Почвоведение, 2023, № 6, стр. 730-744

ВВЕДЕНИЕ

Почвоведение, как наука, изучающая почву в виде самостоятельного обособленного природного тела, охватывает широкий спектр вопросов, связанных с ее генезисом, распространением и использованием. Почва является не только корнеобитаемым слоем земной поверхности, но и представляет собой место обитания, питания, развития и размножения многих микроорганизмов. Наибольшее разнообразие почвенных прокариот приурочено к субтропической и тропической зоне, а именно муссонным тропическим лесам Южной Америки, Африки и Юго-Восточной Азии [23]. Изучение микробных сообществ целинных почв представляется важным из-за усиливающейся разнообразной антропогенной нагрузки на природные биогеоценозы. Одним из лидеров по темпам развития экономики на территории Юго-Восточной Азии является Вьетнам, который представляет собой аграрное государство с развивающимся промышленным сектором. Значительные площади земельного фонда страны в XX в. подвергались сильнейшему антропогенному воздействию, поэтому изучение разнообразия почвенных организмов с целью сохранения сообществ в ненарушенных почвах заповедников и национальных парков представляется актуальным.

Одной из наиболее широко обследованных особо охраняемых природных территорий (ООПТ) Вьетнама является заповедник Донг Най и его сектор национальный парк Кат Тьен. На протяжении всего XX в. заповедник Донг Най подвергался антропогенному воздействию: в течение Американско-Вьетнамской войны на территории национального парка Кат Тьен были неоднократно применены дефолианты и обработка территории напалмовым огнем, затем значительная часть оставшихся лесов была подвергнута очистительной вырубке. Только в конце столетия флора национального парка начала возвращаться к исходному состоянию за счет интенсивных лесовосстановительных мероприятий [5, 9, 23]. Большая часть исследований биологической направленности в последние 10 лет проводится именно на территории биосферного заповедника Донг Най ввиду высокого биологического разнообразия и обилия местообитаний различных организмов, в частности микроскопических грибов и актиномицетов, тогда как другие ООПТ Вьетнама изучены в гораздо меньшей степени [1, 6, 8, 17]. Практически не проводились микробиологические исследования почв и сопряженных субстратов, включающие как классические (посев на питательные среды, учет численности и биомассы отдельных групп микроорганизмов прямым микроскопическим методом), так и современные молекулярные методы (анализ таксономического разнообразия на основании баркодинга гена 16SрРНК, RT-ПЦР, FISH) микробиологии, на других ООПТ Вьетнама.

Цель работы – получение комплексной характеристики прокариотных сообществ зональных и интразональных почв и сопряженных субстратов ООПТ Вьетнама на основании классических и современных методов микробной экологии.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на территории заповедников и национальных парков: Бинь Чау Фуок Буу, Сонгхинь, Кон Тю Ранг, Донгнай, Сонгтхань, а также экологической станции Тропического центра Дамбей. Объектами исследования служили образцы зональных (красно-желтых гумусно-ферралитных) и интразональных (аллювиальных) почв и сопряженных субстратов (растительный опад на поверхности почвы), а также “подвешенная почва” из корзинок эпифитных папоротников на стволах деревьев. Координаты точек отбора образцов, типы почв и экотопы, сформированные в данных точках, представлены в табл. 1.

На территории Вьетнама зарегистрировано несколько типов почв, образованных в условиях среднегодового колебания увлажненности и высоких температур, распространение которых зависит, в основном, от положения в рельефе и почвообразующих пород [23]. Наиболее широко используются в земледелии зональные ферралитные и интразональные аллювиальные почвы. Гораздо реже встречаются на южных территориях Вьетнама мангровые засоленные и болотные почвы.

Ферраллитные почвы (Ferralsols (WRB)) развиваются под лесной растительностью условиях влажного субтропического климата на продуктах выветривания основных изверженных пород [2, 15]. Общая площадь ферралитных почв в мире оценивается около 750 млн га, они приурочены, в основном, к влажным тропическим лесам Америки, Африки и Юго-Восточной Азии. При общих благоприятных физических свойствах данные почвы обладают низкими показателями кислотности (рН 3.8–5.6) и достаточно низким уровнем плодородия (С_орг 1.5–5.7%) [16]. Образцы исследованных равнинных ферралитных почв были, в среднем, менее гумусированными (2.2–2.8%) и имели более кислую реакцию почвенного раствора (рН 4.0–4.2) по сравнению с горными ферралитными почвами (4.6–5.1% гумуса, рН 5.3–5.5).

Аллювиальные почвы (Fluvisols) имеют повсеместное распространение во всех климатических зонах [20]. На территории заповедников Вьетнама особо место занимают аллювиальные почвы с протекающим в них процессом формирования темно-гумусовых аккумуляций (бурые аллювиальные почвы) [21]. Аллювиальные бурые почвы имеют более высокое содержание С_орг в гумусовых горизонтах 4.3–6.8% по сравнению с зональными ферралитными почвами и, в среднем, более кислую реакцию среды (pH 4.0–4.6). Изученные аллювиальные почвы характеризовались содержанием C_орг, варьировавшим в диапазоне от 4.8 до 5.2%, а также несколько менее кислой реакцией среды (рН 4.5–5.1).

Растительный опад, отобранный с поверхности исследованных почв, формировался разнообразными видами растений, характерными для муссонных лесов Вьетнама. Опад с поверхности интразональных почв был сформирован деревьями рода Lagerstroemia (Lythraceae (сем. Дербенниковые)) (Бинь Чяу Фуок Буу); деревьями из семейств Dilleniaceae (Диллениевые), Anardicaceae (Анакардиевые), Euphorbiaceae (Молочайные), Fagaceae (Буковые) (Сонгхинь); деревьями Terminalia sp. (Терминалия, сем. Комбретовые), Aglaia odorata var. Gigantean (Аглая душистая, сем. Мелиевые) (Пу Хоат); деревьями Hydnocarpus anthelmintica (Гиднокарпус, сем. Kiggelariaceae (Киггелариевые)), Livistonia saribus (сем. Arecaceae (Пальмовые)) (Нам Кат Тьен, Донгнай). Опад с поверхности зональных ферралитных почв включал в себя растительный материал деревьев из семейств Dipterocarpaceae (Диптерокарповые), Clusiaceae (Клузиевые), Ebenaceae (Эбеновые), Fabaceae (Бобовые) (Кон Тю Ранг); деревьев из семейств Dipterocarpaceae (Диптерокарповые), Myrthaceae (Миртовые), Anacardiaceae (Анакардиевые), Euphorbiaceae (Молочайные), Fagaceae (Буковые) (Сонгхинь). Растительный опад состоял из слабо или частично фрагментированных листьев и веток на разных стадиях разложения.

Специфической особенностью растительных сообществ тропических вечнозеленых лесов является формирование “подвешенной почвы” в корзинках растений-эпифитов – органо-минерального субстрата, формирующегося на корнях аккумулятивных эпифитов [3, 40]. Данный субстрат относится к категории органогенных почв или почвоподобных субстратов [4]. “Подвешенные почвы” в процессе формирования подвержены значительным суточным и сезонным колебаниям влажности и температуры, а также подвергаются сильному влиянию факторов эрозии (атмосферные осадки и ветер) [29]. На создание структуры и свойств “подвешенной почвы” оказывают влияние ризодепозиты (разлагающиеся ткани растений, муцигели, растительные экссудаты) и летучие органические вещества [40]. Экссудаты создают более кислые условия среды в “подвешенных почвах” по сравнению с почвами под растениями-форофитами, также за счет корневых выделений в субстрате депонируется углерод [24]. В настоящей работе исследовали образцы “подвешенных почв”, сформированных в корзинках эпифитных папоротников сем. Dryopteridaceae (Щитовниковые) на территории заповедников Кон Тю Ранг и Сонгтхань.

Образцы почв и сопряженных субстратов отбирали в декабре 2020 г.–январе 2021 г., хранили в воздушно-сухом состоянии при комнатной температуре (20–22°С). Экспериментальные исследования проводили спустя 14–21 сут после отбора образцов.

Общую численность бактерий и длину актиномицетного мицелия определяли с помощью прямого люминесцентно-микроскопического метода с применением красителя акридина оранжевого; длину грибного мицелия регистрировали при помощи красителя калькофлуора белого [12]. Исследования проводили с использованием люминесцентного микроскопа ZEISS Axioscope 2+. Численность бактерий, длину грибного и актиномицетного мицелия, а также биомассу микроорганизмов рассчитывали по общепринятым формулам [12].

Для определения численности и таксономической структуры сапротрофного бактериального комплекса проводили посев почвенной суспензии изучаемых образцов на питательную глюкозо-пептонно-дрожжевую среду из различных разведений: 1 : 100, 1 : 1000, 1 : 10 000, в 3–5-кратной повторности для каждого разведения. На 7–10 сут учитывали колоний бактерий, выросших на агаризованной среде: подсчитывали общее количество колоний на чашках, синхронно учитывали численность отдельных таксономических групп бактерий и актиномицетов. Представителей отдельных морфотипов изолировали в пробирки со скошенным агаром и определяли до рода на основании культуральных, микроморфологических и физиолого-биохимических признаков.

Структуры сапротрофного бактериального комплекса определяли на основании критериев, разработанных на кафедре биологии почв МГУ [12]. Были выделены следующие группы обилия: доминанты (>30%), субдоминанты (20–30%), группа среднего обилия (10–20%) и минорные компоненты (<10%).

Таксономическую структуру прокариотного сообщества определяли методом высокопроизводительного секвенирования (Next Generation Sequencing: NGS) с использованием платформы Illumina MiSeq методом парно-концевого чтения (2 × 300 пар оснований) генерацией не менее 10 000 парных прочтений на образец по последовательностям гена гипервариабельного региона V3–V4 16S рРНК. Подготовку проводили по двухстадийной ПЦР: амплификация V3–V4 16S рРНК, а затем амплификация ПЦР продукта с целью баркодирования библиотеки. Получаемые ампликоны после очистки на магнитных частицах и измерения концентрации флуориметрическим методом являлись готовыми ДНК-библиотеками.

Данные секвенирования обрабатывали с использованием автоматизированного алгоритма QIIME, включающего объединение прямых и обратных прочтений, удаление технических последовательностей, фильтрации последовательностей с низкими показателями достоверности прочтения отдельных нуклеотидов (качество <Q20), фильтрации химерных последовательностей. Для разбиения последовательностей на операционные таксономические единицы использовали алгоритм с открытым референсным порогом классификации 97%. Выравнивание прочтений на последовательность 16S рРНК и распределение последовательностей по таксономическим единицам проводили с использованием базы данных Silva версии 132.

Разнообразие и сходство бактериальных сообществ исследованных субстратов оценивали с помощью индексов альфа-разнообразия, рассчитанных при объединении сиквенсов в операционные таксономические единицы с уровнем схожести нуклеотидного состава сиквенсов 97%.

Пул метаболически активных прокариот определяли методом in situ-гибридизации с рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олиго-нуклеотидными зондами (FISH), меченными Cy-3 красителем. Использовали зонды, специфичные для доменов Archaea и Bacteria (филумы α-, β-, γ-, δ-Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria) [13].

Количественную оценку содержания функциональных генов (nifH и alkB) прокариот осуществляли методом количественной ПЦР в реальном времени. Реакцию проводили в амплификаторе DТLite4 ДНК-технология. Реакционную смесь готовили из препарата Super Mix Eva Green (Bio-Rad). Для каждого варианта эксперимента реакцию проводили в трех повторностях. Результаты измерений обрабатывали с использованием пакета программы Real time_PCR [14, 34]. Для определения наличия гена применяли ряд стандартных праймеров и условий [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение общей численности бактерий, длины актиномицетного и грибного мицелия. Результаты определения общей численности бактерий с помощью прямого люминесцентно-микроскопического метода в исследованных образцах почвы и сопряженных субстратов ООПТ Вьетнама представлены в табл. 2.

Видно, что общая численность бактериальных клеток в изученных образцах красно-желтой гумусно-ферралитной почвы варьировала от 1.59 до 5.59 млрд кл./г в горизонте А, максимальные показатели зафиксированы в горной ферралитной почве заповедника Пу Мат. В образцах аллювиальных почв численность бактерий варьировала от 0.10 до 3.36 млрд кл./г, максимальные показатели приурочены к образцам аллювиальной темно-бурой почвы. В целом показатели численности бактерий в большинстве образцов аллювиальных почв были ниже, чем в образцах гумусно-ферралитных почв. Бóльшие показатели были приурочены к образцам горных почв, что связано с большим содержанием в них органического вещества [20].

В образцах опада на поверхности красно-желтых гумусно-ферралитных почв показатели численности бактерий значительно варьировали от 0.40 до 3.56 млрд кл./г и в большинстве были выше, чем аналогичные показатели для образцов почвы. В опаде на поверхности аллювиальных почв численность бактерий также значительно варьировала (от 0.27 до 0.37 млрд кл./г), при этом показатели численности в среднем были значительно ниже, чем в опаде на поверхности ферралитных почв [11, 19].

Длина актиномицетного мицелия варьировала в образцах ферралитных почв от 280 до 670 м/г и была максимальной в горной красно-желтой гумусно-ферралитной почве заповедника Сонгтхань, ниже показатели зарегистрированы в равнинных почвах. В аллювиальных бурых и луговых кислых почвах в целом длина актиномицетного мицелия была сравнима или даже превышала показатели для гумусно-ферралитных почв (от 242 до 1086 м/г). Обращают на себя внимание более высокие показатели длины актиномицетного мицелия, приуроченные к образцам растительного опада с поверхности аллювиальных почв – в значительной части исследованных биотопов данный показатель превышал аналогичный для зональных почв в 1.5–2 раза.

Длина грибного мицелия в образцах зональных ферралитных почв варьировала от 190 до 892 м/г и была меньше или сравнима с аналогичными показателями для аллювиальных почв: от 322 м/г в аллювиальной бурой почве до 2038 м/г в аллювиальной темно-бурой оглеенной. В образцах растительного опада показатели изменялись от 386 до 1196 м/г, причем минимальные значения длины грибного мицелия были приурочены к образцам лиственного опада на поверхности аллювиальной темно-бурой почвы.

Исследование микробных сообществ тропических почв Вьетнама показало, что общая численность бактерий и длина актиномицетного мицелия сравнимы и превышают численность бактерий в лесных почвах умеренной зоны [11, 19]. В противоположность почвам умеренной зон, в подстилке зафиксированы меньшие показатели общей численности бактерий, чем в нижележащем горизонте А. Аналогичные закономерности ранее отмечены при изучении красных ферралитных почв Кубы [10]. Следует отметить, что длина актиномицетного мицелия была в целом больше, чем в почвах лесов умеренной зоны, а длина грибного мицелия меньше, чем в лесах умеренной зоны [19].

Показатели численность бактерий, длины актиномицетного и грибного мицелия были определены также в образцах “подвешенных почв”. Показатели численности бактерий и длины актиномицетного мицелия превышали таковые во всех изученных образцах почвы и растительного опада и составляли 4.36–5.01 млрд кл./г и 680–690 м/г. При этом длина грибного мицелия была меньше, чем в почве и опаде. Вероятно, столь высокая бактериальная численность обусловлена значительно более активной по сравнению с другими субстратами деятельностью фауны (муравьи) и выделением корневых экссудатов, которые создают благоприятные условия для роста и размножения микроорганизмов [4].

На основании полученных данных об общей численности бактерий, длине актиномицетного и грибного мицелия были рассчитаны показатели биомассы прокариот (бактерий, актиномицетов) и грибов, общая микробная биомасса, а также вклад прокариотных организмов в общую биомассу микроорганизмов. Полученные результаты представлены в табл. 3. В образцах красно-желтых ферралитных почв запасы общей микробной биомассы сильно варьировали и составляли от 1.42 (заповедника Сонгтхань) до 3.91 мг/г (Кон Тю Ранг). В образцах аллювиальных почв значения варьировали от 1.30 до 3.12 мг/г почвы, максимальные значения были обнаружены в образцах аллювиальной темно-бурой оглеенной почвы (8.86 мг/г почвы). Содержание прокариотной биомассы составляло от 0.66 до 8.71% что сравнимо с аналогичным показателем для почв лесов умеренной зоны [19]. Максимальное содержание прокариотной биомассы было приурочено к аллювиальной темно-бурой почве.

В образцах растительного опада наименьшая общая микробная биомасса была приурочена к образцам опада на поверхности равнинной зональной ферралитной почвы (1.62 мг/г), наибольшие значения обнаружены в образцах опада на поверхности горной красно-желтой гумусно-ферралитной почвы (1.71 мг/г). При этом вклад прокариот в общую микробную биомассу более, в большинстве образцов выше в опаде, чем в почве. Максимальный вклад прокариот в общую биомассу был приурочен к образцам “подвешенной почвы” на территории ООПТ Сонгтхань и Кон Тю Ранг, 7.30 и 14.63% соответственно.

Полученные результаты позволяют предположить, что максимальная концентрация почвенной микробиоты в почвах тропических лесных биогеоценозов происходит в горизонте А, в противоположность лесным и степным биогеоценозам умеренной зоны, где таким локусом является подстилка [19]. Значительное содержание прокариотной биомассы в опаде и “подвешенной почве” может свидетельствовать о значительной роли прокариот в трансформации органического вещества в этих локусах.

Численность и таксономический состав комплекса культивируемых сапротрофных бактерий. Численность сапротрофного бактериального комплекса (СБК) значительно варьировала во всех исследованных почвах (табл. 4). В таблице представлены данные по зональным и интразональным почвам с наиболее типичными результатами по численности и таксономическому составу по сравнению со всеми исследованными образцами. Максимальная численность культивируемых бактерий была приурочена к образцам красно-желтой гумусно-ферралитной почвы (4.8 млн КОЕ/г) и снижалась значительно по почвенному профилю (2.24 млн КОЕ/г), меньше были показатели численности в аллювиальной луговой кислой почве (0.6 млн КОЕ/г почвы). Численность сапротрофного бактериального комплекса в образцах опада была в 4–9 раз больше, чем в образцах почв. Численность культивируемых бактерий в образцах “подвешенной почвы” была сравнима с численностью СБК в растительном опаде, приуроченном исследуемому локусу (9 млн КОЕ/г почвы).

Таксономическая структура исследованных почв проявляла значительное сходство: в качестве доминантов в СБК всех исследованных почв и опада выступали бактерии рода Bacillus и Streptomyces, в качестве субдоминантов и группы среднего обилия обнаружены представители родов Myxococcus, Micrococcus, Arthrobacter, Rhodococcus.

В “подвешенной почве” доминировали представители рода Streptomyces. Значительная представленность в изученных образцах опада и “подвешенной почвы” рода Streptomyces подтверждает результаты прямого учета длины актиномицетного мицелия и свидетельствуют о значительном вкладе актинобактерий в деструкцию растительного материала на поверхности почв и в корзинках эпифитных растений Вьетнама [1, 7]. В качестве минорных компонентов во всех исследованных субстратах выступали протеобактерии родов Rhizobium, Azotobacter, Chromobacterium, Serratia, Cytophaga, Beijerinckia, а также некоторые представители, не идентифицированные до рода. Полученные данные по численности и разнообразию СБК “подвешенной почвы” указывают на близость прокариотного сообщества изученного субстрата к сообществу ризосферной почвы, расположенной в прикорневой зоне растений и отличающейся повышенной микробной активностью [22].

Высокое содержание в опаде и “подвешенной почве” представителей рода Streptomyces, известных как активные продуценты антибиотиков, позволяет рассматривать эти локусы как перспективные для выделения штаммов с высоким биотехнологическим потенциалом.

Таксономическая структура прокариотного сообщества (баркодинг гена 16S рРНК). Для исследования таксономической структуры прокариотного сообщества зональных и интразональных почв Вьетнама выбраны образцы с наиболее репрезентативными данными по общей численности микроорганизмов и структуре СБК: зональная красно-желтая гумусно-ферралитная почва заповедника Кон Тю Ранг и интразональная аллювиальная бурая почва заповедника Пу Хоат. Данные типы почв являются наиболее распространенными и используемыми в сельском хозяйстве на территории Вьетнама, поэтому их подробное изучение представлялось наиболее интересным. Ранее проведен метагеномный анализ (баркодинг гена 16S рРНК) бактериального сообщества данной интразональной почвы, опада и “подвешенной почвы” [7]. В настоящей работе приведены результаты анализа метагенома образцов горизонта А почвы, растительного опада и “подвешенной почвы”, а также данные по изучению филогенетического разнообразия красно-желтой гумусно-ферралитной почвы заповедника Кон Тю Ранг и сопряженной с ней “подвешенной почве”.

Представлялось интересным выявить основные роды микроорганизмов, представленные в доминирующих филумах микроорганизмов образцов, приуроченных к аллювиальной бурой почве. Во всех изученных образцах для филума Proteobacteria показано доминирование альфа-протеобактерий и порядка Rhizobiales в общем пуле микроорганизмов. Среди выявленных родов микроорганизмов присутствует значительное число бактерий-продуцентов вторичных метаболитов (Haliangum, Sorangium, Novosphongobium, Phenylobacterium, Pseudomonas) и прокариот, способных осуществлять фиксацию и превращения азота в почве (Bradyrhizobium, Variibacter) [26, 31].

Наибольшей представленностью в сапротрофном бактериальном комплексе исследованных субстратов характеризовался филум Actinobacteria. В изученных субстратах выявлено значительное количество актиномицетов, способных к деструкции и минерализации растительного материала (Acidothermus, Mycobacterium) [39, 45]. Наиболее широко представленными в сапротрофном бактериальном комплексе являлись бактерии рода Streptomyces, тогда как в изученных при помощи метагеномного анализа образцах субстратов преобладали роды Kitasatospora и Streptomyces, причем представленность данных родов значительно варьировала.

Одним из трех наиболее распространенных в изученных субстратах таксонов является типично почвенный филум Acidobacteria. В исследованных образцах были детектированы роды Koribacter, Bryobacter, Granulicella, Terriglobus, а также некоторые роды-кандидаты. Предположительно, развитие данных таксонов в образцах опада и “подвешенной почвы” связано с сильной степенью минерализации органического вещества, а также кислой реакцией среды (рН 4.2–5.1) и экссудатов эпифитных растений.

Проведен сравнительный анализ метагенома красно-желтой гумусно-ферралитной почвы и “подвешенной почвы” из корзинок эпифитных папоротников (табл. 5).

Полученные в ходе работы закономерности в распределении филогенетического разнообразия красно-желтой гумусно-ферралитной почве были сходны с аналогичными результатами изучения прокариотного сообщества аллювиальной почвы и сопряженных субстратов [7]. В исследованных образцах красно-желтой ферралитной почвы и “подвешенной почвы” детектированы бактериальные филумы Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, меньше содержание филумов Bacteroidetes, Cloroflexi, Acidobacteria, Verrucomicrobia, Planctomycetes, Cyanobacteria. Полученные результаты согласуются с данными других авторов, изучавших филогенетическое разнообразие почв [18, 32, 33, 35]. При этом представленность различных филумов в исследованных почвах была различной. В “подвешенной почве” доминировали представители филума Proteobacteria (51%), меньше было содержание Acidobacteria (38%) и Firmicutes (8%), наименьшим было содержание других филумов. Полученные данные по основным доминирующим филумам бактерий соотносились с результатами посева на универсальные питательные среды, а также с литературными данными [33]. В горизонте А красно-желтой гумусно-ферралитной почвы доминировал филум Firmicutes (80%), меньше было содержание Proteobacteria (15%), Actinobacteria (2%) и прочих филумов. Следует отметить, что в ранее исследованных аллювиальной почве, опаде и “подвешенной почве” [7] отмечены те же закономерности на уровне филумов.

При изучении общего разнообразия прокариотных микроорганизмов в образцах горизонта А красно-желтой гумусно-ферралитной почвы и “подвешенной почвы” выявлены некоторые общие закономерности. В изученных субстратах выявлено большое количество родов бактерий, способных к деструкции ксенобиотиков (Amaricoccus, Sphingomonas, Pseudomonas, Skermanella и др.) [28, 37]. Показано наличие большого числа бактерий, связанного с различными этапами цикла азота (Paracoccus, Ensifer, Nocardia, Pseudolabrys и др.) [42, 43], а также бактерий-экстремофилов, способных переживать длительные неблагоприятные условия (Brevundimonas, Janthinobacterium и др.) [25, 46]. Также выявлен значительный вклад в микробное сообщество субстратов ацидофильных актинобактерий рода Acidimicrobium, что связано с низкими значениями рН исследуемых ферралитных почв. В образце горизонта А почвы было определено большое количество бактериальных родов-антагонистов развития грибов (Ornithinimicrobium, Janthinobacterium, Kocuria) [36, 38, 44]. Исследуя сообщества на родовом уровне, стоит заметить, что сообщество “подвешенной почвы” имеет низкое сходство с сообществом ферралитной почвы – при значительном сходстве функциональных группировок микроорганизмов их родовой состав существенно различается, что подтверждает ранее опубликованные результаты других исследователей, согласно которым “подвешенная почва” имеет большее сходство с сообществом почвы, чем с сообществами растения-форофита или его опада [33]. Однако в других работах для “подвешенных почв” тропических лесов Борнео и Амазонии выявлен гораздо больший уровень корреляции сообщества “подвешенной почвы” с растением-форофитом и значительная разница между сообществами “подвешенных почв” двух разных территорий [32, 35]. Для более подробного исследования данного субстрата необходимо расширить локальную выборку, а также учитывать свойства “подвешенной почвы”, обусловленные ее генезисом.

Характеристика метаболически активных представителей прокариотного комплекса зональной почвы и сопряженных субстратов. В дополнение к проведенному метагеномному анализу (секвенирование гена 16S рРНК) бактериального сообщества зональной красно-желтой гумусно-ферралитной почвы, опада и “подвешенной почвы” представляло значительный интерес сравнить численность и соотношение метаболически активных представителей доминирующих филумов в изученных субстратах, полученные методом FISH результаты представлены на рис. 1. Для характеристики выбраны филумы, наиболее значительно представленные в образцах почвы, опада и “подвешенной почвы” на основании проведенных ранее исследований [7]. Содержание метаболически активных клеток, относящихся к филумам Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria было ниже в почве и выше в “подвешенной почве”. Однако соотношение таксонов в этих субстратах различалось. Доминирующей группой во всех субстратах были протеобактерии, минорной – Actinobacteria. При этом наибольшая численность филума Proteobacteria обнаружена в образцах “подвешенной почвы” (454.97 млн кл./г почвы), наименьшая приурочена к образцам горизонта А (116.37 млн кл./г) и составляла всего 25% от общей представленности данного таксона в “подвешенной почве”. Для актинобактерий, напротив, максимальное содержание показано в верхнем горизонте почвы и более низкие значения – в опаде и “подвешенной почве”. При помощи метагеномного анализа данных субстратов показан значительный вклад филума Firmicutes в общее разнообразие прокариотных организмов, что требует проведения дополнительных исследований для выявления пула метаболически активных представителей. Интересно, что максимальная численность метаболически активных протеобактерий соотносилась с высоким таксономическим разнообразием этого филума в “подвешенной почве”, выявленным с помощью метабаркодинга.

Рис. 1.

Численность метаболически активных прокариотных микроорганизмов в образцах красно-желтой гумусно-ферралитной почвы и сопряженных субстратах.

Детекция функциональных генов (nifH и alkB) в исследованных образцах. Для образцов зональной красно-желтой гумусно-ферралитной почвы, растительного опада и “подвешенной почвы” исследовано содержание функциональных генов nifH и alkB. Выбор данных генов был обусловлен возможностью использования микроорганизмов-носителей в биотехнологических целях для создания бактериальных препаратов, повышающих уровень фиксации атмосферного азота и деструкции органических ксенобиотиков. Предположительно, содержание гена alkB в образцах почв и растительного материала Вьетнама может быть завышено по сравнению с почвами умеренной зоны в связи с обработкой тропических лесов дефолиантами во второй половине ХХ в. [5].

Содержание копий функциональных генов alkB и nifH в образцах, приуроченных к красно-желтой гумусно-ферралитной почве, было примерно в 10 раз меньше, чем в образцах исследованной ранее аллювиальной бурой почвы и сопряженных субстратах [7]. Так, число копий гена, кодирующего алканмонооксигеназу, было наибольшим в образцах “подвешенной почвы” (0.32 млн копий/г), меньше в образцах растительного опада (0.18 млн копий/г) и почвенного гор. А (0.2 млн копий/г). Зафиксированные численности функционального гена alkB значительно меньше данных, полученных для почв умеренных лесов [13]. Ген nifH был также обнаружен во всех исследованных образцах; его численность варьировала от 0.03 млн копий гена/г почвы в образцах растительного опада и почвы до 0.9 млн копий/г в образцах “подвешенной почвы”.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведено комплексное исследование прокариотного сообщества некоторых почв Вьетнама и сопряженных с ними субстратов. Показатели численности бактерий в большинстве образцов аллювиальных почв были меньше, чем в образцах гумусно-ферралитных почв, тогда как при исследовании длины актиномицетного мицелия выявлена обратная закономерность. Обращают на себя внимание бóльшие показатели длины актиномицетного мицелия, приуроченные к образцам растительного опада с поверхности аллювиальных почв – в значительной части исследованных биотопов данный показатель превышал аналогичный для зональных почв в 1.5–2 раза. На поверхности почв в тропической зоне именно растительный опад и горизонте А почв является локусом наибольшей концентрации микробной биомассы в отличие от лесных экосистем умеренного пояса, где наибольшая численность микроорганизмов регистрируется в подстилке. В результате активной деструкции растительного материала микроорганизмами в тропических лесах Вьетнама сам горизонт подстилки не формируется, тогда как горизонт А почвы в значительной мере несет черты подгоризонта H. Длина грибного мицелия в образцах интразональных почв и сформированного на них растительного опада была в среднем больше, чем в аналогичных зональных образцах.

По результатам проведенного комплексного исследования выявлено, что значительный вклад в деструкцию растительного материала вносят актиномицеты рода Streptomyces, выявленные в СБК и при помощи метагеномного анализа, а также бактерии-гидролитики, широко представленные в пуле почвенных прокариот. Численность сапротрофного бактериального комплекса в растительном опаде превышала таковую в горизонте А почв в 4–9 раз. Практически во всех исследованных почвах и сопряженных субстратах доминировали бактерии рода Streptomyces, что подтверждает ранее выдвинутую гипотезу о значительном вкладе актиномицетов в разложении растительных остатков по сравнению с почвами умеренной зоны.

С помощью молекулярных методов (высокопроизводительное пиросеквенирование) исследования детектировано потенциально высокое разнообразие бактерий-продуцентов биологически активных веществ, деструкторов ксенобиотиков, экстремофилов, а также организмов, вовлеченных в круговорот азота и способных к фиксации атмосферного азота. Метаболически активная составляющая прокариотного сообщества красно-желтой гумусно-ферралитной почвы и сопряженных субстратов представлена филумами Proteobacteria, Actinobacteria и Acidobacteria, достигала максимальных значений в “подвешенной почве”, что соотносилось с высокой численностью филумов и их значительным таксономическим разнообразием в этом локусе, определенным классическими и современными микробиологическими методами. Функциональные гены (nifH и alkB) детектированы в значимом количестве в красно-желтой гумусно-ферралитной почве и сопряженных субстратах. Численность копий функциональных генов была максимальна в образцах “подвешенной почвы”, что делает этот локус перспективным для выделения штаммов с высоким биотехнологическим потенциалом в отношении фиксации атмосферного азота и разложению алканов.

Изучение особого биогеоценотического “узла”, характерного для тропических лесов – “подвешенной почвы” – с применением комплексного подхода позволило выявить специфические характеристики микробного разнообразия данного субстрата, а также подтвердить данные, полученные при изучении научной литературы. Исходя из полученной информации, можно сделать заключение о близости изученного почвоподобного тела к ризосферной почве исходя из общего микробного разнообразия, значительного количества метаболически активных организмов, способных к проведению процессов азотфиксации и деструкции ксенобиотиков.