Агрохимия, 2019, № 2, стр. 81-88

ВВЕДЕНИЕ

В последние десятилетия возрастает загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами (ТМ), в том числе земель сельскохозяйственного назначения [1]. Это приводит к усилению поглощения ТМ культурными растениями, нарушениям физиологических процессов, ухудшению качества продукции [2–4]. Ионы тяжeлыx метaллов в пoвышeнных концентрaциях оказывают тoксическое действиe на растeния [3, 5]. Одной из ведущих культур России является пшеница, которую возделывают на территории 25.5 млн га, в том числе на почвах, загрязненных ТМ [6].

Регуляторы роста растений (РРР) позволяют повысить устойчивость растений к неблагоприятным условиям окружающей среды [7–10], в частности ослабить токсическое действие ТМ [2, 11–13]. В ряде работ показано, что РРР разной химической прирoды способствовали снижению аккумуляции и негативных эффектов тяжелых металлов [13–16], однако имеются и противоположные данные, что некоторые РРР усиливали накопление ТМ в тканях растений [17, 18]. Противоречивые сведения о роли РРР в аккумуляции ТМ и модификации их токсического действия в растениях требуют сравнительного изучения эффектов РРР в растениях, выращиваемых при разных уровнях загрязнения ТМ.

Брассиностероиды (БС) – полигидроксистероидные фитогормоны с выраженной ростстимулирующей активностью [12] выполняют в растениях ряд важных функций, в том числе регулируют рост, прорастание семян, ризогенез, старение, а также устойчивость к абиотическим стрессорам [19]. Существуют данные, что БС опосредуют реакции растений на действие ТМ [12, 20], но подобных исследований растений пшеницы немного. В работе [21] показано протекторное (против повышенной дозы Ni) действие опрыскивания листьев 5-ти сортов Triticum aestivum 0.01 мкМ 28‑гомобрассинолидом, которое было опосредовано через повышенную активность каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы. Опрыскивание растений пшеницы на различных стадиях развития 3-мя БС (24-эпибрассинолидом, 24-эпикастастероном и синтетическим препаратом 4154, все в дозе 1 нМ/л) в некоторых вариантах приводило к снижению содержания ТМ (Pb, Zn, Cd), но иногда – к повышению аккумуляции Cu и Cd [22].

В связи с малой изученностью эффективности БС на пшенице цель работы – изучение влияния экзогенного РРР – препарата эпин-экстра (ЭЭ) на аккумуляцию ТМ в проростках пшеницы, физиологические и биохимические реакции растений пшеницы на различные дозы (субоптимальные – 10 мкМ или сублетальные – 1 мМ) тяжелых металлов. ЭЭ – регулятор роста, содержащий 24‑эпибрассинолид в количестве 0.025 г/л (НЭСТ-М, Москва, Россия), обеспечивающий повышение устойчивости сельскохозяйственных культур к заболеваниям [23]. Он индуцирует ряд биохимических превращений, стимулирует биосинтез белка, активирует фотосинтез и т.п. [24, 25].

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Семена пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Мироновская 808 замачивали на 8 ч в растворе ЭЭ с концентрацией 1 мкМ (контроль – дистиллированная вода), после чего растения выращивали в водной культуре на растворах солей CuSO₄ ⋅ 5H₂O, ZnSO₄ ⋅ 7H₂O, NiSO₄ ⋅ 7H₂O, Pb(NO₃)₂ в концентрациях 10 мкМ или 1 мМ при температуре 22–24°С, 16-часовом световом дне, освещенности 200 мкМ фотонов/м²/с. Спустя 7 сут экспозиции на растворах ТМ измеряли длину корней и побегов молодых растений, определяли содержание ТМ в осевых органах (на атомно-абсорбционном спектрометре Shimadzu серии АА-7000), в листьях определяли скорость генерации супероксидного анион-радикала (${\text{O}}_{2}^{{\centerdot {\kern 1pt} - }}$) [26], интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по цветной реакции с ТБК [26], активность каталазы [27].

Опыты проводили не мeнее 3-х раз, в каждoм опыте было от 3 до 20 биолoгических повторностей. Результаты обработаны статистически по стандартным метoдикам с использoванием компьютерных прогpамм Statistica, BIOSTAT, Microsoft Excel. В таблицах и на графикax представлены средние арифметическиe из всех повторностей опытoв и их стандартные ошибки. Сравнение вариантов проводили пo t-критepию Стьюдента при 5%-ном уpoвне значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Содержание ТМ в осевых органах растений пшеницы. Аккумуляция ТМ в органах растений пшеницы, выращенных на растворах солей ТМ, важна для оценки их действия на физиологические и биохимические процессы. Содержание ТМ в осевых органах пшеницы спустя 7 сут выращивания на растворах, содержащих соли ТМ, многократно превышало контроль (табл. 1). При этом более высокие дозы ТМ в растворах увеличивали аккумуляцию ТМ в органах пшеницы. Наиболее высокое содержание ТМ выявлено на фоне 1 мМ ионов металлов в среде, превышение контроля составило (в корне и надземной части соответственно): для ионов Cu²⁺ – 62 и 8 раз, Ni²⁺ – 38 и 14, Pb²⁺ – 277 и 24, Zn²⁺ – 125 и 20 раз. Данные свидетельствовали, что содержание ТМ в надземной части было в 1.3–24 раза меньше, чем в корнях. Способность корней задерживать ТМ снижает их транспорт в надземные органы растений, однако с увеличением концентрации металлов во внешней среде и с возрастанием их содержания в корнях повышается количество ТМ в надземных органах (стеблях и листьях) [28–30].

В опыте с предпосевной обработкой семян препаратом эпин-экстра содержание ТМ в органах растений пшеницы также превышало контроль, хотя в большинстве случаев было меньше, чем в вариантах без регулятора роста (табл. 1). Эпин-экстра эффективно снижал загрязненность корней ионами ТМ относительно необработанных растений (за исключением доз 10 мкМ Zn²⁺, Pb²⁺ и 1 мМ Ni²⁺). При действии субоптимальной концентрации ионов Ni²⁺ содержание никеля в корнях пшеницы было на 40% меньше, чем в варианте без РРР. Наиболее эффективно ЭЭ снижал содержание меди в корнях пшеницы (на 95 и 85% относительно необработанных растений при 10 мкМ и 1 мМ Cu²⁺ в среде соответственно). При действии 1 мМ Pb²⁺ отмечено уменьшение содержания свинца на 10% в результате обработки ЭЭ.

Под влиянием регулятора роста содержание ионов ТМ в надземной части пшеницы изменялось, но неодинаково для разных металлов. Содержание меди вследствие предобработки возросло почти в 2 раза при дозе Cu²⁺ в среде 10 мкМ, но уменьшилось на 32% на фоне 1 мМ Cu²⁺. Обработка регулятором ЭЭ на фоне высокой дозы Ni²⁺ и низкой дозы Pb²⁺ в среде приводила к снижению аккумуляции этих металлов в надземной части растений пшеницы на 51 и 33% соответственно. Наконец, в опыте с Zn²⁺ предобработка ЭЭ не оказала достоверного эффекта на аккумуляцию этого ТМ в надземной части растений пшеницы.

Таким образом, при обработке семян препаратом эпин-экстра загрязнение осевых органов пшеницы ионами ТМ относительно контроля оставалось значительным. В то же время относительно необработанных растений ЭЭ в ряде случаев снижал содержание металлов в надземной части и в корнях пшеницы. Наиболее эффективно препарат действовал на фоне ионов Cu²⁺ (особенно в корнях), несколько слабее – на фоне Ni²⁺ и Pb²⁺, не изменял аккумуляцию ТМ в растениях пшеницы на фоне Zn²⁺. Очевидно, что существует специфичная для разных металлов эффективность регулятора ЭЭ.

В литературе имеются данные, подтверждающие эффективность обработки БС на снижение содержания ТМ в растениях Triticum aestivum [22], Brassica juncea [31] и др. По-видимому, различные БС могут проявлять активность, уменьшающую содержание ТМ в растениях.

Ростовые характеристики растений пшеницы. Нарушение роста и морфогенеза – один из видимых симптомов воздействия стресс-факторов. Токсическое действие ТМ, как широко распространенных токсикантов, можно четко проследить по ингибированию роста, что показано для очень широкого спектра видов растений [32–35]. Для оценки влияния ТМ на состояние растений пшеницы определяли длину осевых органов (корней и надземной части) (рис. 1).

Рис. 1.

Влияние препарата эпин-экстра на длину осевых органов пшеницы на фоне ионов ТМ: (а) – корней, (б) – надземной части.

Спустя 7 сут экспозиции растений пшеницы на растворах, содержащих ионы ТМ в концентрации 10 мкМ, длина корней мало отличалась (на фоне ионов Zn²⁺) или слегка превышала (на фоне Pb²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺) показатели водного контроля (рис. 1а). Однако при выращивании пшеницы на растворах, содержащих 1 мМ ионов никеля, меди и свинца, наблюдали достоверное ингибирование роста корня пшеницы (на 92, 70 и 40% к водному контролю соответственно); рост корней на среде с ионами Zn²⁺ не отличался от роста в водном контроле.

Реакция роста надземной части растений пшеницы на содержание ТМ в среде показала сходную тенденцию (рис. 1б). Выращивание растений на растворах, содержащих ТМ в концентрации 10 мкМ, несколько стимулировало рост (в случае ионов Cu²⁺, Pb²⁺ и Zn²⁺) или подавляло его (в варианте с Ni²⁺). Использование растворов в концентрации 1 мМ снижало длину надземной части растений пшеницы на 17 (Cu²⁺), 22 (Pb²⁺) и 76% (Ni²⁺). Действие ионов Zn²⁺ не повлияло на длину надземной части растений пшеницы.

Предобработка семян препаратом эпин-экстра оказала существенное влияние на ростовые характеристики растений пшеницы как в контроле, так и на фоне ионов тяжелых металлов. Регулятор роста стимулировал рост корня относительно контроля на 135%. На фоне субоптимальной концентрации ионов ТМ также наблюдали увеличение длины корня при обработке РРР эпин-экстра на 101–180% к контролю, наиболее выраженное при действии ионов Pb²⁺ и Cu²⁺. Однако ростстимулирующая эффективность регулятора роста была выражена слабее при действии ТМ в концентрации 1 мМ: рост корня увеличивался относительно водного контроля только в случае присутствия ионов Zn²⁺ (на 52%).

При сравнении роста корней растений пшеницы, выращенной из обработанных ЭЭ семян, с необработанными растениями показано достоверное увеличение длины корня в следующих вариантах: в 2 и 1.5 раза – при действии 10 мкМ ионов Cu²⁺ и Ni²⁺, в 2.3 и 1.3 раза – на фоне 10 мкМ и 1 мМ ионов Pb²⁺, в 2.4 и 1.7 раза – на фоне субоптимальной и сублетальной концентрации ионов Zn²⁺.

Эпин-экстра в большинстве вариантов стимулировал и рост надземной части пшеницы, но в меньшей степени, чем рост корня (рис. 1б). В варианте без ионов ТМ в среде отмечено удлинение надземной части на 39% относительно водного контроля. На фоне субоптимальной концентрации ионов Cu²⁺ и Ni²⁺ длина надземной части превысила контроль на 50 и 46%, тогда как на фоне сублетальной концентрации отмечено угнетение роста побега на 32 и 63% соответственно. При действии ионов Pb²⁺ отмечено стимулирование роста надземной части на 10 и 37% (относительно варианта ТМ без РРР), а при действии ионов Zn²⁺ – на 5 и 37% при концентрациях 10 мкМ и 1 мМ соответственно.

Рост корней, нормированный к водному контролю, отражает величину индекса толерантности, предложенного Уилкинсом [32]. Обработка препаратом эпин-экстра способствовала повышению индексов толерантности во всех вариантах опыта за исключением 1 мМ ионов Cu²⁺. Поскольку индексы толерантности в большинстве вариантов с обработкой РРР превысили 100%, можно заключить, что эпин-экстра способствовал полной адаптации растений к действию ТМ.

Скорость генерации супероксидного анион-радикала в листьях пшеницы на фоне ионов тяжелых металлов. Для оценки влияния PPР эпин-экстра на биохимические индексы окислительного стресса в листьях пшеницы при действии ТМ использовали определение скорости генерации cупероксидного анион-радикала [26, 36].

При действии ТМ на проростки пшеницы уровень генерации ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot {\kern 1pt} - }}$ либо не изменялся (на фоне ионов Pb²⁺ и Zn²⁺, а также низкой дозы Cu²⁺), либо возрастал (на фоне 1 мМ Cu²⁺ и особенно Ni²⁺) (рис. 2). Предобработка препаратом эпин-экстра существенно снизила скорость генерации супероксидного анион-радикала во всех вариантах эксперимента (за исключением 10 мкМ ионов свинца, где разница с вариантом без РРР была недостоверной). В варианте без ТМ регулятор роста снижал скорость генерации супероксида на 50% относительно водного контроля. Интенсивное ингибирование генерации супероксидного анион-радикала (относительно варианта без РРР) имело место в вариантах с ионами Cu²⁺ (на 81 и 84% при 10 мкМ и 1 мМ соответственно), Zn²⁺ (на 81 и 92%), Ni²⁺ (на 87 и 95%).

Рис. 2.

Влияние препарата эпин-экстра на скорость генерации супероксидного анион-радикала в листьях пшеницы на фоне ионов ТМ.

Поскольку стационарный уровень ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot {\kern 1pt} - }}$ является индикатором окислительного стресса в растениях, в том числе при действии ТМ [13, 36, 37], можно предположить, что большинство вариантов действия ТМ в исследованных концентрациях не оказало существенного влияния на возникновение окислительного стресса в растениях (кроме воздействия Cu²⁺ и особенно Ni²⁺). При этом обработка ЭЭ эффективно снижала скорость генерации ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot {\kern 1pt} - }}$, тем самым максимально препятствуя возникновению окислительного стресса в клетках листьев пшеницы. Возможно, этот эффект РРР связан со снижением накопления ТМ растениями, выращенными из обработанных ЭЭ семян.

Интенсивность перекисного окисления липидов в листьях пшеницы. Дальнейшее проявление окислительного стресса на уровне клеточных мембран – возрастание интенсивности ПОЛ [26, 37]. Нарушения липидного комплекса мембран в листьях пшеницы в результате действия ТМ анализировали посредством определения концентрации малонового диальдегида (МДА). Обнаружено, что уровень МДА резко возрастал при действии ионов Cu²⁺ и Ni²⁺ (на 74–172% и 62–87% к водному контролю, соответственно) (рис. 3). При этом ионы Pb²⁺ и Zn²⁺ не усиливали интенсивность ПОЛ в листьях пшеницы.

Рис. 3.

Влияние препарата эпин-экстра на ПОЛ и МДА в листьях пшеницы на фоне ионов ТМ.

Предобработка семян препаратом эпин-экстра привела к снижению уровня содержания МДА как в водном контроле (на 44%), так и на фоне действия ионов ТМ. При сравнении с необработанными РРР растениями показано, что обработка ЭЭ существенно снизила интенсивность ПОЛ в листьях растений пшеницы: на 36 и 93% на фоне 10 мкм и 1 мМ ионов Cu²⁺, на 74 и 58% на фоне ионов Ni²⁺, на 85% на фоне ионов Pb²⁺ и на 84% на фоне 1 мМ Zn²⁺ (в варианте с 10 мкМ Zn²⁺ различия были недостоверными).

Активность каталазы в листьях пшеницы на фоне тяжелых металлов. Антиоксидантная система растений включает как низкомолекулярные соединения, так и ферменты, например, каталазу [27, 38] – один из ключевых антиоксидантных ферментов, которая играет важную роль в детоксикации пероксида водорода. Влияние ЭЭ на активность каталазы определяли по скорости распада Н₂О₂ (рис. 4).

Рис. 4.

Влияние препарата эпин-экстра на активность каталазы в листьях пшеницы на фоне ионов ТМ.

Уровень активности каталазы при действии ТМ существенно возрастал, особенно значительно – на фоне низкой концентрации ионов Cu²⁺ и Pb²⁺ и высокой – Ni²⁺ и Zn²⁺. Поскольку каталаза – фермент индуцибельный, активность которого возрастает при увеличении количества субстрата в среде [38], такое увеличение может указывать на довольно высокий уровень одной из активных форм кислорода – пероксида водорода – в клетках пшеницы, подвергнутых действию ТМ. Обработка ЭЭ снизила активность каталазы как в водном контроле (на 57%), так и во всех вариантах действия ТМ (за исключением 10 мкМ ионов никеля, где уровень ТМ был превышен на 36%). На фоне ионов Cu²⁺ отмечено снижение активности фермента на 33 и 54% при 10 мкМ и 1 мМ соответственно, на фоне ионов Pb²⁺ – на 62 и 26%, на фоне ионов Zn²⁺ – на 28 и 48%, на фоне 1 мМ ионов Ni²⁺ – на 44%. Очевидно, что предобработка пшеницы ЭЭ существенно снизила содержание Н₂О₂ в листьях пшеницы, что указывало на возрастание антиоксидантной активности клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Резюмируя полученные данные, можно сделать заключение, что предобработка пшеницы брассиностероидом – препаратом эпин-экстра (ЭЭ) – приводила к уменьшению токсического действия тяжелых металлов, что можно фиксировать следующими показателями: увеличением длины корня и надземной части растений, снижением скорости генерации супероксида и интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в листьях, снижением активности каталазы, обусловленным уменьшением содержания субстрата – Н₂О₂. Сходные результаты были показаны и для других видов растений, обработанных брассиностероидами (БС), на фоне ТМ [15, 16, 31, 39–41]. Физиологические механизмы, участвующие в этом процессе, остаются слабо изученными. Существует предположение, что БС могут регулировать поглощение ионов ТМ клетками растений [31]. Снижение проявлений токсического действия ТМ при обработке БС может быть связано с уменьшением накопления ТМ в растениях.

Эпин-экстра оказал благоприятное действие на растения пшеницы на фоне всех изученных ТМ. Регулятор роста обладал средней эффективностью при действии всех ионов ТМ за исключением 10 мкМ Pb²⁺ (низкая эффективность) и 1 мм Ni²⁺ (эффективность выше средней).