Журнал аналитической химии, 2019, T. 74, № 9-app, стр. 5-12

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и оборудование. Применяли следующие реагенты: в качестве функционального мономера – метакриловую кислоту, МАК (Sigma-Aldrich, Великобритания); кросс-мономера – этиленгликольдиметакрилат, (Вектон, Россия); инициатора полимеризации – азобисизобутиронитрил, АИБН (Лабтех, Россия); темплата – сальбутамол (Sigma-Aldrich, Великобритания). Для исследования перекрестного реагирования сенсора использовали рактопамина гидрохлорид (Sigma-Aldrich, Великобритания), кленбутерола гидрохлорид (Abcam, Великобритания), пенициллин G (Биохимик, Россия). Растворители: ацетонитрил (Вектон, Россия), конц. CH₃COOH (База № 1 химреактивов, Россия), тетрагидрофуран (Sigma-Aldrich, Великобритания), этиловый спирт х. ч. (ОАО “Метафракс”, Россия).

При синтезе импринтированного полимера применяли 0.1 М раствор сальбутамола, полученный растворением 23.9 мг сальбутамола в 1 мл смеси ацетонитрил–уксусная кислота–тетрагидрофуран (8.1 : 1.75 : 0.15, по объему). Для повторного встраивания в пленки ПМО применяли водный раствор сальбутамола с концентрацией 526 мкг/мл (раствор 1). Для построения градуировочной зависимости использовали растворы с концентрациями сальбутамола 350.7, 263, 131.5, 52.6, 26.3 мкг/мл, полученные разбавлением более концентрированного раствора бидистиллированной водой.

В качестве сенсоров применяли пьезокварцевые резонаторы с собственной частотой колебаний АТ-среза 10 МГц, 8 мм в диаметре с золотыми электродами диаметром 5 мм на двух сторонах (ЭТНА, Россия).

Для изучения закономерностей процесса полимеризации и свойств импринтированного полимера использовали данные, полученные методами пьезокварцевого микровзвешивания и инфракрасной спектроскопии (ИК-спектрометр Shimadzu Iraffinity-1, Япония).

Синтез полимера с молекулярными отпечатками методом фотополимеризации. К раствору сальбутамола (0, 0.5, 10, 15, 20 мкл) добавляли функциональный мономер (0.35, 0.43, 0.51, 0.60, 0.69 мкл), полученную смесь обрабатывали ультразвуком в течение 1 мин. Спустя 30 мин вводили кросс-мономер (3.85, 5.77, 7.70 мг), обрабатывали ультразвуком (ультразвуковая ванна ПСБ – 2835-03 (ПСБ – Галс, Россия) в течение 1 мин, после чего вносили 0.035 г инициатора полимеризации АИБН. Предполимеризационную смесь обрабатывали ультразвуком в течение 3 мин и 10 мкл полученной смеси дозировали на поверхность очищенного сенсора, помещали кристалл под УФ-лампу (газоразрядная дуговая ртутная лампа высокого давления мощностью 250 Ватт) на один час.

Для удаления молекул темплата с поверхности пленки ПМО сенсор погружали в 75 мл регенерирующего раствора (экстрагента) и выдерживали в течение фиксированного времени при постоянном перемешивании. Затем сенсор высушивали в потоке теплого воздуха до постоянной массы. В качестве регенерирующего раствора применяли водный раствор уксусной кислоты и этилового спирта.

Неимпринтированные полимерные пленки (НИП) синтезировали по аналогичной методике без введения сальбутамола в состав предполимеризационной смеси.

Характеристика пленок полимера с молекулярными отпечатками методом пьезокварцевого микровзвешивания. В качестве аналитического сигнала использовали изменение частоты колебаний сенсора при изменении массы распознающего слоя, который регистрировали после высушивания сенсора в потоке воздуха до и после формирования пленки ПМО, удаления и повторного встраивания молекул сальбутамола. Аналитический сигнал измеряли при комнатной температуре (25 ± 5°C) на воздухе после высушивания сенсора до постоянной массы на установке [23] на основе генератора колебаний Б5-30 и цифрового модуля Discope (Бафика, Россия), а также персонального компьютера.

Качество распознающего слоя ПМО контролировали методом пьезокварцевого микровзвешивания. Массу полимерного покрытия сенсора m рассчитывали по уравнению Зауэрбрея: ΔF = –2.3 × 10⁶$F_{0}^{2}$m/S, где S – площадь электрода пьезокварцевого сенсора (0.10066 см²); F₀ – базовая частота резонатора, Гц; ∆F = F₁– F₂, Гц, где F₁, F₂ – частоты колебаний сенсора до и после синтеза пленок ПМО.

Аналитический сигнал ПМО-сенсора измеряли относительно сенсора с НИП, что позволило исключить вклад неспецифической сорбции на поверхности сенсора: ∆F_ан = ∆F_ПМО – ∆F_НИП (Гц), где ∆F_ПМО и ∆F_НИП рассчитывали как разность частот колебаний сенсора до и после контакта ПМО или НИП с раствором аналита. Массу извлеченного (Δm_ПМО) и повторно встроенного сальбутамола рассчитывали по разности между массой пленки полимера до и после экстракции темплата.

Концентрацию поверхностных отпечатков темплата на поверхности ПМО (R_max) и отпечатков после регенерации поверхности (R') рассчитывали как: R = m_ВС/(SМ_Slb), мкмоль/см², где m_ВС – масса удаленных молекул темплата, мкг; М_Slb – молекулярная масса сальбутамола (239.31 г/моль).

Кроме того, рассчитали концентрационную чувствительность сенсора, показывающую изменение частоты колебаний ПМО-сенсора при контакте с раствором сальбутамола с концентрацией 1 мкг/мл: S_c = ΔF '/с_Slb (Гц мл/мкг), где ΔF ' – разница частот до и после встраивания молекул сальбутамола, Гц; с_Slb –концентрация сальбутамола, мкг/мл.

Селективность пленок ПМО оценивали по коэффициентам перекрестного взаимодействия: CR, % = ΔF_меш/ΔF_Slb, где ΔF_Slb, ΔF_меш – аналитические сигналы ПМО-сенсора в растворе аналита и мешающего вещества соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для создания пленочного покрытия пьезоэлектрического сенсора на основе ПМО необходимо учитывать в первую очередь состав полимеризационной смеси и строение молекулы темплата. Множественность, сила и характер нековалентных взаимодействий между темплатом и функциональным мономером и стабильность предполимеризационного комплекса определяют аффинность ПМО [24, 25] и селективность последующего распознавания молекул темплата [26].

В качестве теплата при синтезе пленок ПМО непосредственно на поверхности электрода сенсора использовали сальбутамол, активный ингредиент лекарств для лечения астмы. Так как он способен не только увеличивать общую энергию при кардионагрузках, но и изменять механизм получения этой энергии за счет сжигания жира, сальбутамол отнесен к запрещенным в спорте препаратам. Всемирное антидопинговое агентство установило верхний порог его присутствия в организме атлета на уровне 1000 нг/мл.

Поскольку молярное соотношение между шаблоном, функциональным и кросс-мономерами при синтезе существенно влияет на количество поверхностных отпечатков и массу сальбутамола, сорбируемого ПМО, исследовали влияние на свойства импринтированного полимера состава полимеризационной смеси.

Влияние концентрации сальбутамола на свойства полимера с молекулярными отпечатками. Количество темплата в предполимеризационной смеси существенно влияет как на структуру и устойчивость покрытия, так и на количество отпечатков и, следовательно, на аналитический сигнал сенсора. Рассматривали составы полимеризационной смеси, отличающиеся мольным соотношение темплата, функционального и кросс-мономеров n_t : n_f : n_k (табл. 1), для установления оптимального содержания каждого компонента. Так, увеличение мольной доли сальбутамола в полимеризационной смеси от 0.5 до 1.5 при постоянном мольном соотношении функционального и кросс-мономеров 4 : 20 приводит к росту количества поверхностных молекулярных отпечатков. Дальнейшее увеличение концентрации темплата негативно сказывается на свойствах пленки ПМО – полимер № 4 медленно разрушается под действием анализируемого раствора, что указывает на избыточное количество молекул темплата по отношению к функциональному мономеру, связывающему темплат в предполимеризационный комплекс. Это в итоге приводит к появлению в объеме полимера множества включений, не связанных с матрицей. Из-за этого при воздействии анализируемого и регенерующего растворов происходит деструкция распознающего покрытия. Следует также отметить, что избыточное количество темплата уменьшает скорость полимеризации за счет воздействия на стадию роста цепи, т.е. на взаимодействие свободных радикалов с мономерами.

При повышении концентрации темплата в полимерах № 1–3 одновременно с увеличением числа поверхностных отпечатков снижается устойчивость слоя ПМО. Так, полимер № 1 при повторном связывании “теряет” 5.3% “сайтов” связывания, № 2 – 10.4%, № 3 – 90.4%. В связи с этим оптимальное соотношение сальбутамол–мономеры не должно превышать 1 : 24, поскольку с помощью сенсора на основе полимера № 3 можно проводить только однократные измерения.

Влияние концентрации функционального мономера на свойства полимера с молекулярными отпечатками. Выбор в качестве функционального мономера метакриловой кислоты объясняется ее способностью к образованию водородных или координационных связей с молекулами темплата родственной структуры [27, 28], что главным образом определяет сорбционные свойства импринтированного покрытия. При создании импринтированного покрытия важным аспектом является оптимизация количества функционального мономера в полимеризационной смеси.

Концентрация и мольное соотношение кросс-мономера и темплата в полимерных смесях № 1, 5–8 оставалось постоянным, в то время как концентрацию функционального мономера в ходе эксперимента увеличивали в 2 раза (табл. 1). Небольшое количество функционального мономера способствуют образованию слабо взаимодействующих с темплатом “сайтов’ связывания, а увеличение концентрации сопровождается ростом отклика сенсора (полимеры № 5, 6). В то же время избыточное количество функционального мономера приводит к упрочнению его связей с темплатом, вследствие чего снижается эффективность удаления молекул последнего из полимерного слоя и лишь небольшая часть “сайтов” распознавания становится доступной для повторного связывания (полимеры № 7, 8).

Ухудшение характеристик импринтированных сальбутамолом покрытий сенсора при увеличении концентрации функционального мономера также, на наш взгляд, связано с гомополимеризацией метакриловой кислоты (часть метакриловой кислоты сополимеризуется, что приводит к уменьшению количества водородных связей и энергии взаимодействия полимер–темплат) и инклюзией “сайтов” связывания в объем полимерной матрицы, что существенно снижает их доступность.

Влияние концентрации кросс-мономера. Свойства импринтированного слоя существенно зависят от природы и количества кросс-мономера в полимеризационной смеси. За счет образования высоко сшитого полимерного каркаса из кросс-мономера достигается механическая и химическая устойчивость покрытия. Кроме того, полимерная матрица способствует формированию устойчивой трехмерной структуры “сайтов” импринтинга, за счет которых и осуществляется молекулярное распознавание. В связи с этим кросс-реагент сильно влияет на селективность и связывающую способность ПМО. В качестве кросс-мономера выбрали этиленгликольдиметакрилат, наиболее часто применяемый при синтезе ПМО на основе МАК.

Исследовали полимерные смеси № 6, 9, 10 (содержание в них темплата и функционального мономера постоянно, а содержание кросс-мономера увеличивалось) с целью выявления более стойкого покрытия с максимальной концентрацией поверхностных отпечатков. Увеличение концентрации кросс-мономера (табл. 1) приводит к уменьшению массы сорбируемого сальбутамола от 1.7048 до 0.3381 мкг, что может быть связано либо с “разбавлением” количества поверхностных отпечатков кросс-мономером, либо с их инклюзией в объем полиэтиленгликольдиметакрилата. Увеличение концентрации кросс-мономера не приводит к увеличению устойчивости покрытия, которая практическио постоянна для полимеров № 9 и 10. Таким образом, оптимальный состав соответствует полимерному покрытию с мольным соотношением n_{темплат} : n_{функц. мономер} :  n_{кросс-мономер} = = 1 : 6 : 20, характеризующемуся максимальной устойчивостью и относительно высокой концентрацией первичных поверхностных отпечатков 0.0446 мкмоль/см².

Изучение структуры полимера с молекулярными отпечатками сальбутамола методом ИК-спектроскопии. Для выявления связей, образующихся между ПМО и темплатом и установления функциональных групп, отвечающих за данное взаимодействие, сравнили ИК-спектры полимера с молекулярными отпечатками сальбутамола и неимпринтированного полимера. Смещение пика карбонильных групп в коротковолновую область на спектре ПМО (рис. 1) с 1720 до 1724 см^–1, а также уширение пиков гидроксильных групп (941 см^–1) свидетельствуют об их участии в образовании водородных связей с молекулой сальбутамола при формировании предполимеризационного комплекса (рис. 2).

Рис. 1.

ИК-спектры импринтированного (МИП) и неимпринтированного полимеров (НИП).

Рис. 2.

Схема формирования молекулярного отпечатка сальбутамола.

Следует отметить, что присутствие полосы спиртовой группы –С–ОН (1003–1045 см^–1) у ПМО сальбутамола и ее отсутствие в спектре НИП подтверждает наличие сальбутамола в полимерной матрице, а уширение линии на спектре ПМО говорит о ее участии в образовании водородных связей с функциональным мономером (рис. 2). Кроме того, только в ИК-спектре ПМО имеются линии –NH– (1547 см^–1) и 1,2,4-замещенной ароматической группы (1408–1377 см^–1), которые характерны для сальбутамола.

При полимеризации в присутствии кросс-мономера карбоксильные группы функционального мономера фиксируются полимерной матрицей в определенную трехмерную структуру. Таким образом, после экстракции темплата образуются “сайты” распознавания – полости, комплементарные молекулам темплата, которые впоследствии и отвечают за сорбцию аналита из раствора.

Характеристика пьезоэлектрического сенсора на основе пленок полимера с молекулярными отпечатками сальбутамола. Для создания условий многократного применения пьезоэлектрического сенсора на основе ПМО для определения сальбутамола необходимо выбрать состав регененирующего раствора, который должен хорошо растворять темплат и не оказывать деструктурирующего влияния на полимерную матрицу, обеспечивать удаление темплата с поверхности ПМО с высокой скоростью, не изменяя конфигурацию молекулярных отпечатков. Исследовали три раствора уксусной кислоты и этанола в воде при следующих объемных соотношениях уксусная кислота–этанол–вода: 6 : 36 : 10 (1), 1 : 6 : 10 (2), 1 : 6 : 100 (3). При использовании раствора (1) масса полимерного покрытия уменьшалась вплоть до его полного растворения; в случае раствора (2) сальбутамол удалялся только в первые 2 мин, а далее пленка начинала набухать и связывать воду, что приводило к деформации структуры молекулярных отпечатков. И только при применении раствора (3) отмечены удовлетворительные результаты как при удалении, так и при повторном встраивании молекул сальбутамола: на протяжении 4 мин происходит полное удаление темплата и за 3 мин максимальное встраивание в структуру ПМО молекул сальбутамола.

Характеристики пьезоэлектрического сенсора на основе пленок ПМО, приведенные в табл. 2, свидетельствуют о возможности его применения для определения сальбутамола в жидких средах: градуировочная функция для определения сальбутамола линейна в достаточно широком интервале концентраций 26–526 мкг/мл, предел обнаружения составляет 9.6 мкг/мл.

Сопоставление значений массы первоначально встроенного в структуру ПМО сальбутамола ($\Delta {{m}_{{{\text{В }}{{{\text{С }}}_{{{\text{max}}}}}}}}$) и повторно встроенной массы аналита ($\Delta {{m}_{{{\text{В }}{{{\text{С }}}_{2}}}}}$) показало незначительные отличия этих величин, что свидетельствует о стабильности и одинаковой доступности поверхностных отпечатков на пленке ПМО после регенерации сайтов молекулярного распознавания. Кроме того, сохраняются близкие значения поверхностной концентрации молекулярных отпечатков R_max и R'. Устойчивость распознающего слоя сохраняется в пяти и более циклах измерений, аналитический сигнал не изменяется более чем на 5%. Толщина пленки ПМО составляла 180 ± 20 нм.

Концентрационная чувствительность (S_c = = 3.8, Гц мл/мкг) соответствует величине сигнала сенсора, приходящейся на единицу концентрации, и значению коэффициента чувствительности градуировочной функции.

Величина импринтинг фактора, рассчитанная как отношение аналитического сигнала сенсора на основе импринтированного и неимпринтированного полимеров ΔF_ПМО : ΔF_НИП и позволяющая оценить вклад в аналитический сигнал сенсора специфических и неспецифических взаимодействий, составляет 11 ± 3, что превышает аналогичную величину для полимеров, полученных другими способами [29].

Селективность сенсора с полимером с молекулярными отпечатками оценивали с помощью коэффициента кросс-реактивности СR, % Установлено, что значения СR, % существенно зависят от структуры родственных соединений (табл. 3). В формулах веществ в табл. 3 выделены фрагменты молекул, за счет которых осуществляется сорбция пленками ПМО.

Таблица 3.  

Оценка селективности определения сальбутамола с помощью ПМО-сенсоров с полимером с молекулярными отпечатками (концентрация соединений 52.6 мкг/мл)

Аналит	Структурная формула	СR, %
Сальбутамол (Slb)		100
Рактопамин (Rac)		10.9
Кленбутерол (Сlb)		14.4
Пенициллин G (Pen G)		2.31
Цефотаксим		3.04

Отмечена более высокая кросс-реактивность ПМО сальбутамола к бета-агонистам кленбутеролу и рактопамину, поэтому синтезированное покрытие ПМО можно использовать для селективного обнаружения сальбутамола в пробе только в присутствии одинаковых или более низких концентраций этих соединений. Селективность сенсора по отношению к лекарственным препаратам других классов (пенициллин, цефотаксин) достаточно высока, что позволяет определять сальбутамол в присутствии более высоких концентраций этих соединений.

* * *

Таким образом, можно заключить, что пьезоэлектрические сенсоры на основе ПМО, синтезированные методом фотополимеризации, позволяют с высокими чувствительностью и селективностью определять сальбутамол в жидких средах.

Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ (грант 13-03-97505-р_центр_а) “Селективность и эффективность молекулярного распознавания и определения гормонов и бэта-агонистов с помощью пьезокварцевого иммуно- и биомиметического сенсора”.