ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ И

СИСТЕМЫ ЖИЗНЕОБЕСПЕЧЕНИЯ

УДК 57.085

ЛИНИЯ ИММОРТАЛИЗОВАННЫХ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ

МЫШИ - НОВАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ КОЖИ

¹ Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, Россия

²ФГБУ «НМИЦ хирургии имени А.В. Вишневского» Минздрава России, Москва, Россия

^*E-mail: Panteleev_AA@nrcki.ru

Фибробласты являются основными резидентными клетками соединительной ткани. Многие патологические

процессы в коже сопровождаются нарушениями работы этих клеток. Например, плохо поддающиеся лечению

грубые рубцы образуются из-за чрезмерной сократительной активности фибробластов при заживлении ран и

ожогов. Традиционно в качестве экспериментальной модели in vitro используются либо первичные дермаль-

ные фибробласты, либо иммортализованные эмбриональные фибробласты мыши 3T3/NIH. Однако исполь-

зование первичных клеток ограничено из-за низкой способности к пассированию, а фенотип клеток 3T3/NIH

имеет мало общего со специфическим фенотипом дермальных фибробластов. Работа посвящена созданию

стабильной линии постнатальных дермальных фибробластов, эффективно сочетающей основные свойства

как первичных, так и иммортализованных клеток. Спонтанная иммортализация дермальных постнатальных

(P5) фибробластов мышей C57BL/6 в соответствии с протоколом 3T3 была использована для получения новой

линии dp3T3. Проведено сравнение dp3T3 с первичными фибробластами мыши и клетками 3T3/NIH с ис-

пользованием методов экспрессионного анализа (РТ-ПЦР, вестерн-блоттинг, иммуноцитохимия), кариотипи-

рования и оценки сократительной активности. По морфологии клеток, количеству хромосом, сократительной

способности, содержанию гладкомышечного актина, паттерну экспрессии ColI и уровням профибротических

цитокинов Lox и CTGF новая линия dp3T3 значительно ближе к первичным фибробластам, чем клетки линии

3T3/NIH, что делает их перспективной экспериментальной моделью для биоинженерии кожи человека и для

исследования раневой контракции.

ВВЕДЕНИЕ

остаются одной из самых сложных, актуальных и

Способность восстанавливать ткани после по-

обсуждаемых проблем в биомедицине [1].

вреждения является жизненно важной для любого

Фибробласты - основные резидентные клетки

организма. Особую значимость эта способность

соединительной ткани. Синтез и поддержание ма-

имеет для кожных покровов, защищающих орга-

трикса и, следовательно, формообразование, меха-

низм от воздействия агрессивных факторов внеш-

ника ткани, заживление - все эти жизненно важ-

ней среды. При этом главной проблемой является

ные функции находятся в их компетенции. Именно

максимально быстрое восстановление целостно-

с нарушениями деятельности фибробластов как

сти барьеров. Нормальный процесс заживления

основного эффекторного звена в конечном итоге

кожных ран включает в себя целый ряд последова-

связано формирование патологических рубцов и

тельно сменяющих друг друга событий, слаженное

контрактур при заживлении обширных кожных ран

взаимодействие сложных молекулярных каскадов

и ожогов. Известно, что формирование патологи-

и сигнальных путей, благодаря которым осущест-

ческих рубцов связано, в первую очередь, с транс-

вляется миграция клеток, синтез внеклеточного

формацией фибробластов в миофибробласты и их

матрикса и его ремоделирование. При отклонени-

чрезмерной активностью [2]. Миофибробласты об-

ях от нормального процесса заживления наблюда-

разуются в конце фазы пролиферации и отвечают

ется формирование грубых рубцов и контрактур.

за стягивание краев раны и синтез внеклеточного

Несмотря на успехи современной медицины и раз-

матрикса [3]. Основным маркером миофибробла-

витие новых технологий, рубцовые осложнения

стов является гладкомышечный актин - а (aSMA).

ЛИНИЯ ИММОРТАЛИЗОВАННЫХ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ МЫШИ...

Экспрессия aSMA регулируется различными сиг-

Таким образом, встает вопрос о получении более

нальными молекулами (TGF-b, CTGF) [4] и меха-

специализированной модели, позволяющей изу-

ническими свойствами микроокружения [5].

чать молекулярные механизмы заживления, харак-

В 1961 году Леонард Хейфлик показал, что при

терные именно для кожи.

длительном субкультивировании фетальных фи-

В ходе данной работы впервые была получена

бробластов человека в среде, богатой всеми не-

иммортализованная линия дермальных фибро-

обходимыми веществами, к 40-60 пассажам про-

бластов мыши с использованием 3T3-протокола

исходит постепенное старение клеточной линии,

из постнатальных дермальных фибробластов для

характеризующееся увеличением времени удвое-

изучения молекулярных и клеточных процессов,

ния популяции и накоплением клеточного дебриса.

происходящих в дерме кожи, а также для создания

Этот предел жизни клеточной популяции, называ-

тканеинженерных конструкций и для исследова-

емый лимитом Хейфлика, связан с постепенным

ния раневой контракции. Было проведено сравне-

укорочением теломерных участков хромосом в

ние полученной линии дермальных постнатальных

процессе митотического деления [6].

3T3 фибробластов (dp3T3) с линией первичных

Однако, было показано, что при длительном

дермальных фибробластов мыши (MDF) и линией

пассировании эмбриональные фибробласты мыши

3T3/NIH, и было отмечено, что по большинству па-

способны к спонтанной иммортализации. Впервые

раметров (кариотип, морфология, экспрессия мар-

линия иммортализованных фибробластов была по-

керов миофибробластов) новая линия более близка

лучена в 1963 году при культивировании эмбрио-

к MDF, чем линия 3T3/NIH.

нальных фибробластов мыши согласно 3T3-про-

токолу (3-day transfer, inoculum 3•105 cells) [7].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Спонтанная иммортализация эмбриональных фи-

Выделение, культивирование и иммортализация

бробластов мыши сопровождается мутациями в

мышиных дермальных фибробластов

генах ARF и p53, участвующих в регуляции кле-

Все эксперименты с животными проводили в

точного цикла [8, 9]. Иммортализованные фиброб-

строгом соответствии с требованиями Local Ethics

ласты никогда не имеют нормального диплоидного

Committee on Biomedical Research (NRC «Kurchatov

кариотипа, у них присутствует контактное ингиби-

Institute»; Protocol #5, April 5, 2017).

рование, они не формируют колонии в мягком ага-

Фибробласты выделяли из дермы пятидневных

ре и не формируют опухоли при инъекции имму-

мышат C57BL/6 (P5) как описано ранее [19] и куль-

нодефицитным мышам [10]. 3T3-протокол также

тивировали в соответствии с 3T3-протоколом [47].

использовался для иммортализации фибробластов

Клетки прошедшие через кризис культуры, выжив-

других видов животных: свиньи [11] и эмбриона

шие после пассажей p28-30 и сохранившие высо-

цыпленка [12].

кий пролиферативный потенциал были обозначены

Традиционно в экспериментальных исследо-

как фибробласты dp3T3.

ваниях физиологии кожи используется линия им-

Первичные мышиные эмбриональные фиброб-

мортализованных эмбриональных фибробластов

ласты получали как описано ранее [20] и использо-

мыши 3T3/NIH или культура первичных фибробла-

вали в качестве контрольных при сравнении.

стов [13, 14, 15]. К сожалению, обе модели обла-

Клетки культивировали в среде DMEM/F12 с

дают существенными недостатками. Использова-

50 мкг\л гентамицина, GlutaMAX™ Supplement

ние линии 3T3/NIH не позволяет учесть тканевую

(Gibco, MA, USA) и 10% FBS (Gibco). Для фиброб-

специфику. Также известно, что до определенного

ластов dp3T3 после пассажа p60 концентрация сы-

этапа эмбрионального развития у плода рубцов не

воротки была снижена до 5%.

образуется, следовательно, эмбриональные фибро-

бласты должны значительно отличаться от постна-

Сравнение контрактирующей

тальных [16, 17, 18]. При использовании в качестве

способности в коллагеновом геле

объекта исследования первичных культур клеток

3•10⁵ клеток dp3T3 (p47 и p76), 3T3/NIH или

взрослого организма, в том числе фибробластов,

MDF (p1) высевали в 2.25 мл коллагенового геля

недостатком является небольшая продолжитель-

(0.1 мг/мл) в лунку стандартного 6-тилуночного

ность жизни культуры, что требует большого ко-

планшета как описано ранее [21] и культивировали

личества материала, а также затрудняет стандарти-

в течении 7 дней. Ежедневно проводили измерения

зацию и проведение долгосрочных экспериментов.

и вычисляли площадь геля.

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

Ю.А. ЧИКИТКИНА и др.

MTT-тест

Таблица 2. List of antibodies used

MTT-тест в соответствии с инструкцией произ-

Вторичные антитела

Вторичные

водителя (Sigma, Darmstadt, Germany). Для иссле-

Первичные антитела

(иммуноцитохимия)

(вестерн-блот)

дования 3T3/NIH, MDF и dp3T3 клетки высевали

goat anti-mouse

goat anti-mouse HRP

αSMA (ab7817)

в лунки 48-луночного планшета в количестве 1•10⁴

(ab150113)

(G-21040)

клеток на лунку. Для оценки динамики пролифе-

collagen I type

donkey anti-rabbit

goat anti-rabbit HRP

рации dp3T3 фибробласты разных пассажей (p27,

(ab34710)

(ab150076)

(G-21234)

p33 и p45), также как фибробласты MDF и 3T3/NIH

goat anti-mouse

goat anti-mouse HRP

fibronectin (ab6328)

(ab150113)

(G-21040)

культивировали в одинаковых условиях, ежеднев-

lysyl oxidase

donkey anti-rabbit

goat anti-rabbit HRP

но проводя МТТ-тест. Полученные данные были

(ab31238)

(ab150076)

(G-21234)

представлены в виде графиков (рис. 1б).

donkey anti-rabbit

goat anti-rabbit HRP

CTGF (ab6992)

(ab150076)

(G-21234)

ПЦР в реальном времени

Клетки высевали в лунку стандартного 6-тилу-

goat anti-mouse HRP

β-actin (sc-58673)

(G-21040)

ночного планшета и лизировали по достижении

конфлюэнтности. Тотальную РНК выделяли, ис-

ICC and immunofluorescence (IF) protocols). Ядра

пользуя реагент ExtractRNA (Евроген, Москва).

докрашивали DAPI. После окрашивания препа-

cDNA синтезировали с использованием набора

раты заключали в Immu-Mount medium (Thermo

«MMLV RT kit» (Евроген) в соответствии с про-

Scientific, PA, USA) и просматривали на микроско-

токолом производителя. ПЦР в реальном времени

пе AxioImager-2 Research Microscope (Zeiss). Спи-

проводили с использованием qPCRmix-HS SYBR

сок использованных антител представлен в табл. 2.

(Евроген) на амплификаторе CFX96TM Real-Time

System C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad). Список ис-

Кариотипирование

пользованных праймеров представлен в табл. 1.

Образцы метафазных хромосом приготовляли

как описано [22] с незначительными изменениями.

Иммуноцитохимия и

Подсчет хромосом проводили для 30 метафазных

окрашивание фаллоидином

пластинок при помощи микроскопа Axio Imager 2

Фибробласты

(5‧10⁴ клеток) культивировали

Research Microscope (Zeiss) и программного обе-

на покровных стеклах в течение 2 дней и фикси-

спечения ImageJ (NIH; https://imagej.nih.gov/ij/).

ровали 4% раствором параформальдегида в ФСБ

10 минут. Иммуноцитохимическое окрашивание

Вестерн-блот

и окрашивание с помощью Phalloidin-iFluor 488

Конфлюэнтные культуры клеток MDF, 3T3/NIH

Reagent (ab176753, Abcam, MA, USA) проводили в

и dp3T3 лизировали в 400 мкл буфера RIPA, со-

соответствии с протоколом производителя (Abcam

держащего 200 мM PMSF (Sigma). Концентрацию

Таблица 1. Перечень основных характеристик передатчиков S-диапазона

Ген

Номер

Прямой праймер

Обратный праймер

Ссылка

Wei B., Cai L., Sun D. et al. //

Acta2

NM_007392.3

GAAGGAATAGCCACGCTCAG

TGCTGTCCCTCTATGCCTCT

Molecules. 2014. №19 (4).

С. 4967-4985.

Kim S.W., Hur W., Li T.Z. et

Col1a1

NM_007742.4

CTGCTGGTGAGAGAGGTGAAC

ACCAAGGTCTCCAGGAACAC

al. //,. Exp Mol Med. 2014, 46,

e92.

Velden J.L., Alcorn J.F.,

Guala A.S. et al. // Am J Respir

Fn1

NM_010233.2

GTGTAGCACAACTTCCAATTACGAA

GGAATTTCCGCCTCGAGTCT

Cell Mol Biol. 2011. №44 (4).

С. 571-581.

Varelas X., Samavarchi-

Tehrani P., Narimatsu M. et

Ctgf

NM_010217.2

GGGCCTCTTCTGCGATTTC

ATCCAGGCAAGTGCATTGGTA

al. // Dev Cell. 2010. №19 (6).

С. 831-844.

PrimerBank: 6671509a1

Actb

NM_007393.5

GGCTGTATTCCCCTCCATCG

CCAGTTGGTAACAATGCCATGT

https://pga.mgh.harvard.edu/

primerbank/

Lox

NM_010728.3

CCAAGGGACATCGGACTTCTTAC

TGAATTCGTCCATGCTGTGGTA

Designed in house

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

ЛИНИЯ ИММОРТАЛИЗОВАННЫХ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ МЫШИ...

белка в лизатах определяли методом Бредфорда.

сажа, то есть уменьшалось время удвоения популя-

Образцы наносили в количестве 50-100 мкг белка

ции. Мы предполагаем, что эти изменения связаны

на дорожку 6-7% полиакриламидного геля. После

с процессом иммортализации.

фореза проводили перенос на PVDF-мембрану.

Для подтверждения перехода фибробластов от

Перед окрашиванием мембраны антителами

нормального к иммортализованному состоянию,

проводили блокировку в 5% растворе обезжирен-

при помощи MTT-теста оценивали уровень сум-

ного молока в PBST (PBS - 0.1% Tween) в течение

марной метаболической активности клеток. Коли-

12 часов при 4°C. Список использованных антител

чество клеточных делений в культуре ограничено

представлен в табл. 2.

(лимит Хейфлика). Суммарная метаболическая

активность первичной культуры постепенно сни-

Статистический анализ

жается в соответствии с уменьшающимся количе-

Результаты представлены как среднее±стан-

ством клеток. При иммортализации культуры это-

дартное отклонение. Статистический анализ про-

го не происходит, поскольку клетки продолжают

водили, используя непараметрический критерий

активно делиться. Для анализа уровня клеточного

Манна-Уитни (OriginPro 8.0; MA, USA). Величина

метаболизма были выбраны пассажи 27, 33, 45 по-

p<0.05 рассматривалась как соответствующая ста-

лученной нами линии dp3T3 и классическая линия

тистически значимой разнице.

3T3/NIH. (рис. 1). Для каждой временной точки

было использовано 6 биологических повторностей,

РЕЗУЛЬТАТЫ

на графике показано среднее значение по шести

1. Получение линии dp3T3 фибробластов

точкам и стандартное отклонение.

Фибробласты выделили из дермы новорожден-

Видно, что дермальные постнатальные фиброб-

ной мыши (P5) и вели согласно 3T3-протоколу

ласты dp3T3 на 27 пассаже ещё не прошли транс-

(3-day transfer, inoculum 3•10⁵ cells) [7]. Согласно

формацию, и суммарная метаболическая актив-

протоколу, фибробласты, выжившие и сохранив-

ность образца заметно снижена по сравнению 33

шие proliferative capacity после 25-30 пассажей,

и 45 пассажами. Динамика изменения суммарной

можно считать иммортализованными [7]. В нашем

метаболической активности образца dp3T3 фибро-

опыте было отмечено, что на 27 пассаже происхо-

бластов на 33 и 45 пассажах сходна, что говорит о

дил «кризис культуры»: появлялось большое коли-

стабилизации полученной линии (рис. 1б). Пока-

чество клеточного дебриса, резко замедлялся рост

затели MTT-теста для дермальных иммортализо-

клеток, ускорялся процесс закисления среды. По-

ванных фибробластов значительно выше, чем для

сле пересева (p28-p30) в культуре пропадали при-

фибробластов 3T3/NIH.

знаки «кризиса», и время достижения монослоя

Параллельно был проведен анализ времени

уменьшилось по сравнению с культурой до 27 пас-

удвоения: скорость пролиферации dp3T3 фиброб-

Рис. 1. Получение и характеристика линии dp3T3 фибробластов. а) Сравнение морфологии dp3T3 фибробластов, MDF и 3T3/NIH

фибробластов после двух дней культивирования. ФК - фазовый контраст, 10x, 20x, 40x - увеличение объектива. Масштабный

отрезок - 100 мкм. б) Результаты MTT-теста для дермальных фибробластов на разных пассажах и линии 3T3/NIH, показано

среднее значение и стандартное отклонение

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

Ю.А. ЧИКИТКИНА и др.

ластов (p50) выше (время удвоения 18,6 ± 1,6 часа),

сократительной способности фибробластов dp3T3

чем скорость пролиферации 3T3/NIH (время удвое-

с 3T3/NIH и MDF анализировали уровень РНК и

ния 24,8 ± 1,2 часа) и скорость пролиферации MDF

белка αSMA.

(время удвоения 28 ± 4,75 часов).

Результаты ПЦР в реальном времени выявили

значительную разницу в экспрессии αSMA: в 3T3/

2. Характеристика линии dp3T3 фибробластов

NIH фибробластах экспрессия αSMA ниже, чем в

a. Кариотипирование линии dp3T3 фибробластов.

dp3T3 фибробластах и в MDF (рис. 2г). Результа-

При кариотипировании линии dp3T3 было про-

ты Вестерн-блота подтверждают данные ПЦР в ре-

анализировано 30 метафазных пластинок. Обнару-

альном времени: количество белка αSMA в dp3T3

жено, что число хромосом варьирует от 39 до 59,

фибробластах и в MDF выше, чем в 3T3/NIH фи-

среднее количество хромосом 50, медиана 52 хро-

бробластах (рис. 2в). Кроме того, было проведено

мосомы. Согласно литературным данным, карио-

окрашивание антителами к αSMA. Данные им-

тип линии иммортализованных эмбриональных

муноцитохимии подтвердили данные ПЦР и Ве-

фибробластов 3T3/NIH состоит из 52-82 хромосом

стерн-блота, и было отмечено, что в культуре не

(среднее число 75) [23]. Таким образом, кариотип

все клетки положительны по αSMA. В фибробла-

полученной линии dp3T3 ближе к нормальному ка-

стах 3T3/NIH белок αSMA расположен диффузно

риотипу мыши, чем кариотип линии 3T3/NIH .

в цитоплазме клеток, а в dp3T3 и в MDF он нахо-

b. Сравнение морфологии фибробластов линий

дится в составе стресс-фибрилл (рис. 2а) - струк-

dp3T3, 3T3/NIH и MDF.

тур, являющихся характерной чертой миофиброб-

Морфология dp3T3 фибробластов и эмбри-

ластов, обладающих выраженной сократительной

ональных фибробластов 3T3/NIH различна. По

способностью. Таким образом, сравнительный

морфологии 3T3/NIH фибробласты ближе к пер-

анализ показал, что по экспрессии αSMA получен-

вичным мышиным эмбриональным фибробластам

ная линия ближе к первичным дермальным фибро-

стадии E18, а dp3T3 - к первичным дермальным

бластам мыши, чем линия 3T3/NIH.

фибробластам мыши (MDF). Как MDF, так и dp3T3

Основным методом оценки способности фибро-

фибробласты имеют веретенообразную форму, в

бластов к контракции является сокращение колла-

то время как фибробласты 3T3/NIH сильнее рас-

геновых гелей in vitro.

пластываются по субстрату, а формы клеток более

Для сравнения сократительной способности ис-

округлые (рис. 1а). Окрашивание с использовани-

следуемых линий, фибробласты сеяли в коллагено-

ем фаллоидина после двух дней культивирования

вые гели и культивировали в течение 7 дней. Для

показало, что в 3T3/NIH фибробластах фибрил-

посева были выбраны MDF p1, 3T3/NIH, а также

лярный актин сосредоточен, главным образом,

dp3T3 p47 и p76 (рис. 2б).

на ведущем краю ламеллоподий и диффузно рас-

По графикам зависимости площади коллаге-

пределен в цитоплазме, тогда как у MDF и dp3T3

нового геля от времени культивирования видно,

филлоподии преобладают над ламеллоподиями, и в

что фибробласты, полученные из постнатальной

цитоплазме выявляются характерные сократитель-

дермы (MDF), обладают большей сократительной

ные стресс-фибриллы гладкомышечного актина (то

способностью, чем линия эмбриональных фибро-

есть, наблюдается большее сходство с «сократи-

бластов 3T3/NIH. Линия dp3T3 по своей сократи-

тельным» фенотипом) (рис. 1а).

тельной способности сходна с MDF. Также сокра-

Таким образом, полученная нами линия dp3T3

тительная способность dp3T3 фибробластов двух

фибробластов по морфологическим характеристи-

разных пассажей (p47 и p76) сходна, что говорит о

кам ближе к линии MDF, чем классическая линия

стабильности полученной линии.

3T3/NIH.

b) Коллаген I типа

3. Сравнительный анализ уровня

Результаты ПЦР в реальном времени не выяви-

экспрессии некоторых ключевых генов, играющих

ли статистически значимой разницы в экспрессии

важную роль при заживлении ран, в трех линиях

коллагена I между фибробластами dp3T3, MDF и

фибробластов (dp3T3, 3T3/NIH и MDF).

3T3/NIH (рис. 2д). Данные окрашивания культу-

ры антителами к коллагену I подтвердили данные

a) Гладкомышечный актин-α и контрактирующая

ПЦР в реальном времени. Интересно, что в отли-

способность фибробластов

чие от распределения коллагена I в фибробластах

Белок гладкомышечный актин-α (αSMA) - ос-

3T3/NIH, где он детектируется в одинаковом ко-

новной маркёр миофибробластов. Для сравнения

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

ЛИНИЯ ИММОРТАЛИЗОВАННЫХ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ МЫШИ...

Рис. 2. Анализ уровня экспрессии αSMA и коллагена I в фибробластах dp3T3, MDF и 3T3/NIH. а) Фибробласты после двух дней

культивирования, иммуноцитохимическое окрашивание антителами к αSMA, 20x, 40x - увеличения объектива. Масштабный

отрезок - 100 мкм. б) Сравнение контрактирующей способности фибробластов dp3T3, MDF и 3T3/NIH, на графике указано

среднее значение площади коллагенового геля и стандартное отклонение. в) Результаты Вестерн-блота по количеству белка

aSMA, стандартизация по b-актину. г) Результаты ПЦР в реальном времени по aSMA, стандартизация по β-актину, разница

статистически значима при p<0.05. д) Результаты ПЦР в реальном времени по коллагену I, стандартизация по β-актину, не

обнаружено статистически значимой разницы при p<0.05. е) Иммуноцитохимическое окрашивание антителами к коллагену I,

20x, 40x - увеличения объектива. Масштабный отрезок - 100 мкм

личестве во всех фибробластах, в культуре dp3T3

d) Лизилоксидаза

фибробластов отмечалась гетерогенность: на тех

Иммуноцитохимическое окрашивание антите-

участках, где плотность культивирования выше,

лами к lysyl oxidase (Lox) после двух дней куль-

сила сигнала значительно ниже, чем на участках с

тивирования выявило значительную разницу в ко-

меньшей плотностью культивирования (рис. 2е).

личестве белка в трех линиях клеток: наибольшее

количество белка выявляется в полученной нами

c) Фибронектин

линии dp3T3 фибробластов, наименьшее - в ли-

По данным ПЦР в реальном времени экспрес-

нии фибробластов 3T3/NIH (рис. 3а). Данные Ве-

сия фибронектина в эмбриональных фибробла-

стерн-блота подтверждают результаты окрашива-

стах 3T3/NIH значительно выше, чем в MDF и

ния (рис. 3в). Результаты ПЦР в реальном времени

dp3T3 фибробластах. Данные иммуноцитохимии

несколько отличаются от данных Вестерн-блота

и данные Вестерн-блота совпадают, но несколь-

и иммуноцитохимии: наиболее высокий уровень

ко отличаются от данных реал-тайм-ПЦР для фи-

РНК Lox наблюдается в MDF, а самый низкий - в

бронектина (рис. 3б, в): большее количество белка

полученной нами линии dp3T3 (рис. 3б). Это согла-

детектируется в MDF, чуть меньше в 3T3/NIH и

суется с полученными ранее данными о том, что

минимальное количество - в dp3T3 фибробластах.

постнатальные фибробробласты более склонны к

В dp3T3 фибробластах фибронектин диффузно

приобретению фенотипа миофибробластов, чем

распределен в цитоплазме клеток, а в культуре эм-

эмбриональные клетки (рис. 2а).

бриональных фибробластов 3T3/NIH и в культуре

Во всяком случае, по количеству белка Lox

MDF фибронектин находится в основном вне кле-

dp3T3 ближе к MDF, чем к эмбриональным клет-

ток, и в меньшем количестве в клетках (рис. 3а).

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

Ю.А. ЧИКИТКИНА и др.

кам, что возможно является следствием сохране-

ОБСУЖДЕНИЕ

ния ими тканеспецифических характеристик.

3T3-протокол использовали для получения им-

мортализованных линий эмбриональных фибро-

i) CTGF

бластов мыши, цыпленка [12] и постнатальных

По полученным нами данным иммуноцитохи-

фибробластов свиньи [11]. В данной работе мы

мического окрашивания и Вестерн-блота видно,

представили результаты получения иммортали-

что количество белка CTGF в MDF и фибробластах

зованных дермальных фибробластов мыши, как

dp3T3 примерно одинаково, и намного выше, чем

наиболее распространенного модельного объек-

в фибробластах 3T3/NIH (рис. 3а, в), что находит-

та. В процессе работы над получением линии по

ся в соответствии с данными, полученными ранее

3T3-протоколу на p27 мы наблюдали наступление

(Colwell et al., 2006). По данным ПЦР в реальном

кризиса в культуре фибробластов, а после него -

времени уровень экспрессии CTGF самый высокий

увеличение пролиферативного потенциала. Таким

в MDF, средний - в dp3T3 и наименьший в линии

образом, учитывая характер поведения культуры

эмбриональных фибробластов 3T3/NIH (рис. 3б).

в момент, являющийся согласно протоколу мо-

ментом перехода клеток к иммортализованному

состоянию, а так же то, что на момент заверше-

ния работы наша линия проходила 100 пассаж, и

в культуре не наблюдалось признаков старения,

полученную нами линию клеток можно считать

иммортализованной.

Согласно литературным данным, спонтанная

иммортализация эмбриональных фибробластов

сопровождается возникновением мутаций в гене

p53, что приводит к снятию ареста клеточного

цикла [8, 9]. В нашем случае Вестерн-блот не вы-

явил достоверной разницы по количеству белка

р53 между линиями, таким образом, для оценки

имеющихся нарушений требуются дальнейшие

исследования.

Кариотип является одной из основных ха-

рактеристик и наиболее точным критерием для

идентификации линий клеток. Полученные нами

клетки, как и другие иммортализованные фибро-

бласты [10] не имеют нормального диплоидного

кариотипа и не формируют колонии в мягком ага-

ре. Анализ кариотипа dp3T3 показал, что среднее

число хромосом 52 (медиана 50), что даже ближе

к норме (40 хромосом), чем у классической линии

3T3/NIH (52-82 хромосомы). Кроме того, анализ

морфологии трех линий клеток (3T3/NIH, MDF,

dp3T3) показал, что и по морфологическим харак-

теристикам фибробласты линии dp3T3 ближе к

MDF, чем 3T3/NIH фибробласты.

Рис. 3. Сравнительный анализ уровня экспрессии FN, Lox,

Уровень и паттерн экспрессии αSMA в фибро-

CTGF, играющих важную роль при заживлении ран, в трех ли-

бластах напрямую связан с их способностью при-

ниях фибробластов (dp3T3, 3T3/NIH и MDF). а) Результаты

обретать характерный для миофибробластов со-

иммуноцитохимического окрашивания фибробластов dp3T3,

кратительный фенотип, главной морфологической

3T3/NIH и MDF антителами к FN, Lox, CTGF в 3T3/NIH,

чертой которого является наличие стресс-фибрилл

dp3T3 и MDF, 2 дня культивирования. Увеличение объектива -

40х, масштабный отрезок 100 мкм. б) Данные ПЦР в реальном

гладкомышечного актина-α. Следует отметить,

времени, стандартизация по b-актину, различия статистиче-

что традиционное культивирование на жестком

ски значимые при p<0.05. в) Данные Вестерн-блота, стандар-

субстрате (пластик) способствует формированию

тизация по b-актину

сократительного фенотипа, причем для фиброб-

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

ЛИНИЯ ИММОРТАЛИЗОВАННЫХ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ МЫШИ...

ластов его выраженность зависит от плотности

клеток и во внеклеточном матриксе. Фибронектин

культивирования: чем плотность ниже, тем больше

экспрессируется в большом количестве разных ти-

доля αSMA-положительных клеток. Иммуноцито-

пов клеток и играет важную роль в клеточной ад-

химия подтвердила эти наблюдения для всех трех

гезии и миграции. Фибронектин участвует в про-

исследованных линий. Причем по количеству и ло-

цессах морфогенеза, процессах заживления ран

кализации этого белка dp3T3 также ближе к MDF

и свертывания крови. Содержание фибронектина

(рис. 2).

значительно выше в дерме плода, а в дерме взрос-

Для функциональной оценки контрактирующей

лого организма фибронектин выявляется в неболь-

способности использовали метод культивирования

шом количестве в зоне дермально-эпидермальных

в коллагеновых гелях, подробно описанный Бел-

контактов [16].

лом в 1979 году [21]. По графикам зависимости

Известно, что в процессе образования патоло-

площади коллагенового геля от времени культиви-

гических рубцов происходит чрезмерный синтез

рования видно, что фибробласты, полученные из

молекул внеклеточного матрикса, в том числе и

постнатальной дермы (MDF), обладают большей

фибронектина [28]. Последний служит связующим

сократительной способностью, чем линия эмбри-

звеном/мостом между клеткой/сократительным

ональных фибробластов 3T3/NIH (рис. 2). Данные

фибриллярным аппаратом клетки и окружающим

полностью согласуются с полученными ранее: на

матриксом (через интегрины). В полученной нами

культуре фибробластов кролика было показано, что

линии уровень экспрессии фибронектина (РНК и

контрактирующая способность эмбриональных

белка) намного ниже, чем в 3T3/NIH и MDF. Дан-

фибробластов ниже, чем контрактирующая способ-

ные ПЦР в реальном времени, полученные нами,

ность дермальных фибробластов [24].

согласуются с данными Coolen et al. [16]: экспрес-

Коллаген является основным компонентом вне-

сия фибронектина в эмбриональных дерме значи-

клеточного матрикса дермы, составляя от 70% до

тельно выше, чем в постнатальной. Отмечаются

80% от сухой массы кожи. Существует несколько

различия и в его распределении в клетке: в dp3T3

типов коллагена, кодируемых разными генами, но

фибробластах фибронектин диффузно распределен

преобладающими в соединительной ткани явля-

в цитоплазме, а в культуре эмбриональных фибро-

ются коллагены I, II и III типа. Коллагены играют

бластов 3T3/NIH и в культуре MDF фибронектин

важную роль в процессе заживления ран и кон-

находится в основном вне клеток, и в меньшем

тролируют форму клеток, их дифференцировку,

количестве в клетках, что говорит о его активном

миграцию и синтез ряда белков [25]. На началь-

синтезе и немедленной секреции в межклеточное

ных этапах заживления раны миофибробласты

пространство (рис. 3). Как эта разница в нашем

синтезируют коллаген III, который впоследствии

случае связана со способностью клеток к мигра-

замещается на коллаген I. Было показано, что в

ции, формированию внеклеточного матрикса - этот

составе фиброзной ткани преобладает коллаген I

вопрос требует дальнейших исследований.

и в небольшом количестве присутствует коллаген

Лизилоксидазы семейства Lox обеспечивают

VI [26]. Согласно литературным данным стати-

возникновение сшивок между коллагеновыми и

стически значимой разницы в уровне экспрессии

эластиновыми фибриллами межклеточного ма-

коллагена I в фетальных и постнатальных фибро-

трикса. В литературе встречаются противоречивые

бластах человека не обнаруживается [27]. Так как

данные о том, какую роль играет повышение экс-

коллаген I типа является таким же маркером мио-

прессии Lox в клетках. В некоторых работах отме-

фибробластов, как и αSMA, весьма вероятно, что

чается, что повышение экспрессии Lox характерно

количество белка коллагена I типа также зависит от

для раковых клеток и способствуют метастазиро-

плотности культивирования: чем плотность выше,

ванию [29]. Другие исследователи считают, что

тем белка меньше. Действительно, оказалось, что

наоборот, повышение экспрессии Lox приводит к

линии фибробластов 3T3/NIH, MDF и dp3T3 близ-

подавлению роста опухолей [30]. Ингибирование

ки по уровню экспрессии коллагена I типа, но зави-

лизилоксидаз Lox и LoxL приводит к снижению

симость количества белка коллагена от плотности

жесткости субстрата и уменьшению количества

культивирования наблюдается только в нашей ли-

миофибробластов [31]. По количеству белка Lox

нии dp3T3 фибробластов и MDF (рис. 2).

клетки dp3T3 вновь оказались ближе к нормаль-

Фибронектин

- гликопротеин, представлен-

ным фибробластам дермы, чем к эмбриональным

ный в растворимой димерной форме в плазме и в

3T3/NIH (рис. 3). Этот результат кажется вполне

димерной или полимерной форме на поверхности

оправданным, с учетом того, что в эмбриогенезе

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021

Ю.А. ЧИКИТКИНА и др.

созревание фибриллярных белков межклеточно-

нейшего развития: планируется продолжить анализ

го матрикса дермы протекает на поздних стадиях

полученной клеточной линии, в том числе необхо-

развития [32].

димо оценить ее опухолевый потенциал, миграци-

Белок CTGF, также известный как CCN2, при-

онные свойства клеток, а также найти адекватный

надлежит к семейству белков CCN1-CCN6, игра-

критерий оценки степени иммортализации линии,

ющих важную роль в контроле экспрессии моле-

так как в литературе достаточных данных по этому

кул внеклеточного матрикса. Белок CTGF активно

вопросу нет.

экспрессируется в процессе развития организма и

Работа поддержана внутренним финансирова-

участвует в контроле клеточной адгезии, проли-

нием НИЦ Курчатовский институт (приказ 1058), а

ферации, выживания, миграции и продукции вне-

также грантом РФФИ № 19-015-00306.

клеточного матрикса многими типами клеток [33],

играет важную роль в заживлении ран. Экспрессия

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

CTGF индуцируется через TGF-β - сигнальный

1. Strong A.L., Neumeister M.W., Levi B. // Clin Plast Surg.

путь. Было показано, что ингибирование CTGF с

2017, №44(3), p. 635-650.

использованием антисмысловых олигонуклеоти-

2. Darby I.A, Zakuan N., Billet F., Desmouliere A. // Cell

дов способствует нормальному процессу зажив-

Mol Life Sci. 2016, №73(6), p. 1145-1157.

ления через подавление чрезмерной активности

3. Gurtner G.C., Werner S., Barrandon Y. et al. // Nature.

миофибробластов, уменьшение экспрессии ткане-

2008, №453(7193), p. 314-321.

вого ингибитора протеиназ TIPM-1 и коллагенов

4. Hinz B. // J Invest Dermatol. 2007, №127(3), p. 526-537.

I и III, но не препятствует затягиванию раны [34].

5. Yeung T., Georges P.C., Flanagan L.A. et al. // Cell Motil

Интересно, что мыши, дефицитные по CTGF, раз-

Cytoskeleton. 2005, №60(1), p. 24-34.

виваются нормально, и отсутствие CTGF не влия-

6. Hayflick L., Moorhead P.S. // Exp Cell Res. 1961, №25(3),

ет на заживление раны, что предполагает присут-

p. 585-621.

ствие какого-то компенсаторного механизма [35].

7. Todaro G.J., Green H. // J Cell Biol. 1963, №1,

Ранее было проведено сравнение эмбриональных

p. 299-313.

фибробластов мыши на разных стадиях развития

8. Harvey D.M., Levine A.J. // Genes Dev. 1991, №5(12B),

и фибробластов, выделенных из дермы взрослой

p. 2375-2385.

мыши, и показано, что уровень экспрессии CTGF

9. Zindy F., Eischen C.M., Randle D.H. et al. // Genes Dev.

в эмбриональных фибробластах мыши на стадиях

1998, №12(15), p. 2424-2433.

E17 и E19, ниже, чем в фибробластах, выделенных

10. Stepanenko A.A., Kavsan V.M. // Tsitol Genet. 2012,

из постнатальной дермы [36]. По нашим данным,

№46(2), p. 36-75.

действительно, зрелой формы белка CTGF намно-

го меньше в эмбриональных 3T3/NIH, чем в dp3T3

11. Oh H.Y., Jin X., Kim J.G. et al. // BMC Cell Biol. 2007,

№8, p. 20.

или MDF (рис. 3). Таким образом, уровень экспрес-

сии CTGF, одного из профибротических цитоки-

12. Christman S.A., Kong B.W., Landry M.M. et al. // BMC

нов, согласуется с полученными нами данными от-

Cell Biol. 2006, №7, p. 27.

носительно способности исследуемых клеточных

13. Immonen J.A., Zagon I.S., McLaughlin P.J. // Exp Biol

линий дифференцироваться в миофибробласты.

Med. 2014, №239(10), p. 1300-1309.

Обобщая полученные данные, следует отме-

14. Sakar M.S., Eyckmans J., Pieters R. et al. // Nat

тить, что по всем пунктам dp3T3 имеют боль-

Commun. 2016, №7, p. 11036.

шее сходство с MDF, чем с 3T3/NIH, что говорит

15. Thangavel P., Ramachandran B., Kannan R. et al. //

в пользу сохранения ими тканеспецифических

J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2016, №105B,

характеристик.

p. 1401-1408.

Работа по созданию новой клеточной линии

16. Coolen N.A., Schouten K.C.W.M., Middelkoop E. et al. //

является сложной и многокомпонентной задачей,

Arch Dermatol Res. 2010, №02(1), p. 47-55.

требующей проведения большого количества те-

17. Ellis I., Banyard J., Schor S.L. // Development. 1997,

стов. Нами был успешно осуществлён первый этап

№124(8), p. 1593-1600.

этой важной и актуальной для дальнейшего разви-

18. Moulin V., Tam B.Y., Castilloux G. et al. // J Cell Physiol.

тия исследований кожи работы - получение линии

2001, №188(2), p. 211-222.

иммортализованных дермальных постнатальных

19. Takashima A. Establishment of fibroblast cultures. Curr

фибробластов. Вместе с тем, работа требует даль-

Protoc Cell Biol. 2001, №2(2.1).

ВЕСТНИК ВИТ «ЭРА», том 2, номер 2, 2021