Агрохимия, 2021, № 6, стр. 65-72

ВВЕДЕНИЕ

Для повышения устойчивости растений, улучшения их свойств и жизнеспособности используют множество гуминовых препаратов [1, 2]. В настоящее время доступны препараты, которые снижают токсическое действие поллютантов [3–6]. Лигногумат (ЛГ) – это гуминовый препарат с высоким содержанием солей гуминовых кислот, состоит на 60% из гуминовых кислот и на 40% из фульвокислот, обогащен биофильными элементами, в том числе серой и такими микроэлементами как Fe, Cu, Mn, Mo, Zn, Se, B, Co. Препарат применяют в растениеводстве, в качестве биологически активных кормовых добавок в животноводстве, в восстановлении почв, а также в биотехнологиях при производстве меристемных культур [7]. Известно, что привнесение лигногумата увеличивает урожайность сельскохозяйственных культур и улучшает качество продукции [8], усиливает иммунитет растений, а также снимает стресс после внекорневых обработок пестицидами и сложными смесями [9]. Однако при увеличении концентрации >1% препарат проявляет свойства ингибитора [4]. Действующие вещества препарата имеют достаточно сложную структуру, которая позволяет связывать токсиканты, переводя их в малоподвижную форму [10].

В современном растениеводстве используют биопрепараты на основе цианобактерий (ЦБ). Ряд ЦБ проявляют функции, схожие с действием препарата лигногумат. Они могут оказывать не только ростстимулирующее действие, но и антибиотическое, способны улучшать состояние растений в условиях сильного загрязнения [11, 12]. Благодаря своим уникальным свойствам и чувствительности к ряду токсикантов, ЦБ используют в целях биотестирования.

Действие препарата лигногумат и цианобактерий на растения можно оценить по ответным реакциям растений ячменя, в частности, по изменению интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и содержанию пластидных пигментов. Содержание пигментов – это чувствительный показатель функционального состояния растений. Факторы разной природы (засуха, чрезмерная инсоляция, поллютанты, насекомые и т.п.) вызывают изменения в пигментном комплексе растений.

Повышенная активация процессов ПОЛ в стрессовых условиях приводит к окислительной деградации макромолекул, инактивации ферментов, нарушению функции мембран митохондрий и хлоропластов и, как следствие, снижению содержания пластидных пигментов [13–15]. В ответ на рост концентрации свободных радикалов в клетке происходит запуск антиоксидантной системы растений. К клеточным антиоксидантам относятся пигменты каротиноиды и антоцианы. Антиоксиданты выполняют защитные функции в клетке, подавляя в растительных тканях окислительные процессы.

Цианобактерии обладают доказанными свойствами улучшать среду обитания растений и образовывать с ними симбиозы, что положительно влияет на жизнедеятельность растений. Например, обработка семян горчицы N. linсkia приводила к усилению фиторемедиационных способностей растения, ЦБ также обладают устойчивостью к нефтепродуктам и метилфосфонатам [16, 17]. Штамм N. paludosum способен восстанавливать супрессивность химически и микологически загрязненных почв [18]. Почвы, инокулированные N. musсorum, проявляют большую устойчивость к деградации во время смачивания и физического разрушения [19]. Эта особенность может помочь предотвратить эрозию почвы, а также способствует повышению вероятности прорастания семян в почвах, содержащих N. musсorum [19, 20]. Выбор ячменя в качестве объекта исследования был обусловлен его высокой хозяйственной ценностью как для пищевой промышленности, так и для сельского хозяйства [21]. Цель работы – изучение влияния цианобактерий и лигногумата на рост и биохимические показатели растений ячменя.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили альгологически чистые культуры цианобактерий N. linсkia (Roth.) Born and Flah. № 271, N. paludosum Kütz. № 18, N. muscorum Ag. № 13, природные биопленки с доминированием N. commune, а также ячмень двурядный сорта Новичок (Hordeum distichum L.).

Видовой и количественный состав альго-цианобактериальной микрофлоры определяли путем прямого микроскопирования в сочетании с методами чашечных и водных культур [22]. Видовой состав БП включал следующие виды: N. commune, N. punctiforne, Phormidium autumnale, Ph. molle, Ph. uncinatum, Leotolyngbya fragilis, L. foveolarum, Chlorella mirabilis, L. поstoсоrит, Borzila trilocularis. Доля ЦБ N. commune в данной биопленке составила 81.6%, прочие 18.4% пришлись на другие гетероцистные и безгетороцистные ЦБ и зеленые водоросли [23]. Биопленки были собраны вдоль обочины железной дороги на песчано-гравийной насыпи.

Титр клеток ЦБ и БП определяли с использованием камеры Горяева [24]. Цианобактерии для экспериментов выбирали по возрасту и титру клеток в фазе экспоненциального роста. Возраст БП исчислялся с момента внесения сухой пленки в питательную среду Громова. Возраст ЦБ и БП составил 5 нед. Титр: N. linсkia – 1.7 × 10⁷ кл./мл, N. paludosum – 1.2 × 10⁷ кл./мл, N. muscorum – 2.7 × 10⁷ кл./мл, природных биопленок с доминированием N. commune – 2.4 × 10⁷ кл./мл.

Культуры цианобактерий и биопленок пересаживали на питательные растворы с соблюдением норм стерильности. Культивировали биопленки и цианобактерии на среде Громова № 6 без азота в течение 5 нед в люминостате при постоянной температуре 25°С и 12-часовом освещении 3000 лк.

Были проведены 2 серии опытов. В первой серии опытов проводили оценку влияния ЛГ на ЦБ и природные БП с доминированием N. commune. Для этого культуры микроорганизмов (2 мл) выдерживали в пробирках на растворе ЛГ (3 мл) в концентрации 1 г/л в течение 24 ч, после чего в клетках определяли содержание хлорофилла а и интенсивность процессов перекисного окисления липидов.

Во 2-й серии опытов семена ячменя в количестве 40 шт. проращивали на увлажненной дистиллированной водой фильтровальной бумаге в чашках Петри в присутствии ЦБ N. muscorum (по 2 мл суспензии на чашку Петри) и без них. Семена проращивали 4 сут в климатостате при постоянной температуре 20°С. Затем проростки пересаживали в водную среду, в качестве которой использовали питательный раствор Кнопа (контроль) и в раствор лигногумата (1 г/л), приготовленный на растворе Кнопа. Дальнейшее проращивание проходило в климатостате при температуре 25°С и 12-часовом освещении 3000 лк.

В фазе 2-х листьев оценивали влияние обработки растений ЦБ, ЛГ и их совместного действия на функциональный статус растений ячменя по биохимическим показателям (интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), содержание пластидных пигментов и антоцианов) и линейному росту.

Для изучения влияния ЦБ, ЛГ и их совместного действия на ростовые процессы отбирали по 30 растений каждого варианта, разделяли по органам, измеряли длину корней и побегов.

Интенсивность ПОЛ анализировали по цветной реакции тиобарбитуровой кислоты с малоновым диальдегидом (МДА), который образуется в процессе ПОЛ [25]. Определяли накопление МДА в культуре ЦБ (нмоль/мл) и в листьях и корнях ячменя (нмоль/г сырой массы).

Экстракцию и количественное определение антоцианов проводили согласно методике [26]. Содержание фотосинтетических пигментов в листьях ячменя определяли фотометрическим методом на спектрофотометре “Specol 1300” (Analytik Jena, Германия) в ацетоновой вытяжке (при длинах волн 662 и 644 нм – хлорофиллы а и б соответственно [27]. Определение каротиноидов проводили при 470 нм [28]. Содержание хлорофилла а в культуре ЦБ оценивали спектрофотометрическим методом при длинах волн 665 и 750 нм [29].

Все эксперименты были выполнены в трехкратной повторности. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных статистических методов [30]. В таблицах приведены средние арифметические величины и стандартное отклонение. Достоверность различий между 2-мя средними оценивали с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Лигногумат относится к препаратам 4-го класса опасности и не оказывает токсическое, мутагенное и канцерогенное действие на растения и здоровье человека. Однако при превышении концентрации >1% препарат проявляет свойства ингибитора. Действие различных концентраций на растения хорошо изучено, но влияние ЛГ на ЦБ и прочие микроорганизмы изучено слабо. Именно поэтому была выбрана концентрация ЛГ (1 г/л), которая рекомендована производителем для использования и ее наиболее часто применяют, т.к. она не способна оказывать токсическое влияние на растения.

В первой серии опытов было установлено, что ЛГ (1 г/л) вызывал рост интенсивности процессов ПОЛ в клетках ЦБ. Во всех вариантах эксперимента, как в альгологически чистых культурах ЦБ, так и природных БП, отмечали возрастание уровня МДА – основного продукта реакций ПОЛ (рис. 1). Накопление МДА является одним из симптомов развития окислительных процессов в клетках [31]. Наибольшее содержание МДА отмечали в варианте с использованием ЦБ N. linckia и БП, где интенсивность процессов ПОЛ была более чем в 4 раза больше по сравнению с контролем.

Рис. 1.

Влияние лигногумата на активность перекисного окисления липидов в клетках цианобактерий и природных биопленок с доминированием N. commune.

В вариантах с действием ЛГ на N. linckia и N. paludosum активация ПОЛ сопровождалась значительным снижением количества хлорофилла а в клетках (рис. 2). Уменьшение содержания хлорофилла а может быть следствием активации окислительных процессов, в ходе которых происходила деградация молекул хлорофилла, а также инактивация ферментов биосинтеза пигментов. Цианобактерия N. muscorum и природные БП были более устойчивы к действию ЛГ. Под влиянием ЛГ содержание зеленого пигмента в клетках ЦБ возрастало более чем в 3 раза по сравнению с контролем.

Рис. 2.

Влияние лигногумата на содержание хлорофилла а в клетках цианобактерий и природных биопленок с доминированием N. commune.

В стрессовых условиях изменение интенсивности процессов ПОЛ может свидетельствовать как о патологических состояниях, так и о процессах адаптации [32]. Устойчивость к факторам внешней среды БП обеспечивается их поликомпонентностью: фототрофные и сапротрофные микроорганизмы и их бактерии-спутники [33, 34]. Ранее была показана устойчивость ЦБ N. muscorum к действию фосфорорганического ксенобиотика – метилфосфоновой кислоты [35]. Вероятно, при высокой интенсивности процессов ПОЛ разрушению хлорофилла а препятствовала эффективная работа антиоксидантной системы в клетках ЦБ, которая включает множество активных веществ. Известно, что высокую устойчивость ЦБ к действию стрессовых факторов обеспечивает содержание токоферола и фенольных соединений [36], каротиноидов [37], антиоксидантов аскорбат-глутатионового цикла [38], флавоноидов [39]. В случае БП и ЦБ N. muscorum повышенное накопление МДА могло свидетельствовать о процессах адаптации.

На основании ответных реакций ЦБ можно сделать вывод о высокой чувствительности ЦБ N. linckia и N. paludosum к действию ЛГ. Биопленки с доминированием N. commune и ЦБ N. muscorum, напротив, отличались повышенной устойчивостью к гуминовому препарату.

Для исследования эффектов ЦБ и ЛГ на жизнедеятельность растений ячменя была выбрана ЦБ N. muscorum, как наиболее устойчивая к действию ЛГ. Во 2-й серии опытов семена ячменя инокулировали при проращивании ЦБ и переносили в питательный раствор, содержащий лигногумат.

Известно, что лигногумат (0.2, 0.5 и 1 г/л) не оказывает влияние на всхожесть и энергию прорастания семян ячменя [40]. Предварительная инокуляция семян ячменя ЦБ N. muscorum вызывала повышение их жизнеспособности [35].

Установлено, что ЦБ N. muscorum вызывала активацию процессов ПОЛ в листьях ячменя (рис. 3а). В вариантах с действием ЛГ, напротив, уровень МДА в листьях был меньше на 20% по сравнению с контролем.

Рис. 3.

Влияние препарата лигногумат и цианобактерии N. muscorum на активность перекисного окисления липидов: (а) – в листьях, (б) – корнях растений ячменя.

По сравнению с надземной частью, корни реагировали на ЛГ и ЦБ N. muscorum иначе (рис. 3б). Обработка семян ЦБ N. muscorum приводила к снижению интенсивности процессов ПОЛ в корнях (на 49% меньше контроля). При действии ЛГ также отмечали незначительное снижение МДА в корнях. Однако совместное действие на растения ЦБ и ЛГ вызывало активацию процессов ПОЛ в корнях. Это могло быть связано с комплексным действием на корни ЛГ, ЦБ и экзометаболитов ЦБ и направлено на адаптацию растений к условиям произрастания.

Развитие окислительных процессов в клетках листьев ячменя оценивали по накоплению веществ с антиоксидантыми свойствами – каротиноидов и антоцианов. В листьях растений, которые перед посадкой были обработаны N. muscorum, содержание каротиноидов было близко к контролю, но уровень антоцианов значительно возрастал (табл. 1). Ранее было показано, что ЦБ вызывали активацию процессов ПОЛ в листьях растений этого варианта. По-видимому, N. muscorum индуцировала развитие окислительных процессов в клетках листьев ячменя, которые способствовали адаптации к действию ЦБ. Результатом эффективной работы антиоксидантной системы являлся уровень хлорофиллов в листьях. В варианте с инокуляцией семян ЦБ содержание хлорофиллов было больше, чем в контроле.

В опытах с действием на растения ЛГ и ЛГ с ЦБ N. muscorum также отмечали накопление в листьях антиоксидантов – антоцианов и каротиноидов, при этом интенсивность процессов ПОЛ была снижена по сравнению с контролем. В присутствии ЛГ в листьях ячменя содержание хлорофиллов было больше по сравнению с контрольными растениями.

Интегральным процессом, который отражает степень приспособления растений к условиям обитания, является рост. Предпосевная инокуляция семян ЦБ N. muscorum, как и ЛГ, стимулировала процессы линейного роста органов ячменя (рис. 4). В большей степени ростактивирующее действие на растения ячменя проявилось в варианте с совместным действием ЛГ и ЦБ N. muscorum. В большей степени происходила стимуляция роста корней по сравнению с надземными органами.

Рис. 4.

Влияние лигногумата и цианобактерии N. muscorum на линейный рост растений ячменя, *различия достоверны при р <0.05.

ВЫВОДЫ

1. На основании изучения интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и накопления хлорофилла а в клетках цианобактерий (ЦБ) установлено, что лигногумат (ЛГ) в концентрации 1 г/л оказывал неоднозначное действие на ЦБ. Для ряда культур ЛГ в исследованной концентрации выступал в качестве стресс-фактора.

2. Высокая чувствительность к ЛГ, которая проявилась в многократном росте интенсивности процессов ПОЛ в клетках и существенном снижении уровня хлорофилла а, отмечена у ЦБ N. linckia и N. paludosum. ЦБ N. muscorum и природные биопленки с доминированием ЦБ N. commune были наиболее устойчивы к действию гуминового препарата ЛГ.

3. Предпосевная обработка семян ЦБ N. muscorum оказывала фитостимулирующее действие на опытные растения. В листьях растений ячменя, выращенных с использованием ЦБ в присутствии ЛГ, отмечено снижение интенсивности процессов ПОЛ. В корнях ячменя при совместном действии ЛГ и ЦБ, напротив происходило накопление МДА. Выявлена стимуляция ростовых процессов в проростках опытных растений. Цианобактериальная инокуляция семян N. muscorum и использование ЛГ способствовала росту корней и побегов ячменя. Установленная закономерность может быть использована для разработки биопрепарата для повышения устойчивости растений.

Выражаем благодарность доктору биологических наук, профессору Л.В. Кондаковой за предоставленные для исследования природные биопленки с доминированием цианобактерий и определение их видового состава.

Благодарим музей фототрофных микроорганизмов кафедры ботаники, физиологии растений и микробиологии им. Э.А. Штиной ВятГСХА (г. Киров) за опытные культуры цианобактерий.