Агрохимия, 2020, № 5, стр. 47-51

ВВЕДЕНИЕ

Культуру пресноводной хлорококковой микроводоросли Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. используют в системе природоохранных мероприятий с целью выявления загрязнения (токсичности) водных сред (сточных и природных вод), с ее помощью можно выявлять и уточнять токсичность конкретных веществ и их смесей, например, экстрактов из различных материалов и продуктов, включая радиоактивные [1–9], а также исследовать особенности влияния веществ в сверхмалых (10^–9 М/л и ниже) концентрациях [10]. Биотесты на основе изучения реакции Scenedesmus quadricauda применяют для экспериментального установления класса опасности отходов производства [11].

Также эту микроводоросль можно использовать при определении токсических характеристик веществ, предназначенных для целенаправленного уничтожения водорослей, присутствие которых нежелательно. В частности, представляет собой проблему “цветение” воды в открытых и закрытых искусственных водоемах (плавательных бассейнах, аквапарках, аквариумах, фонтанах, декоративных водоемах). Так как размножение клеток является интегральным и адекватным показателем их состояния [12], для определения различных влияний физической или химической природы используют изменения ростовых характеристик культуры водоросли.

Для вре́менного прекращения роста водорослей используют вещества, применяемые в качестве гербицидов в отношении высших растений, имеющие различный механизм действия, в частности, четвертичные аммониевые соединения (ЧАС), а также вещества, содержащие хлор. Для тестирования целевых свойств таких средств нами была применена оценка их влияния на рост культуры Scenedesmus quadricauda. Были проверены 2 средства, предназначенные для предотвращения размножения водорослей в плавательных бассейнах – препараты АAS и MP. В качестве действующего вещества в них использованы соответственно бензалкония хлорид (БХ, алкилдиметил(фенилметил)аммония хлорид, 18%-ный водный раствор) и трихлоризоциануровая кислота (ТХЦК, 95.5% д.в., твердые таблетки).

БХ (мол. м. 340.0 D) представляет собой поверхностно активную четвертичную аммониевую соль, обладающую противомикробной активностью широкого спектра, фунгицидной и фунгистатической, антипротозойной, противовирусной активностью [13]. ПДК БХ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования равна 0.3 г/м³.

ТХЦК (мол. м. 232.4 D) относится к дезинфекционным средствам, активность которых обусловлена образованием в воде хлорноватистой кислоты, в процессе ее распада образуется активная форма кислорода, в результате окисляющего действия которого происходит гибель микробной клетки (в том числе в споровой форме). ТХЦК проявляет также фунгицидную и противовирусную активность. В работе [14] показано, что “пороговые концентрации … ТХЦК … практически совпадают с научно обоснованной величиной ПДК циануровой кислоты в воде водных объектов – 6.0 мг/л”. Можно ожидать, что ПДК ТХЦК будет составлять <1.0 г/м³. Цель работы – исследование альгицидного действия препаратов АAS и MP на культуру Scenedesmus quadricauda.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании применяли альгологически чистую культуру S. quadricauda, выращенную на среде Успенского № 1 [15]. Для культивирования использовали климатостат Р-2 (производство ООО “Омикрон”, Россия). Так как чувствительность S. quadricauda зависит от режима освещения (весна–осень) [1], было использовано стандартное чередование день–ночь по 12 ч (соответствует периоду равноденствия). Освещенность составляла 2.5 кЛк, температура культивирования 20 ± 1°C. Культивирование проводили в пробирках с объемом среды 25 мл. Пробирки прикрывали колпачками из фольги. Равномерность освещения и перемешивание достигали использованием устройств, осуществляющих вращение круглого штатива с пробирками.

Численность клеток определяли методом прямого счета в камере Горяева в 25-ти больших квадратах. Для каждой концентрации препаратов и контроля использовали трехкратную повторность. Каждую повторность подсчитывали в 2-х половинах камеры Горяева.

Для определения альгицидного действия был выбран период наиболее интенсивного размножения клеток (экспоненциальная фаза), поскольку именно в этот период проявляется наибольшая чувствительность культуры к воздействию токсикантов. Альгицидное средство в различных концентрациях добавляли в культуральную среду в фазе экспоненциального роста (недельная культура). Концентрации БХ составляли 0.045, 0.09, 0.45, 0.9, 1.8, 4.5 мг/л (1.3 × 10^–7, 2.6 × 10^–7, 1.3 × 10^–6, 2.6 × 10^–6, 5.2 × 10^–6, 1.3 × × 10^–5 М/л; максимальное разведение 4.5 × 10^–8). Испытанные концентрации ТХЦК – 0.095, 0.30, 0.95, 3.0, 9.5, 30.0 мг/л (4.1 × 10^–7, 1.3 × 10^–6, 4.1 × × 10^–6, 1.3 × 10^–5, 4.1 × 10^–5, 1.3 × 10^–4 М/л, максимальное разведение 9.5 × 10^–8, использовали ряд Фульда с инкрементом 3.16).

Общую численность клеток выражали в тыс. кл./мл (или в соответствующих десятичных логарифмах). При изучении БХ и ТХЦК начальные концентрации клеток водоросли составили соответственно 34.7 и 20.5 тыс. кл./мл.

Коэффициент ингибирования (К_инг) (в %) вычисляли по формуле:

где N – количество клеток в контроле и опыте. Отрицательные величины коэффициента ингибирования соответствовали активации размножения клеток по отношению к контролю.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбранные начальные концентрации клеток входят в диапазон концентраций, рекомендуемых [16]; при дальнейшем увеличении плотности культуры водоросли чувствительность к токсикантам уменьшается, что ранее было показано для меди, хрома, кадмия, цинка, стрептомицина [17, 18].

Исходное состояние культуры определяли темпом размножения клеток водоросли. В контроле начальное время удвоениия (в первые 2-е сут) составляло от 0.8 до 1.3 сут, что указывало на нормальное состояние культуры. Спустя 2 нед скорость размножения уменьшалась, при этом время удвоения составляло от 5 до 9 сут. Численность клеток при этом достигала от 2.4 до 3.7 млн. кл./мл.

Одной из причин замедления скорости размножения клеток S. quadricauda с увеличением их численности является изменение величины рН среды. Например, при рН 7.8 время начального удвоения составило около 1.8 сут, при рН 10.0 – около 9 сут. В контроле рН за 8 сут увеличивался с 7.8 до 10.8 за счет фотосинтеза [19]. Свою роль в ингибировании роста клеток в контроле при продолжительном культивировании могли играть также экзометаболиты.

Культура S. quadricauda состоит из значительной части покоящихся клеток, которые не участвуют в размножении. Доля размножающихся клеток различна в разные фазы развития культуры и при воздействии различных веществ. Именно на них в относительно низких концентрациях оказывают влияние тяжелые металлы [20]. При этом уменьшение численности клеток по отношению к контролю при воздействии токсиканта может происходить не за счет гибели клеток, а вследствие перехода клеток в покоящееся состояние. Дополнительный вклад в уменьшение численности клеток культуры вносит процесс их лизиса.

Полученные результаты указывали на высокую эффективность изученных веществ в плане подавления размножения клеток водоросли (рис. 1). Например, значительное снижение роста водорослей при применении БХ достигалось при его концентрациях между 1.3 × 10^–6 и 2.6 × 10^–6 М/л и больше. ТХЦК также действовала в микромолярном диапазоне (между 1.3 × 10^–6 и 4.1 × 10^–6 М/л и больше). То есть максимальная эффективность этих веществ была практически в одном и том же диапазоне концентраций. Однако имелось и важное отличие в их действии на клетки водоросли. Если БХ при высоких концентрациях приводил к полному очищению культуры от клеток, то при максимально высоких испытанных концентрациях ТХЦК оставались жизнеспособные клетки; в присутствии ТХЦК размножение этих клеток не происходило. Численность таких клеток составляла порядка 10–20 тыс./мл и оставалась практически неизменной на протяжении 2-х нед. То есть эффект ТХЦК в значительной степени объясняется альгостатическим действием.

При действии обоих веществ обнаружили явление адаптации клеток к токсикантам. Очень ярко это видно на примере БХ. При концентрации вещества 2.6 × 10^–7 М/л было заметно значительное уменьшение скорости роста культуры по сравнению с контролем. Однако между 4-ми и 11‑ми сутками размножение клеток становилось даже более интенсивным по сравнению с контролем. Величины численности клеток на плато в контроле и при воздействии БХ выравнивались. Усиление размножения клеток между 4-ми и 11‑ми сутками наблюдали при более высокой концентрации БХ (1.3 × 10^–6 М/л). Однако, в конечном итоге, при такой концентрации токсиканта клетки полностью погибали. В случае ТХЦК также наблюдали процесс адаптации при концентрации 1.3 × 10^–6 М/л. При этом вначале происходило торможение роста, хорошо заметное до 2-х суток культивирования, после чего скорость роста становилась практически равной контрольной, а численность клеток спустя 2 нед также достигала уровня контроля. Даже при концентрации ТХЦК 4.1 × 10^–7 М/л влияние вещества различалось в разных фазах роста культуры, при этом в течение первых 2-х сут обнаруживалось ингибирование с последующим повышением скорости размножения и достижением контрольной численности клеток в контроле. То есть малые концентрации токсиканта спустя некоторое время вызывали увеличение скорости размножения клеток по сравнению с контролем.

Отмеченные изменения воздействия токсиканта в разных фазах роста культуры были выражены стимуляцией размножения клеток при низких концентрациях и дальнейшем ослаблении размножения при повышении концентрации токсиканта. Такая же закономерность показана для других веществ-поллютантов (например, меди, хрома, серебра; активация роста происходила соответственно при 1.6 × 10^–8, 3.4–10.2 × 10^–6, 9.2 × 10^–10 М/л) [1, 20]. То есть активация размножения клеток может служить показателем токсического действия вещества.

Учет адаптивного влияния низких концентраций токсиканта предполагает использование заведомо токсичных концентраций с целью предотвратить снижение чувствительности популяций микроводорослей к альгициду.

Приведены зависимости ингибирования роста культуры под влиянием БХ и ТХЦК от логарифма концентрации (в тыс. кл./мл) для различных сроков культивирования (рис. 2). Сравнение графиков на рис. 2 указало еще на одно различие влияния БХ и ТХЦК. Например, в случае применения БХ ингибирование роста культуры увеличивалось монотонно по мере возрастания концентрации токсиканта во всем диапазоне времени культивирования, то влияние ТХЦК в начале культивирования практически не зависело от ее концентрации. Это указывало на то, что влияние ТХЦК скорее всего реализуется сложным механизмом, в котором имеется звено, реагирующее по типу “все или ничего” в узком диапазоне концентраций. Причем это звено более чувствительное в сравнении с тем, которое отвечает за “базовую” токсичность. Известно, что ТХЦК содержит в своем составе 3 атома хлора. При растворении ТХЦК в воде хлор отщепляется от молекулы, образуя в воде активный хлор, который оказывает токсическое влияние на водоросль. В то же время при исследованиях на животных не обнаружены значительные различия токсичности между три- и дихлоризоциануровыми кислотами [14]. Возможно, особенность концентрационной зависимости на 2-е сутки культивирования связана не только с отщепляющимся хлором, но и с влиянием собственно молекулы изоциануровой кислоты: известно, что циануровая кислота высокотоксична в отношении ячменя и редиса [21]. Не исключено, что при этом играет роль также динамика освобождения хлора из состава ТХЦК.

Учитывая, что механизмы действия БХ и ТХЦК различаются, можно ожидать наличие синергичного эффекта при их совместном применении, что можно использовать при создании комплексных альгицидных средств.

Условия культивирования микроводоросли и высших растений близки. При массовом культивированиии микроводоросли Scenedesmus обычно используют те же соли, что и при выращивании высших растений [22]. Это указывает на возможность использования культуры S. quadricauda для тестирования ингибиторов роста (или гербицидов) для высших растений. Данный объект и характеристики его роста можно использовать для экспресс-оценки наличия токсических свойств удобрений, при отборе оптимальных концентраций удобрений и их состава, для контроля эффективности детоксикационных мероприятий, при отборе биостимуляторов и др.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, показано, что, хотя эффективное ингибирование роста культуры микроводоросли Scenedesmus quadricauda испытанными альгицидами достигалось при близких концентрациях, механизм действия этих веществ различался. Например, действие ТХЦК приводило к подавлению размножения клеток. Даже при высоких концентрациях ТХЦК количество клеток водоросли в течение 2-х нед культивирования практически не уменьшалось. В то же время действие БХ приводило не только к прекращению размножения клеток, но и к их полному лизису. Эти особенности следует учитывать при составлении рецептуры альгицидных средств, предназначенных к применению в открытых и закрытых искусственных водоемах.