Агрохимия, 2022, № 12, стр. 14-18

ВВЕДЕНИЕ

Синергисты инсектицидов – это химические вещества, которые при использовании их в сублетальных концентрациях способны значительно повышать токсичность инсектицида для насекомых [1, 2]. Синергисты могут улучшать проникновение, транспортировку или доступность инсектицида, выступать в качестве суррогатных субстратов или ингибиторов ферментов детоксикации и белков-транспортеров, изменяя тем самым ответную реакцию насекомого на пестицид [1, 2]. Синергисты представляют коммерческий интерес, поскольку их сочетание с инсектицидами повышает эффективность последних, что помогает свести использование пестицидов к минимуму и является полезным в преодолении инсектицидной резистентности насекомых [2]. Синергисты, обладающие активностью в отношении специфических ферментных систем детоксикации, используют для изучения механизмов устойчивости к инсектицидам и определения конкретных метаболических путей [3].

Диэтилмалеат (Diethyl maleate, DEM) является синергистом, который обычно используют в качестве ингибитора глутатион-S-трансфераз (GSTs, КФ 2.5.1.18) насекомых для выявления метаболической устойчивости или для повышения эффективности инсектицидов [3–7]. Глутатион-S-трансферазы представляют семейство ферментов II фазы детоксикации, которые катализируют реакцию с восстановленным глутатионом (GSH) и конъюгируют ксенобиотические соединения через сульфгидрильную группу, образуя более растворимое соединение, которое может выводиться из организма [8]. DEM способен конъюгировать GSH, что снижает способность GSTs использовать его для конъюгации с инсектицидами или с продуктами окислительного стресса, который они вызывают [9].

Как правило, синергистические соединения применяют в концентрациях и дозах, которые не приводят или приводят к очень низкой смертности насекомых, но являются достаточно высокими для достижения максимального ингибирования целевых ферментов детоксикации [2]. Диапазон концентраций DEM, используемых при изучении механизмов резистентности, довольно широк и составляет от 0.96 [10] до 25–50 мкг/особь [7, 11] для разных видов насекомых. В опубликованных исследованиях механизмов инсектицидной устойчивости комнатной мухи Musca domestica (вид, который является модельным при тестировании инсектицидов) приведены разные дозы DEM для взрослых особей: 1 мкг/самка [5, 6], 7 мкг/самка [12], 10 мкг/самка [13], 40 мкг/особь [9]. Однако крайне мало работ, демонстрирующих ингибирование GSTs в организме насекомых под воздействием DEM [14]. Цель работы – оценка влияния диэтилмалеата на активность глутатион-S-трансферазы самок и самцов Musca domestica при его топикальном нанесении.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования были самки и самцы 3–5-суточного возраста лабораторной линии Musca domestica L., содержавшейся в стандартных условиях [15]. В предварительных экспериментах методом топикального нанесения устанавливали дозу синергиста, не приводящую к гибели насекомых. На вентральную часть грудного отдела насекомых наносили ацетоновые растворы DEM в объеме 1 мкл. Всего было протестировано 5 доз DEM в диапазоне 0.2–5.0 мкг/особь. В контроле особей обрабатывали 1 мкл ацетона. Затем насекомых помещали в стеклянные стаканчики, снабженные поилками с 5%-ным раствором глюкозы. Учет гибели насекомых проводили через 24 и 48 ч.

Для оценки влияния DEM на активность GST из групп контрольных и обработанных синергистом насекомых отбирали часть особей (по 5–10 самок и самцов для каждой дозы) через 1 ч и 48 ч после обработки (использовали только выживших насекомых) и до исследования хранили при –80°С. Из каждой особи готовили гомогенаты в 0.1 М фосфатном буфере рН 7.6, содержащем 1 мМ DTE, 1 мM EDTA, 1 мM PTU, 1 мM PMSF. Активность GST и содержание белка определяли в супернатантах сразу после центрифугирования (10 000 g, 2 мин). Содержание белка в гомогенатах определяли по методу Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Определение активности GST проводили в 96-луночных микропланшетах (MiniMed, Россия) на микропланшетном фотометре Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific Inc., Финляндия) с использованием синтетического субстрата 1-хлор-2,4-динитробензена при длине волны 340 нм в течение 20 мин в режиме кинетика [15]. Удельную активность фермента рассчитывали с учетом неферментативного преобразования субстрата, фактора разведения гомогената и содержания белка в пробе и выражали как изменение оптической плотности за 1 мин на мг белка (Δ OD/мин/мг белка). Статистический анализ результатов определения активности фермента проводили с использованием ANOVA и критерия Тьюки для множественных сравнений с помощью пакета программ Statistica 13.3 (StatSoft, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Литературные сведения о дозе диэтилмалеата, применяемой в исследованиях на M. domestica разнятся [5, 6, 9, 12, 13], поэтому в предварительных экспериментах оценили смертность имаго при воздействии разными дозами синергиста. Согласно представленным в табл. 1 данным, при обработке взрослых особей M. domestica DEM нулевая гибель среди самцов отмечена при использовании дозы 0.2, среди самок – 0.2 и 0.5 мкг/особь. При обработке насекомых DEM в дозе до 2 мкг/особь включительно отмечали допустимый уровень гибели (до 5%) как среди самок, так и среди самцов. Нанесение DEM в дозе 5 мкг/особь приводило к увеличению смертности до 10% среди самок и до 30% среди самцов.

К сожалению, в научной литературе скудно представлены результаты исследований по влиянию разных доз синергистов на активность ферментов детоксикации у насекомых. В частности, в работе [14] изучали влияние DEM в концентрациях, не вызывающих гибель насекомых, на активность GST у 6-ти видов насекомых и обнаружили, что степень ингибирования фермента варьировалась от 18 до 48% в зависимости от вида. Согласно этим исследованиям, увеличение дозы DEM сопровождалось незначительным повышением или снижением степени ингибирования GST у отдельных видов насекомых [14]. Полученные нами результаты определения активности GST у самок и самцов M. domestica через 1 ч и 48 ч после топикального нанесения разных доз DEM представлены на рис. 1. Статистический анализ полученных данных не выявил значимого варьирования активности фермента между группами самок, обработанных разными дозами синергиста, через 1 ч после обработки. Напротив, варьирование активности GST между группами самцов в такой же период времени после нанесения тех же доз DEM было статистически значимым (p < < 0.001). Статистически значимого варьирования ферментативной активности как между группами самок, так и между группами самцов через 48 ч после обработки DEM не обнаружено (p = 0.260 и p = 0.0998 соответственно). Выявлено снижение активности GST у самцов в 1.70 (p = 0.0016) и 1.40 (p = 0.271) раза через 1 ч и 48 ч соответственно после воздействия DEM в дозе 5 мкг/особь по сравнению с активностью у контрольных особей. Отмеченное угнетение активности GST у самцов через 1 ч после обработки дозой 5 мкг/особь и частичное восстановление активности фермента через 48 ч, вероятно, были связаны с изменением уровня восстановленного глутатиона. Действительно, в опытах на самцах M. domestica обнаружили, что нанесение DEM в дозе 40 мкг/особь приводило к снижению содержания глутатиона [9]. Максимальное снижение (до 50% от начального уровня) авторы отмечали через 2 ч, а значительное, но не полное восстановление через 8 ч после обработки [9].

Рис. 1.

Активность глутатион-S-трансферазы у самок (а) и самцов (б) Musca domestica лабораторной культуры через 1 ч и 48 ч после топикального нанесения диэтилмалеата (DEM) в разных дозах. * Статистически значимо относительно контрольных особей, p < 0.01, ** статистически значимо относительно самок аналогичной группы, p < 0.05.

Наблюдали статистически значимые (p < 0.05) отличия в активности GST между самками и самцами в контроле и в группе особей, обработанных DEM в дозе 5 мкг/особь (через 1 ч после обработки): у самцов ферментативная активность была соответственно в 1.29 и в 1.98 раза ниже, чем у самок. Выявленные отличия в активности GST по полу в контрольной группе согласовались с литературными сведениями, согласно которым на протяжении имагинальной стадии M. domestica активность GST у самок почти в 2 раза выше, чем у самцов [8].

Проведенные ранее исследования показали, что DEM способен увеличивать токсичность инсектицидов для особей резистентных линий насекомых [7, 11], однако это не всегда бывает так [4, 10]. Что касается M. domestica, синергизм DEM по отношению к имидаклоприду наблюдали при использовании дозы 1 мкг/особь в опытах с самками 4-суточного возраста имидаклоприд-резистентной линии [5, 6]. В то время как в исследовании [13] применение DEM не оказало влияния на токсичность спиносада для M. domestica резистентной линии при нанесении синергиста на самок 4–6-суточного возраста в дозе 10 мкг/особь. Общепринято, что DEM выступает как ингибитор GSTs, и наблюдаемый синергистический эффект свидетельствует о возможном вкладе GSTs в формирование инсектицидной устойчивости [5–7, 11]. Отсутствие синергизма объясняют тем, что формирование резистентности происходит по механизму нечувствительности мишени к инсектициду вследствие мутаций (например, kdr-мутации в случае пиретроидов) либо тем, что GSTs не принимают участия в метаболизме данного инcектицида [4, 10, 13]. Следует отметить, что в упомянутых выше работах не приведены сведения об активности GST или других ферментов детоксикации у насекомых после обработки DEM. Согласно нашему исследованию, топикальное нанесение DEM в дозе 1 и 2 мкг/особь не сопровождалось статистически значимым изменением активности GST у имаго M. domestica лабораторной линии. Полученные результаты демонстрируют также, что использование DEM в качестве ингибитора GST в дозе 5 мкг/особь, вызывавшей 10–30%-ную гибель M. domestica обоего пола, может не приводить к угнетению активности целевого фермента у самок в отличие от самцов. Учитывая полученные результаты и литературные данные, считаем, что для уточнения механизма синергистического действия DEM в отношении инсектицидов необходимы дополнительные исследования по оценке его влияния на активность GST и других ферментов детоксикации у насекомых.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синергисты являются важным инструментом для исследований инсектицидной устойчивости насекомых и находят широкое применение при разработке инсектицидных препаратов. Доза синергиста диэтилмалеата, при топикальном нанесении вызывавшая не более 5% гибели имаго Musca domestica, составила 2 мкг/особь. Однако при воздействии данной дозы DEM не обнаружено статистически значимого изменения активности GST ни у самок, ни у самцов по сравнению с контрольными особями. Применение более высокой дозы DEM (5 мкг/особь) приводило к увеличению смертности насекомых и только у самцов сопровождалось угнетением активности GST через 1 ч после обработки синергистом. У выживших особей (как самок, так и самцов) не отмечено статистически значимого снижения активности GST через 48 ч после нанесения DEM (5 мкг/особь). Обнаруженные особенности изменения активности одного из ферментов детоксикации у самок и самцов M. domestica в ответ на воздействие синергистом DEM необходимо учитывать при проведении исследований на данном виде насекомых.