ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ И

СИСТЕМЫ ЖИЗНЕОБЕСПЕЧЕНИЯ

УДК 537.533.73

IN SITU КРИОЭЛЕКТРОННАЯ ТОМОГРАФИЯ

НА ПРИМЕРЕ КЕРАТИНОЦИТОВ

Р.А. Камышинский¹, А.А. Пантелеев¹, А.С. Орехов¹

¹Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, Россия

²Московский физико-технический институт

(национальный исследовательский университет), Долгопрудный, Россия

^*E-mail: Orekhov_AS@nrcki.ru

In situ криоэлектронная томография - динамично развивающийся метод трехмерной визуализации ультра-

структуры клеток и тканей в их естественном состоянии. Благодаря появлению новых методик подготовки

образцов, техническому развитию электронных микроскопов и постоянному усовершенствованию методов

обработки экспериментальных данных, появилась возможность извлекать высокоточную структурную инфор-

мацию о макромолекулярной организации одиночных клеток и межклеточном взаимодействии. В настоящей

работе основные возможности метода in situ криоэлектронной томографии продемонстрированы на примере

эпителиальных клеток.

ВВЕДЕНИЕ

время подготовить больше качественных срезов

In situ криоэлектронная томография с каждым

необходимой толщины (до 100 нм) с высокой лока-

годом становится все более популярным методом

лизацией места травления.

трехмерной структурной характеризации биоло-

Одним из наиболее интересных объектов ис-

гических объектов в их естественном (нативном)

следования являются эпителиальные клетки че-

состоянии, таких как целые клетки, субклеточные

ловека - кератиноциты, выполняющие множество

органеллы и макромолекулярные комплексы [1-3].

различных функций, от защитных до секреторных.

Вместе с тем, из-за сложности подготовки образ-

Для выполнения своих функций в организме, они

цов необходимой толщины (до 200-300 нм) для

должны сформировать характерную структуру -

изучения методами криогенной просвечивающей

эпителиальный пласт, где у каждой клетки четко

электронной микроскопии (крио-ПЭМ) долгое вре-

определены базальная и апикальная стороны, а

мя структурный анализ был ограничен изолирован-

также сформированы специфические контакты

ными объектами (одиночными белками, вирусами

с соседними клетками. Межклеточные контакты

и т.д.) и тонкими отростками клеток [4-7]. Для

включают несколько типов: десмосомы, плотные

прямой визуализации внутренних структур более

контакты, щелевые контакты. От нормального

крупных объектов применяется утонение методом

формирования и функционирования межклеточ-

фокусированного ионного пучка Ga⁺ (крио-ФИП)

ных контактов зависят как барьерные характери-

[8] или метод ультрамикротомирования при тем-

стики эпителия, так и его механические свойства,

пературе жидкого азота [9], которые позволяют

а также передача сигналов от клетки к клетке.

получить срезы витрифицированных объектов

Целый ряд патологий связан с нарушением рабо-

толщиной менее 300 нм. Последний метод крайне

ты этих структур [10-11]. Большинство контак-

сложен и требователен технически, а выход каче-

тов представляют собой сложные молекулярные

ственных срезов, пригодных для получения дан-

белковые комплексы. Компактные размеры и ти-

ных крио-ПЭМ с высоким разрешением, очень

повая\характерная структура делают их удобным

низок. Напротив, применение метода крио-ФИП в

объектом для исследования методами электронной

полуавтоматическом режиме позволяет за меньшее

микроскопии.

IN SITU КРИОЭЛЕКТРОННАЯ ТОМОГРАФИЯ НА ПРИМЕРЕ КЕРАТИНОЦИТОВ

Кроме формирования различных межклеточных

клеток сеточки однократно отмывали дистиллиро-

контактов, эпидермальным кератиноцитам свой-

ванной водой.

ственно формирование в их цитоплазме специфи-

Для получения клеточного пласта кератиноциты

ческих гранул, содержание которых служит мате-

человека линии N-TERT размножали по стандарт-

риалом для построения «рогового конверта» при

ной методике в бессывороточной среде для кера-

ороговевании клеток эпидермиса кожи на послед-

тиноцитов Keratinocyte serum-free medium (KSFM,

них, терминальных стадиях их дифференцировки.

Gibco 17005042) и высевали на предварительно

Морфология этих гранул, структура их мембран и

подготовленные сеточки в высокой плотности. Для

содержимого являются ключевыми показателями

пересева клетки снимали с субстрата 0.25% раство-

характера дифференцировки кератиноцитов и, со-

ром трипсина (ПанЭко).

ответственно, функциональности эпидермиса, его

По достижении 100% конфлюэнтности клет-

барьерных свойств. Таким образом, разработка

ки переводили на дифференцировочную среду:

новых методов анализа структуры гранул в эпи-

DMEM (ПанЭко) с GlutaMAX (Gibco), содержащей

дермальных кератиноцитах является актуальной

10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone).

задачей, как с точки зрения диагностики различ-

Витрификация образцов проводилась с помо-

ных заболеваний кожи, так и с фундаментальной,

щью автоматизированной системы Vitrobot Mark

исследовательской точки зрения.

IV. Сетки (предварительно гидрофилизированные

В данной работе мы демонстрируем результа-

с помощью установки Pelco easyGlow при значе-

ты трехмерной реконструкции внутриклеточных

нии силы тока 25 мА, давлении 0.26 мБар в течение

структур, в том числе компонентов их цитоскелета,

30 секунд) с исследуемыми клеточными препарата-

нативных эпителиальных клеток - эпидермальных

ми подвергались процедуре одновременного дву-

кератиноцитов, полученных с помощью in situ кри-

стороннего сжатия фильтровальной бумагой для

оэлектронной томографии.

удаления излишков раствора и далее быстро замо-

раживались в сжиженном этане, охлажденном до

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

температуры жидкого азота (-196°C). В процессе

Эпидермальные эквиваленты из первичных ке-

нанесения образца на сетку температура в камере

ратиноцитов кожи человека или иммортализован-

системы Vitrobot составляла 14°С, влажность - не

ных кератиноцитовлинии N-TERT были получе-

менее 95%.

ны, как описано ранее [12], на поликарбонатных

Для приготовления тонких клеточных срезов с

вставках. Кератиноциты высевались в количестве

помощью фокусированного ионного пучка (крио-

120-150 тыс. на подготовленную поликарбонатную

ФИП) использовался растровый электронно-ион-

вставку (Millicell Cell Culture Insert PIHP01250,

ный микроскоп (РЭИМ) Versa 3D FEG (FEI, USA)

Millipore) с сеточками и инкубировались при 37°С

с приставкой для работы с замороженными образ-

и 5% СО₂. Через 1-2 дня, по достижении кон-

цами Quorum PP3010 (QT, UK). РЭМ изображения

флюэнтного монослоя, среду заменяли на диф-

получены при ускоряющем напряжении электро-

ференцировочную, а еще через сутки переходи-

нов 5 кэВ, травление ионами Ga⁺ проводилось при

ли на культивирование на границе раздела сред

ускоряющем напряжении 30 кэВ и последователь-

(Air-Liquid interface). Формирование монослоя

ном понижении тока пучка от 1 нА до 50 пА.

оценивали методом прижизненного окрашива-

Полученные срезы витрифицированных кле-

ния клеток диацетатом флуоресцеина (ФДА). Для

точных систем переносились в замороженном со-

размножения кератиноцитов использовали сре-

стоянии с помощью специального шлюза в кри-

ду Keratinocyte serum-free medium (KSFM) (Gibco

о-ПЭМ Titan Krios 60-300 (FEI, USA). Получение

17005042), для дифференцировки среду CnT-Prime

изображений проводилось с помощью программ-

3DBarrier Medium (CELLnTEC, Cat. No. CnT-PR-

ного обеспечения Tomography 4.1 (FEI, USA) в

3D). Структура эквивалентов оценивалась на 4-6

режиме малых доз в диапазоне от -60 до +60 гра-

день культивирования на границе раздела сред.

дусов с угловым шагом в 2 градуса. Для набора

Сеточки (Au 200, Quantifoil) стерилизовали по-

томографических серий использовались увеличе-

гружением на 20 минут в 70% раствор этанола.

ния 8700х и 18000х с экспериментально подобран-

Затем сеточки покрывали раствором коллагена IV

ными оптимальными значением дефокусировки в

(50 мкг/мл в 0.03% уксусной кислоте), высушивая

диапазоне [-8 мкм; -5 мкм]. Суммарное значение

раствор в стерильных условиях. Перед посевом

дозы электронов, прошедших через единицу пло-

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

В.А. КРАЛИН и др.

щади образца за всё время экспозиции, составило

~ 100 е^-/Å².

С полученными массивами изображений про-

водились процедуры кросс-корреляционного вы-

равнивания и томографического восстановления с

использованием методов одновременной итераци-

онной реконструкции (SIRT, Simultaneous Iterative

Рис. 2. РЭМ (а, б) и крио-ПЭМ (в) изображения подготовлен-

Reconstruction Technique) и обратно-взвешенных

ной ламели: а) вид сверху, б-в) вид сбоку

проекций (WBP, Weighted Back Projections) с помо-

щью программного пакета IMOD [13]. Дальнейшая

аннотация и сегментирование выполнялись в не-

же, как при контрольном культивировании на пла-

сколько этапов с помощью сверточных нейронных

стике (рис. 1в). Такой подход позволил существен-

сетей в программном пакете EMAN 2.2 [14]. Для

но улучшить визуализацию сеток в замороженном

определения положения внутриклеточных фила-

состоянии в РЭИМ и четко определять места кон-

ментов использовалась кросс-корреляция с цилин-

тактов клеток.

дрическими шаблонами в программе Avizo. Для

Методом крио-ФИП были получены ламели тол-

улучшения разрешения трехмерной реконструкции

щиной 100-200 нм. На рис. 2б,в показаны изобра-

и определения ориентации повторяющихся объ-

жения ламели с размерами около 10×10×0.2 мкм; в

ектов использовался метод субтомографического

верхней части ламели наблюдается сохранившийся

усреднения в программе Relion2. Финальная ви-

защитный слой платины (Pt). Таким образом, «про-

зуализация проводилась с помощью программных

зрачными» для электронов являются центральные

пакетов UCSF Chimera [15] и Avizo (FEI, USA). Об-

части клеток и клеточные контактов, а не только

работка полученных данных проводились на мощ-

тонкие отростки клеток (толщиной менее 300 нм).

ностях локальной вычислительной станции, осна-

На рис. 3 представлены срезы томограмм, на

щенной графическим ускорителем Nvidia GeForce

которых различимы компоненты цитоскелета ке-

1080Ti и процессором Intel Core i7.

ратиноцитов, а также рибосомные субъединицы.

Толщина ламели в данном участке составляет око-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ло 100 нм. Наблюдаемые протяженные структуры

На первом этапе работы были получены in vitro

были идентифицированы по форме и размеру. Диа-

образцы многослойного (стратифицированного)

метр наблюдаемых микротрубочек составляет око-

кожного эпителия человека на поликарбонатных

ло 25 нм, промежуточных кератиновых филамен-

вставках. Однако толщина этих образцов была

тов - 10 нм, микрофиламентов - 5 нм. Взаимное

слишком велика для определения их положения

положение всех филаментов было определено на

на сеточке в РЭИМ. Для того чтобы оптимизиро-

отдельных томограммах (рис. 4б), как и положение

вать размеры и уменьшить толщину объекта, на

и ориентация рибосом и других цитоплазматиче-

сеточках был выращен монослой эпидермальных

ских компонентов клетки (гранулы и микровези-

кератиноцитов (клеточный пласт) толщиной в

1 клетку при сохранении клеточных контактов (де-

смосом и других типов межклеточных контактов).

На рис. 1а,б виден сформированный на сеточке

клеточный пласт, различимы границы клеток так

Рис. 3. Томографические срезы кератиноцитов, демонстриру-

Рис. 1. Кератиноциты N-TERT, культивируемые на сетках

ющие рибосомы (Р) и элементы цитоскелета: микротрубочки

(а), шкала 200 мкм, (б) увеличенный фрагмент фото а, (в)

(МТ), промежуточные филаменты (ПФ), актиновые микро-

монослой кератиноцитов на культуральном пластике, шкала

филаменты (МФ). Диаметр микротрубочек около 25 нм, про-

20 мкм. Прижизненное окрашивание ФДА

межуточных филаментов 10 нм, и микрофиламентов 5 нм

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

IN SITU КРИОЭЛЕКТРОННАЯ ТОМОГРАФИЯ НА ПРИМЕРЕ КЕРАТИНОЦИТОВ

ляет сохранить исходную топографию цитоплазма-

тического расположения клеточных органелл и их

микроструктуру.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена при финансовой поддерж-

ке НИЦ

«Курчатовский Институт» (приказ от

02.07.2020 №1056).

Рис. 4. а) томографический срез, показывающий взаимное рас-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

положение филаментов, гранул и микровезикул, и б) трехмер-

ная модель томограммы. Синим цветом окрашены мембраны,

1. K. Grunewald, O. Medalia, A. Gross et al. // Biophys

оранжевым - мембранные белки, красным - рибосомы, зеле-

Chem, 100 (2003), pp. 577-591.

ным - промежуточные филаменты; в) результаты субтомо-

2. J. Kurner, A.S. Frangakis, W. Baumeister // Science, 307

графического усреднения рибосом, мембранных белков и про-

(2005), pp. 436-438.

межуточных филаментов с разрешением 4 нм

3. G.E. Murphy, J.R. Leadbetter, G.J. Jensen et al. // Nature,

442 (2006), pp. 1062-1064.

кулы - рис. 4а). Результаты субтомографического

4. Brooke M.A., Nitoiu D., Kelsell D.P.

// Cell-cell

усреднения продемонстрировали, что даже при не-

connectivity: desmosomes and disease. J Pathol. 2012 Jan.;

большом количестве копий объектов, присутствую-

226(2):158-71.

щих на отдельных томограммах, их гетерогенности

5. M. Barcena, G.T. Oostergetel, W. Bartelink, et al. // Proc.

в естественном клеточном окружении и отсутствии

Natl. Acad. Sci. U.S.A., 106 (2009), pp. 582-587.

опорных меток (например, наночастиц золота, при-

6. A. de Marco, B. Muller, B. Glass et al. // PLoS Pathog, 6

меняемых для выравнивания томографической се-

(2010), p. e1001215.

рии), метод in situ криоэлектронной томографии

7. K. Grunewald, P. Desai, D.C. Winkler et al. // Science,

позволяет получить трехмерные реконструкции с

302 (2003), pp. 1396-1398.

разрешением около 4 нм. Дальнейшая оптимиза-

8. Камышинский Р.А., Чесноков Ю.М., Орехов А.С. //

ция экспериментальных методик позволит обеспе-

Кристаллография,

2020, т.

65,

№5, с.

774. DOI:

чить субнанометровое разрешение реконструкций.

10.31857/S0023476120050094.

9. B.F. McEwen, M. Marko // J Histochem Cytochem, 49

ВЫВОДЫ

(2001), pp. 553-564.

Продемонстрирована возможность получения

10. K. Grunewald, P. Desai, D.C. Winkler, et al. // Science,

трехмерных реконструкций тонких срезов витри-

302 (2003), pp. 1396-1398.

фицированных препаратов кератиноцитов, выра-

11. J. Liu, A. Bartesaghi, M.J. Borgnia, et al. // Nature, 455

щенных на микроскопических сеточках. Показано,

(2008), pp. 109-113.

что применение субтомографического усреднения

для повторяющихся структурных элементов по-

12. Romanova O.A., Tenchurin T.H., Demina T.S. et all. //

Cell Prolif. 2019, 52, 3.

зволяет получать экспериментальные данные с

высоким пространственным разрешением, а также

13. A. Ishida-Yamamoto, S. Igawa, M. Kishibe et al. // J

проводить анализ их взаимного расположения и

Dermatol, 2018, v. 45, №4, pp. 385-389.

конформационных состояний. Отсутствие воздей-

14. Wan W., Briggs J.A.G. // Methods in Enzymology. 1^st ed.

ствия жёстких фиксаторов и сохранение внутри-

Elsevier Inc., 2016, v. 579, p. 329-367.

клеточного водного баланса при использовании

15. Bharat T.A.M., Scheres S.H.W. // Nat. Protoc. 2016,

метода in situ криоэлектронной томографии позво-

v. 11, №11, p. 2054-2065.

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021