространственное разрешение трехмерной рекон-

струкции с соответствующей симметрией соста-

вило 31 Å, а для КГДК - 46 Å. Оценка разрешения

производилась по критерию объемной корреляции

фурье с пороговым значением 0.143 (Fourier Shell

Correlation).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Полученные данные криогенной электронной

томографии позволили визуализировать фрагмен-

ты частично разрушенных митохондрий сердца в

тонком слое аморфного льда. Разрушение митохон-

Рис. 3. Центральный срез трехмерной реконструкции КГДК, по-

дрий происходило из-за эффектов поверхностного

лученной с помощью субтомографического усреднения с окта-

натяжения во время нанесения суспензии на сетку.

эдрической симметрией. Длина масштабного отрезка - 10 нм

На реконструкциях можно заметить шарообразные

комплексы ПДК и КГДК, располагающиеся вблизи

ми на нем дегидрогеназными комплексами пред-

мембраны, а также в свободном виде в объеме ма-

ставлен на рис. 1.

трикса. Пример среза томограммы с обозначенны-

На рис. 2 показан центральный срез трехмерной

реконструкции ПДК с разрешением 31 Å, получен-

ной с помощью субтомографического усреднения с

использованием икосаэдрической симметрии, а на

рис. 3 - КГДК (разрешение 46 Å) с использованием

октаэдрической симметрии. Относительно низкое

пространственное разрешение объясняется малым

количеством частиц, по несколько десятков каждо-

го типа, а также подвижностью внешних оболочек

комплексов - известно, что ПДК и КГДК содержат

неупорядоченные связующие фрагменты, обеспе-

чивающие подвижность внешних субъединиц от-

носительно ядра и друг друга. Полученные данные

не позволили установить точный механизм взаи-

Рис. 1. Фрагмент среза томограммы, реконструированной

модействия дегидрогеназ с мембраной. Тем не ме-

методом SIRT. Длина масштабного отрезка - 50 нм. Зеленым

нее, полученное разрешение оказалось достаточ-

обведены ПДК, синим - КГДК

ным, чтобы достоверно отличить ПДК и КГДК от

других белков, разлить между собой и определить

их пространственное расположение. Продолжение

исследований, в том числе увеличение статистиче-

ской выборки и проведение субтомографического

усреднения без применения операции симметрии,

позволит в дальнейшем получить трехмерные мо-

дели более высокого разрешения и выяснить ме-

ханизм взаимодействия комплексов и функцио-

нальное значение примембранной локализации

дегидрогеназ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе проведено исследование лока-

лизации ПДК и КГДК внутри матрикса митохон-

Рис. 2. Центральный срез трехмерной реконструкции ПДК, по-

дрий. На полученных томограммах заметно их пре-

лученной с помощью субтомографического усреднения с икоса-

имущественное расположение вблизи внутренней

эдрической симметрией. Длина масштабного отрезка - 10 нм

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСПОЛОЖЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ В МАТРИКСЕ...

мембраны митохондрий (рис. 1), где локализованы

5. Yu X. et al. Structures of the human pyruvate

белки дыхательной цепи [2] - другой метаболиче-

dehydrogenase complex cores: a highly conserved catalytic

center with flexible N-terminal domains // Structure. 2008,

ской системы митохондрий, которая для своей ра-

т. 16, №1, с. 104-114.

боты использует производимые ПДК и КГДК ме-

таболиты. Полученные результаты указывают на

6. Murphy G.E., Jensen G.J. Electron cryotomography

of the E. coli pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase

возможность структурного взаимодействия между

complexes // Structure. 2005, т. 13, №12, с. 1765-1773.

разными метаболическими кластерами митохон-

7. Zhou Z.H. et al. The remarkable structural and functional

дрий и показывают перспективность продолжения

organization of the eukaryotic pyruvate dehydrogenase

исследований в области локализации ферментных

complexes // Proceedings of the National Academy of

комплексов.

Sciences. 2001, т. 98, №26, с. 14802-14807.

8. Ravera S. et al. Discrete changes in glucose metabolism

БЛАГОДАРНОСТИ

define aging // Scientific reports. 2019, т. 9, №1, с. 1-8.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (Грант

№19-04-00835) и НИЦ «Курчатовский институт» в

9. Кобляков В.А. Гипоксия и гликолиз как факторы, опре-

деляющие злокачественный фенотип

// Цитология.

рамках тематического плана «Изучение процессов

2016, т. 58, №7, с. 499-506.

генерации, передачи и распределения энергии в

живых организмах».

10. Kremer J.R., Mastronarde D.N., McIntosh J.R.

Computer visualization of three-dimensional image data

using IMOD // Journal of structural biology. 1996, т. 116,

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

№1, с. 71-76.

1. Нестеров С.В. и др. Определение расположения и

11. Scheres S.H.W. RELION: implementation of a Bayesian

структуры атф-синтетазы в мембранах митохон-

approach to cryo-EM structure determination // Journal of

дрий сердца крыс с помощью крио-электронной томо-

structural biology. 2012, т. 180, №3, с. 519-530.

графии // Российские нанотехнологии. 2020, т. 15, №1,

с. 93-100.

12.

Bharat T.A.M., Scheres S.H.W. Resolving

macromolecular structures from electron cryo-tomography

2. Nesterov S. et al. Ordered clusters of the complete

data using subtomogram averaging in RELION //Nature

oxidative phosphorylation system in cardiac mitochondria //

protocols. 2016, т. 11, №11, с. 2054-2065.

International journal of molecular sciences. 2021, т. 22,

№3, с. 1462.

13. Rohou A., Grigorieff N. CTFFIND4: Fast and accurate

defocus estimation from electron micrographs //Journal of

3. Schnaitman C., Greenawalt J.W. Enzymatic properties of

structural biology. 2015, т. 192, №2, с. 216-221.

the inner and outer membranes of rat liver mitochondria //

The Journal of cell biology. 1968, т. 38, №1, с. 158-175.

14. Pettersen E.F. et al. UCSF Chimera - a visualization

system for exploratory research and analysis // Journal of

4. Reed L.J. A trail of research from lipoic acid to α-keto

computational chemistry. 2004, т. 25, №13, с. 1605-1612.

acid dehydrogenase complexes // Journal of Biological

Chemistry. 2001, т. 276, №42, с. 38329-38336.

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021