Агрохимия, 2021, № 9, стр. 62-74

ВВЕДЕНИЕ

Закономерности миграции в почве и транслокации в различные части растений тяжелых металлов (ТМ) являются теоретическим базисом, на основе которого формируются научно-практические подходы к решению проблемы реабилитации техногенно-загрязненных территорий. Основными аспектами последней являются снижение миграционной способности ТМ в почве и перехода их в природные воды, а также ограничение транслокации в сельскохозяйственные растения. Для системы почвенный раствор–растение изучение закономерностей корневого поглощения ТМ и их транслокации в растения позволяет вскрыть механизмы слежения за этими процессами на разных уровнях организации растительного организма. Интересно изучение закономерностей (дозовых и временных зависимостей) конкурентного взаимодействия ТМ-ксенобиотиков (например, Cd) с микро- и макроэлементами на этапе поглощения из субстрата корнями и последующей транслокации, а также ответных реакций растений как на физиолого-биохимическом уровне (в виде изменения фитотоксичности ТМ-ксенобиотиков), так и на молекулярно-генетическом уровне (изучение экспрессии ряда генов-кандидатов). Доступность растениям (подвижность) ТМ определяется свойствами почвы, изменяя которые можно существенно влиять на их накопление в растительной продукции. К почвенным факторам относятся: гранулометрический состав, содержание органического вещества, реакция среды, емкость катионного обмена, содержание подвижных соединений железа, марганца, алюминия, фосфора и др. [1, 2]. В работе приведены результаты комплексного вегетационного эксперимента. Исследования проводили с растениями ячменя (Hordeum vulgare L.) на фоне загрязнения почвы 2-мя ТМ: биогенного Zn и ксенобиотика Cd. Цинк необходим для жизнедеятельности растений, поскольку принимает участие в белковом и углеводном обмене, окислительных процессах, влияет на формирование генеративных органов, проницаемость мембран, стабилизирует клеточные компоненты. Zn участвует также в синтезе РНК и хлорофилла [2]. В малых количествах, являясь жизненно важным элементом, при накоплении в высоких концентрациях Zn может оказывать токсическое действие на организм [3, 4]. Тем не менее, уровень фитотоксичных концентраций его в тканях растений достаточно высок: 100–500 мг/кг [4]. Поглощение Zn корнями растений может быть как активным процессом, так и пассивным, в зависимости от его концентрации в субстрате [3–5]. Механизмы процессов поглощения и транслокации ТМ растениями установлены не полностью, поэтому требуется проведение дальнейших исследований по изучению закономерностей корневого поглощения поллютантов. В системе почва–растение фитотоксичность Zn контролируется не только способностью растений ограничивать поступление ТМ, но и эдафическими свойствами почв.

Загрязнение почвы кадмием является одним из наиболее опасных экологических явлений. Кадмий по химическим свойствам близок к цинку и отличается от него еще большей подвижностью в кислых средах. Концентрация Cd в почвенных растворах находится в интервале 0.2–6 мкг/л [4]. Содержание Cd в растениях зависит от концентрации его подвижных форм в почве. В незагрязненных почвах его содержание в сухой биомассе растений, как правило, не превышает 0.1–0.8 мг/кг [6]. Биологическая роль Cd изучена очень слабо. Известно, что Cd – токсикант, канцероген, тератоген. Он негативно влияет на рост и развитие растений [4, 7]. Считается, что кадмий выступает в роли природного антагониста цинка, препятствуя поступлению последнего в растения [4, 6]. Поступление Cd в надземные части происходит по барьерному типу [8, 9]. Высокая фитотоксичность кадмия объясняется его близостью по химическим свойствам к цинку. Кадмий может выступать в роли цинка во многих биохимических процессах, нарушая работу таких ферментов как карбоангидраза, различные дегидрогеназы, фосфатазы, связанных с дыханием растений и другими физиологическими процессами, а также протеиназ и пептидаз, участвующих в белковом обмене, ферментов обмена нуклеиновых кислот и др. Как химический аналог цинка, кадмий может заменять его в ферментной системе, необходимой для фосфорилирования глюкозы и сопровождающей процесс образования и потребления углеводов [6].

Особенности транспорта, накопления кадмия и цинка, а также морфологического ответа растений на их комплексное действие, по-видимому, связаны с дифференциальной экспрессией генов, вовлеченных в транспорт этих ТМ и в ответ растений на их накопление. Среди потенциальных генов, экспрессия которых в корнях может отражать особенности транспорта и накопления цинка и кадмия при совместном действии, можно выделить гомологи генов DCD, LCD, ZIP4, HMA4, PCR1. Функции данных генов в основном известны из исследований на модельном растении Arabidopsis thaliana L., а информация об экспрессии их гомологов у сельскохозяйственных культур фрагментарна. Ген DCD кодирует D-цистеиндесульфгидразу, разлагающую D-цистеин на пируват, сероводород (H₂S) и аммиак (NH₃). Молекулы газа H₂S участвуют в ответе растений на кадмиевый стресс, а производство H₂S при участии D-цистеиндесульфгидразы увеличивает устойчивость к кадмию в модельном растении A. thaliana. Мутантная линия, в которой был нокаутирован ген DCD, аккумулировала больше кадмия и активных форм кислорода (АФК) и в целом характеризовалась повышенной чувствительность к кадмию. В то же время трансгенная линия, сверхэкспрессирующая DCD, характеризовалась сниженным накоплением кадмия и АФК, а также была более устойчива к кадмию по сравнению с растениями дикого типа. Активация экспрессии гена DCD в ответ на воздействие кадмия связана с работой индуцируемого кадмием транскрипционного фактора WRKY13 [10]. Ген LCD кодирует L-цистеиндесульфгидразу, разлагающую L-цистеин также на пируват, сероводород и аммиак. Таким образом, белки DCD и LCD участвуют в производстве H₂S, который связан с устойчивостью растений и других организмов к действию кадмия [11]. По-видимому, H₂S, продуцируемый DCD и LCD, может снижать накопление кадмия за счет усиления экспрессии генов, кодирующих транспортеры кадмия из клетки в апопласт [10]. PCR1 кодирует белок plant cadmium resistance 1 (PCR1), и растения с повышенной экспрессией этого гена более устойчивы к действию кадмия [12], при этом белок PCR1 вовлечен в радиальный транспорт кальция Ca²⁺ в корнях и его дальнейшее перемещение в надземную часть растений [13]. Усиление экспрессии этого гена и снижение аккумуляции кадмия также может быть вызвано действием H₂S, синтезирующегося в реакциях с участием цистеиндесульфгидраз [10]. Ген ZIP4 кодирует предшественник цинкового транспортера 4, который принадлежит к белковому семейству ZIP. Транскрипционная активность гена ZIP4 повышается в ответ на дефицит цинка в корнях и побегах. Использование экзогенной абсцизовой кислоты (АБК) ингибирует экспрессию ZIP4 в растениях A. thaliana, подвергшихся воздействию кадмия [14]. Экспрессия гена ZIP4 взаимосвязана с локальными концентрациями цинка в корнях и побегах растений [15–17]. HMA4 кодирует АТФазу 4, ассоциированную с ТМ, которая связана с загрузкой Cd²⁺ в ксилему для транспорта от корней к побегам [10]. Эта АТФаза также участвует в транслокации цинка от корней к побегам, а повышенная экспрессия гена HMA4 приводит к гипераккумуляции кадмия и цинка в растениях [18]. Экспрессия данного гена регулируется жасмонатным сигнальным путем: добавление в среду экзогенного метилжасмоната приводит к снижению экспрессии HMA4 и уменьшению накопления кадмия [19].

Цель работы – выявление закономерности распределения и оценка параметров миграции Zn и Cd в системе почва–почвенный раствор–растение в динамике в условиях совместного загрязнения дерново-подзолистой почвы легкого гранулометрического состава этими ТМ, а также анализ экспрессии вышеупомянутых генов, связанных с транспортом и накоплением Zn и Cd в корнях экспериментальных растений и с ответом на ТМ-стресс.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ закономерностей миграции Cd и Zn в системе дерново-подзолистая почва–почвенный раствор–ячмень. Поведение Zn и Cd в системе почва–растение изучали в вегетационных опытах в теплице до достижения растениями возраста 79 сут (температура 25–35°С, относительная влажность воздуха 60–70%, влажность почвы – 55% ПВ), (рис. 1).

Объектом исследования был ячмень (Hordeum vulgare L.) сорта Зазерский 85, выращенный на дерново-подзолистой супесчаной почве, тяжелые металлы Zn и Cd. Физические и химические показатели почвы определяли общепринятыми методами (табл. 1) [20, 21]. Варианты опыта – Cd₁₀Zn₀, Cd₁₀Zn₀, Cd₁₀Zn₅₀, Cd₁₀Zn₁₀₀, Cd₁₀Zn₁₅₀. Максимальный возраст тест-растений – 79 сут. Повторность вегетационного опыта четырехкратная.

Растения выращивали в пластиковых сосудах, содержащих 5 кг почвы. Были высажены пророщенные 3-суточные семена в количестве 25 шт./сосуд. Не менее чем за 30 сут перед посадкой проростков в почву вносили Zn в виде водного раствора нитрата в количестве 0 (контроль), 50, 100, 150 мг/кг, вместе с Cd (также в виде водного раствора нитрата) в количестве 10 мг/кг. Дозы ТМ подбирали, исходя из установленных в предыдущих исследованиях [7] субкритических концентраций металлов для дерново-подзолистой почвы. Общая концентрация цинка в почве при этом составляла 30.7, 80.7, 130.7, 180.7 мг/кг, кадмия – 0.4 и 10.4 мг/кг. Затем добавляли питательные элементы в виде водных растворов солей (NH₄NO₃, KH₂PO₄, K₂SO₄) из расчета N₂₀₀P₁₀₀K₁₀₀. При этом в каждом варианте, включая контрольный, количество внесенного азота корректировали с помощью азотнокислого аммония до указанной величины содержания его в почве 200 мг/кг.

После внесения растворов солей почву в сосудах инкубировали в течение 30 сут. Контролем служил вариант NPKZn₀Cd₀. Отдельные показатели регистрировали в динамике. Для этого из части сосудов через 18, 40, 60 и 79 сут после посева снимали урожай надземной биомассы, проводили анализ морфометрических показателей растений, извлекали почвенные растворы и определяли формы нахождения ТМ в почвах. Концентрацию Zn и Cd в корнях и надземных частях ячменя, содержание подвижных форм и валовое количество элементов в почвах определяли в соответствии с методиками [20–22]. Квазиравновесные почвенные растворы были получены центрифугированием в соответствии с методикой [23]. В почвенных растворах определяли pH, содержание Zn, Cd, микро- и макроэлементов. Концентрацию Zn и Cd определяли методом ICP-OES на приборе Liberty II фирмы “Varian”.

Прирост надземной биомассы растений описывали с помощью логистической (S-образной) функции [23–25]:

где M_max – максимальная возможная масса 1-го растения, г, M₀ – начальная масса 1-го растения (расчетная величина), г, μ – удельная скорость прироста биомассы растения, сут^–1, t – время, сут.

Содержание Zn и Cd в растениях увеличивается в ходе онтогенеза. При этом зависимость изменения концентраций Zn в вегетативных органах растений от времени носит асимптотический характер, приближаясь к максимуму [Zn]_max,раст, характерному для каждой концентрации Zn в почве и вида растения. Подобная зависимость может быть описана уравнением:

где [Zn]_раст – концентрация Zn в растении, мг/кг, β – константа накопления металла, сут^–1, t – время.

Величины параметров уравнений (1), (2) – M_max, M₀, μ, [Zn]_{max, раст} и β подбирали с использованием модуля “поиск решения” программы Excel с алгоритмом последовательных итераций, с минимизацией ошибки E = $\sum {[{{K}_{c}}} $(расч) – K_c (измерен)]².

Для характеристики степени криволинейной зависимости использовали корреляционное отношение η, величины ошибки (s_η) и критерия существенности корреляционного отношения (t_η) [26]. Корреляционное отношение рассчитывали по формуле:

где $\sum {{{{(Y - \bar {Y})}}^{2}}} $ – сумма квадратов отклонения индивидуальных величин Y от общей средней арифметической $\bar {Y}$, $\sum {{{{(Y - {{{\bar {Y}}}_{x}})}}^{2}}} $ – сумма квадратов отклонений вариант от рассчитанных на основании аппроксимирующего уравнения средних величин зависимой переменной (${{\bar {Y}}_{x}}$), соответствующих фиксированным величинам аргумента X. Ошибку корреляционного отношения рассчитывали по формуле: где n – объем выборки. Критерий существенности корреляционного отношения рассчитывали по формуле:

Анализ экспрессии генов, ассоциированных с транспортом кадмия и цинка и устойчивостью к ним, в корнях растений ячменя. Последовательности гомологов целевых генов в геноме ячменя обыкновенного Hordeum vulgare L. были подобраны при помощи инструмента BLAST в базе данных Ensembl Plants, содержащей геном ячменя обыкновенного. В программе Primer BLAST были подобраны праймеры для данных генов с анализом специфичности против базы данных последовательностей ячменя обыкновенного, доступных в NCBI. Последовательности праймеров приведены в табл. 2. Все разработанные праймеры характеризовались хорошей специфичностью (продукты амплификации были проанализированы в 2%-ном агарозном геле).

Корни ячменя, отобранные на 19-е сут прорастания в загрязненной ТМ почве, промыли в дистиллированной воде для удаления почвенных частиц. Затем ткани корней заморозили в жидком азоте и хранили в нем до анализа. Было отобрано по 4 образца тканей корней в каждом экспериментальном варианте: Cd₀Zn₀, Cd₁₀Zn₀, Cd₁₀Zn₅₀, Cd₁₀Zn₁₀₀, Cd₁₀Zn₁₅₀. Выделение тотальной РНК проводили из не более чем 100 мг сырой массы корней, гомогенизируя ткань в жидком азоте с добавлением поливинилпирролидона, а затем используя колонки GeneJET Plant RNA kit (Thermo Fisher Scientific) по протоколу производителя. Качество выделенной РНК проверяли на спектрофотометре NanoDrop-2000. Показатели чистоты образцов варьировали: показатель A_260/230 составил от 0.30 до 2.26, указывая на загрязнение некоторых образцов фенольными соединениями, а показатель A_260/280 составил от 1.91 до 2.24, свидетельствуя о низком содержании белков в очищенных образцах РНК. 0.1 мкг выделенной РНК подвергли обработке ДНКазой (DNase I, Thermo Fisher Scientific) и затем без разбавления использовали для синтеза кДНК с набором MMLV RT kit (Евроген) по протоколу производителя. Полученную матрицу использовали для проведения ОТ-ПЦР в реальном времени на приборе ДТ-96 (ДНК–Технология) с применением набора qPCRmix-HS SYBR Green (Евроген) по протоколу производителя. Дифференциальную экспрессию генов оценивали при помощи метода –ΔΔСp.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В эксперименте изучали динамику трансформации подвижных форм Zn и Cd в почве (рис. 2). С увеличением дозы Zn содержание подвижных форм Zn в почве возрастало. Полученная зависимость, усредненная по времени отбора проб, может быть удовлетворительно описана с помощью линейной функции [Zn]_подв.(%) = 0.27[Zn]_вал, R² = 0.99.

Содержание подвижных форм Cd в почве также возрастало: сначала с 0.18 ± 0.12 до 4.5 ± 3.0 мг/кг при внесении в почву металла в количестве 10 мг/кг и далее не изменялось, варьируя в диапазоне (4.9 ± 2.3) – (5.3 ± 2.7) мг/кг с увеличением количества внесенного в почву Zn (от 50 до 150 мг/кг).

Из диаграмм на рис. 2 следует, что несмотря на общепринятое положение о близости химических характеристик исследованных металлов Zn и Cd [4, 6], нельзя не отметить и их довольно существенное различие при взаимодействии с химически неоднородными почвенными компонентами. Например, соотношение относительного содержания кадмия к относительному содержанию цинка в подвижной форме в исследованной к почве составило в среднем 0.45, незначительно отклоняясь от этой величины в разных вариантах опыта.

В течение вегетационного периода из почвенных сосудов сразу после высаживания пророщенных семян ячменя (на 1-е сут после внесения Zn и Cd в почву), а также на 18-е, 23-и, 34-е, 40-е, 58-е и 79-е сут после внесения металлов в почву, извлекали почвенные растворы. Установлено, что уменьшение концентрации Zn в почвенном растворе в зависимости от времени можно удовлетворительно описать экспоненциальными уравнениями вида: [Zn]_{почв. раствор} = Aexp(–Bt), где A и B – параметры, t – время, сут (рис. 3). Величины параметров A и B и величины коэффициентов детерминации (R²) соответственно для вариантов опыта составили: Zn₀Cd₀ (0.98, 0.02, 0.39), Zn₀Cd₁₀ (0.78, 0.02, 0.31), Zn₅₀Cd₁₀ (12.82, 0.03, 0.70), Zn₁₀₀Cd₁₀ (32.78, 0.05, 0.90), Zn₁₅₀Cd₁₀ (76.81, 0.05, 0.87).

Во всех вариантах опыта (за исключением варианта Cd₀) установлено, что концентрации Cd в почвенном растворе уменьшались со временем в соответствии с обратной экспоненциальной зависимостью. Динамику концентрации Cd в почвенных растворах, так же как и в случае с Zn, можно удовлетворительно описать экспоненциальными уравнениями вида: [Cd]_{почв. раствор} = = C exp(–Dt), где C и D – параметры, t – время, сут. Величины параметров C и D и величины коэффициентов детерминации (R²) соответственно в вариантах опыта составили: Zn₀Cd₀ (корреляция отсутствует), Zn₀Cd₁₀ (2.19, 0.04, 0.82), Zn₅₀Cd₁₀ (2.27, 0.03, 0.80), Zn₁₀₀Cd₁₀ (3.52, 0.05, 0.90), Zn₁₅₀Cd₁₀ (4.18, 0.04, 0.93).

Снижение концентрации Zn и Cd в почвенных растворах (за исключением вариантов Zn₀ и Cd₀), отобранных из сосудов с вегетирующими растениями, было связано как с истощением запаса водорастворимых форм металлов в почве в результате непрерывного поглощения корнями растений, не компенсируемого десорбцией Zn и Cd из почвенного поглощающего комплекса (ППК) в почвенный раствор, так и с процессами возможной трансформации подвижных (доступных растениям) форм нахождения металла в малоподвижные (“фиксации” Zn и Cd). Для вариантов Zn₀ и Cd₀ вышеуказанный тренд выявить не удалось из-за высокой вариабельности экспериментальных данных.

Экспериментально получены величины сухой биомассы надземных органов и корней ячменя на 1-е, 18-е, 40-е, 60-е и 79-е сут после появления всходов. Приблизительно после 50-х сут вегетации в варианте Zn₀Cd₀ и 75-х сут вегетации в остальных вариантах опыта положительную динамику изменения биомассы не отмечали. На основании этих данных построены логистические кривые, аппроксимирующие динамику сухой биомассы надземных органов растений и полиномы 2-й степени, удовлетворительно аппроксимирующие динамику сухой биомассы корней (рис. 4).

Величины параметров логистических кривых M_max (г) M₀ (г), μ (сут^–1) для исследованной почвы при различных дозах внесенных Zn и Cd представлены в табл. 3.

Полученные данные по накоплению биомассы растений в условиях вегетационного опыта показали, что внесение в почву ТМ в субкритических концентрациях (кадмия – до 10, цинка – до 150 мг/кг) не приводило к выраженным фитотоксическим эффектам, определяемым на основании морфометрических показателей (уменьшение скорости созревания ячменя, изменения биомассы надземных органов и корней растений).

На рис. 5 представлены данные по изменению содержания Zn и Cd в различных органах тест-растений в зависимости от концентрации металлов в почве, а также от времени, прошедшего с момента начала вегетации, которые показали, что концентрационная зависимость между содержанием Cd в почве и надземных органах ячменя присутствует только в вариантах с внесением металла в почву и без внесения. Внесение возрастающих количеств Zn в остальных вариантах опыта при неизменном количестве (дозе) внесенного Cd не влияло на содержание последнего в надземных органах растений.

В то же время внесение в почву возрастающих количеств Zn при одинаковой дозе внесенного Cd (10 мг/кг) привело к увеличению накопления первого в надземных органах растений в соответствии с линейной зависимостью: [Zn]_раст = = 4.34[Zn]_почв (рис. 6). Показано, что достоверных различий в накоплении Zn надземными органами растений при дополнительном внесении в почву Cd в варианте Cd₁₀Zn₀ по сравнению с контрольным вариантом Cd₀Zn₀ не обнаружено.

Экспериментальный материал в графической форме для последующего анализа данных об изменении транслокационного соотношения (ТО_ТМ) = ТМ_{надз.органы} : ТМ_корни в динамике при совместном внесении в дерново-подзолистую супесчаную почву Zn и Cd в разных вариантах опыта представлен на рис. 7а: ТО_Zn снижалось по мере развития растений, но достоверно не изменялось по мере повышения дозы Zn, внесенного в почву одновременно с кадмием.

На рис. 7б дано изменение транслокационного отношения ТО_Cd = (Cd_{надз.органы} : Cd_корни) в различных органах растений (надземных и корнях) в динамике при совместном внесении в почву Zn и Cd в разных вариантах опыта. ТО_Cd не только снижалось по мере развития растений, но увеличивалось по мере повышения дозы Zn, внесенного в почву одновременно с кадмием. При этом общее содержание кадмия в надземных частях ячменя фактически не изменялось в вариантах опыта с внесением Cd, варьируя в диапазоне 20–45 мг/кг сухой массы. Однако существенно снижалась концентрация кадмия в корнях с увеличением количества (дозы) внесенного цинка. Кроме того, общее содержание Cd в корнях ячменя с возрастом также повышалось (рис. 5в). Это свидетельствовало по меньшей мере о 2-х аспектах проблемы корневого поглощения кадмия: 1 – конкурентного взаимодействия Zn и Cd при поглощении ионов металлов из почвенного раствора корневым поглощающим комплексом (КПК) – чем больше соотношение [Zn] : [Cd] в почвенном растворе, тем больше соответствующее соотношение в КПК (при ограниченной емкости последнего); 2 – наличия стабильного и не зависящего от конкурентного взаимодействия с Zn канала поступления кадмия в симпласт растений ячменя.

Согласно некоторым литературным данным [4], важное значение при оценке фитотоксического эффекта от повышенной концентрации кадмия в надземных органах растений играет соотношение массовых концентраций [Cd] : [Zn] в корнях: чем оно меньше, тем слабее фитотоксический эффект. Полученные результаты (табл. 4) показали очевидное снижение фитотоксического эффекта Cd при дополнительном внесении в почву Zn. Временная динамика соотношения [Cd] : [Zn] в корнях не была выявлена. В то же время, для надземных органов ячменя был отмечен незначительный нисходящий тренд вышеуказанного соотношения.

При оценке в ходе настоящего эксперимента зольности различных частей ячменя в динамике удалось зафиксировать тенденцию к снижению данного показателя, начиная с 18-суточного возраста и вплоть до фазы начала молочной спелости (79 сут), для вегетативной массы растений. Зольность корней, напротив, постепенно возрастала (рис. 8). Причем для последних наблюдали и отклонения от вышеуказанной тенденции. Возможно, это было связанно с недоучетом массы корней в последний срок отбора образцов в связи с методическими затруднениями при промывке корней в фазе созревания семян.

Анализ экспрессии генов, связанных с транспортом ТМ и с клеточным ответом на Cd и Zn, может прояснить молекулярные механизмы отмеченных закономерностей переноса и накопления данных ТМ. Кратность изменения экспрессии изученных генов (Fold Change, FC) в корнях растений ячменя по сравнению с контрольным вариантом Cd₀Zn₀ для разных концентраций тяжелых металлов в почве приведена в табл. 5.

Выявлено, что воздействие Cd и Zn не оказало значимого эффекта на экспрессию гомолога гена DCD. При этом минимальная концентрация Zn 50 мкг/кг приводила к двукратному увеличению транскрипционной активности по сравнению с контролем, а концентрации цинка 100 и 150 мг/кг приводили к подавлению экспрессии гомолога гена LCD. В корнях растений, произраставших на почве с содержанием кадмия 10 мг/кг, наблюдали резкое снижение экспрессии гомолога HMA4, не зависящее от концентрации Zn. Противоположную ситуацию наблюдали в отношении экспрессии гомолога гена PCR1, где 10 мг Cd/кг привели к существенному увеличению транскрипционной активности данного гена. Подавление экспрессии гомологов генов LCD, ZIP4 и HMA4 могло свидетельствовать о снижении производства H₂S [10] в клетках изученного сорта ячменя при воздействии ТМ, снижении транспорта Zn и увеличении концентраций стрессового фитогормона АБК [14], а также о снижении аккумуляции Zn и Cd в растениях за счет подавления экспрессии гомолога АТФазы HMA4. Данный ген является перспективным для исследования снижения накопления Cd в корнях при повышении концентраций Zn. Стрессовый ответ растений на ксенобиотик Cd также мог быть выражен в повышении экспрессии гомолога гена PCR1, ассоциированного с увеличением устойчивости к действию Cd и с возможным накоплением кальция в листьях растений. Для выявления молекулярных причин снижения накопления Cd в корнях при повышении концентраций Zn необходимо расширить выборку изучаемых генов-кандидатов, однако предварительные данные свидетельствовали о возможной роли гомолога гена HMA4 в данном процессе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе вегетационных опытов с ячменем на дерново-подзолистой супесчаной почве, в которую дополнительно вносили Zn в дозах Zn₀, Zn₅₀, Zn₁₀₀, Zn₁₅₀ и Cd в дозе 10 мг/кг, установлено следующее.

Содержание подвижных форм Zn в почве возрастало с увеличением концентрации металла в соответствии с зависимостью, которая может быть описана с помощью линейной функции: [Zn]_подв.(%) = 0.27 × [Zn]_вал. (мг/кг), R² = 0.99. Содержание подвижных форм Cd в почве также возрастало при внесении металла в дозе Cd₁₀ с 0.18 ± ± 0.12 до 4.5–5.3 мг/кг. Соотношение относительного содержания подвижных форм кадмия и цинка в исследованной почве составило в среднем 0.45.

Во всех вариантах опыта (за исключением вариантов Zn₀ и Cd₀) установлено, что концентрации Zn и Cd в почвенном растворе уменьшались со временем в соответствии с обратной экспоненциальной зависимостью вследствие процесса истощения запаса водорастворимых форм Zn и Cd в почве в результате непрерывного поглощения корнями растений.

Изменение биомассы ячменя в вариантах опыта хорошо аппроксимируется логистическими кривыми. Установлено, что внесение в почву ТМ в субкритических концентрациях (кадмия – до 10 мг/кг, Zn – до 150 мг/кг) не приводило к выраженным фитотоксическим эффектам.

Внесение возрастающих количеств Zn при одинаковой дозе внесенного Cd (10 мг/кг) привело к увеличению накопления первого в надземных органах растений в соответствии с линейной зависимостью: [Zn]_раст = 4.34[Zn]_почв. При дополнительном добавлении в почву Cd в варианте Cd₁₀Zn₀ по сравнению с контрольным вариантом Cd₀Zn₀ достоверные различия в накоплении Zn надземными органами растений отсутствовали.

Транслокационное отношение ТО_Cd = = (Cd_{надз.органы} : Cd_корни) в различных органах растений (надземных и корнях) увеличивалось по мере повышения дозы Zn, внесенного в почву одновременно с кадмием. При этом общее содержание кадмия в надземных органах ячменя фактически не изменялось в вариантах опыта с внесением Cd, варьируя в диапазоне 20–45 мг/кг сухой массы. С увеличением количества внесенного цинка существенно снижалась концентрация кадмия в корнях. Общее содержание Cd в корнях ячменя с возрастом также увеличивалось. Величины ТО_Zn в различных органах растений (надземных и корнях) уменьшались по мере развития растений, но достоверно не изменялись по мере повышения дозы Zn, внесенного в почву одновременно с кадмием. Подобно Cd, содержание цинка в корнях достоверно увеличивалось до фазы цветения (60 сут), а затем снижалось. Временнóй динамики соотношения [Cd] : [Zn] в корнях выявить не удалось. В то же время для надземных органов ячменя был отмечен незначительный нисходящий тренд вышеуказанного отношения.

Начиная с 18-суточного возраста и вплоть до фазы начала молочной спелости (79 сут), наблюдали снижение зольности вегетативной массы растений, в то время как зольность корней, напротив, постепенно возрастала.

Воздействие Cd и Zn не оказало значимого эффекта на экспрессию гомолога гена DCD. Все использованные концентрации Zn привели к значимому ингибированию экспрессии гомолога гена ZIP4, а также гомологов генов LCD и HMA4.