1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Журнал аналитической химии
  4. T. 76, № 11, 2021

Журнал аналитической химии, 2021, T. 76, № 11, стр. 1004-1011

Определение кетостероидов в моче человека с применением дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции и ультра высокоэффективной жидкостной хроматографии–масс-спектрометрии высокого разрешения

Е. В. Дмитриева a, *, А. З. Темердашев a, А. К. Осипова a

a Кубанский государственный университет
350040 Краснодар, ул. Ставропольская, 149, Россия

* E-mail: catherine_dmitrieva@outlook.com

Поступила в редакцию 27.04.2021
После доработки 07.05.2021
Принята к публикации 13.05.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Предложен способ определения некоторых кетостероидов в моче человека, включающий ферментативный гидролиз с применением β-глюкуронидазы E. coli с последующими дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэсктракцией, дериватизацией аналитов гидроксиламином и детектированием методом обращенно-фазовой ультра ВЭЖХ–квадруполь-времяпролетной масс-спектрометрии. Оптимизация условий экстракции и получения производных исследуемых соединений позволила установить, что наивысшие степени извлечения достигаются при использовании смеси ацетон–хлороформ в качестве диспергента и экстрагента, а полнота протекания реакции дериватизации – при термостатировании пробы при 70°C в течение 90 мин. Предложенный способ характеризуется высокой чувствительностью (пределы обнаружения в диапазоне 0.1–0.25 нг/мл) и широким линейным диапазоном.

Ключевые слова: стероидные гормоны, ДЖЖМЭ, моча, дериватизация, гидроксиламин, ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием.

Стероидные гормоны являются регуляторами различных физиологических и биохимических процессов в организме человека. Все стероидные гормоны образуются из общего предшественника холестерола при протекании реакций гидроксилирования, окисления и восстановления. Среди стероидных гормонов выделяют следующие классы: эстрогены, андрогены, прогестины, минералокортикоиды, глюкокортикоиды, витамин D и его метаболиты [1, 2]. Определение данных соединений в биологических жидкостях человека требуется, прежде всего, в целях клинической диагностики ввиду их участия в патогенезе многих заболеваний и генетических нарушений [2, 3].

Обычно стероидные гормоны определяют в моче (усредненные концентрации за несколько часов–сутки), крови и слюне (определение в реальном времени) [4]. Результаты определения стероидов в реальном времени могут колебаться из-за эпизодического характера секреции гормонов [5, 6], а также циркадных ритмов [7], в то время как состав мочи не подвержен подобным колебаниям. Другими преимуществами мочи в качестве объекта анализа являются неинвазивность процедуры и простота получения больших объемов образца [8].

Стероидные гормоны проявляют биологическую активность на очень низких уровнях концентраций (нано- и пикомолярных) [3, 9, 10], поэтому для их определения требуется применение высокочувствительных методов.

Применяют различные способы подготовки проб мочи к анализу: жидкостно-жидкостную экстракцию [11–13], сорбционную микроэкстракцию на покрытии мешалки [14], проточную твердофазную микроэкстракцию [15], автоматизированную твердофазную экстракцию [16], дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию (ДЖЖМЭ) [8] и др. [17]. Среди перечисленных способов наиболее многообещающим является ДЖЖМЭ ввиду простоты, высоких факторов концентрирования и соответствия критериям “зеленой химии” [18]. В случае необходимости повышения чувствительности определения стероидных гормонов возможно использование дериватизации для увеличения эффективности ионизации. Так, в обзорах [9, 19, 20] рассмотрено применение различных дериватизирующих агентов для малых молекул, в частности для стероидных гормонов. Некоторые из используемых реагентов коммерчески недоступны, в то время как другие, например дансил хлорид, приводят к уменьшению селективности хроматографического разделения и неспецифичной фрагментации дериватов [21]. Это обусловливает дополнительные требования к реагенту в случае применения дериватизации при подготовке проб.

Цель данного исследования – разработка простого, экспрессного и высокочувствительного способа определения стероидных гормонов различных классов, соответствующего критериям “зеленой химии”.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и реагенты. Использовали стандартные образцы тестостерона, дигидротестостерона, кортизона, гидрокортизона (кортизола), эстрона, прогестерона, 11α-гидроксипрогестерона и метилтестостерона (внутренний стандарт) (Sigma-Aldrich, Германия); β-глюкуронидазу Escherichia coli (E. coli) (Roche Diagnostics, Германия); 50%-ный водный раствор гидроксиламина (Sigma-Aldrich, Германия). Ацетонитрил (Biosolve, Израиль) и метанол (J.T. Baker, Великобритания) для ВЭЖХ, муравьиную кислоту (98%) (Acros Organics), воду (18.2 МΩ см, Milli-Q) использовали для приготовления растворов и в качестве компонентов подвижной фазы. Ацетон, этанол, дихлорметан, трихлорметан и тетрахлорметан (99.9%), соляную кислоту (99%), муравьиную кислоту (98%), хлорид натрия, дигидрофосфат калия, сульфат натрия, мочевую кислоту, мочевину, креатинин, цитрат натрия, хлорид калия, хлорид кальция, хлорид аммония, оксалат калия, сульфат магния, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат натрия, азид натрия, тетраборат натрия (бура) (99%) приобретали у фирмы “Вектон” (Россия).

Приготовление стандартных растворов. Стандартные растворы стероидных гормонов с концентрацией 1 мг/мл готовили в метаноле, градуировочные растворы и растворы контроля качества получали разбавлением стандартных растворов в метаноле. Фосфатный буферный раствор (50 мл, pH 6.5) готовили из дигидрофосфата калия, гидрофосфата натрия и азида натрия. Синтетическую мочу для оптимизации условий пробоподготовки готовили в соответствии с протоколом [22]. Все растворы хранили при 4°C.

Приборы и оборудование. Для определения аналитов использовали систему, состоящую из ультра высокоэффективного жидкостного хроматографа Bruker Elute и квадруполь-времяпролетного масс-спектрометра Bruker MaXis Impact с источником электрораспылительной ионизации (табл. 1) под управлением программного обеспечения Bruker Compass HyStar 4.1. Для разделения аналитов применяли колонку Phenomenex Kinetex C18 (100 × 2.1 мм, 1.7 мкм) с соответствующей предколонкой. В качестве подвижной фазы использовали смесь 0.1%-ного раствора муравьиной кислоты в воде (элюент А) и 0.1%-ного раствора муравьиной кислоты в метаноле (элюент Б) в режиме градиентного элюирования (1.00 мин – 95% А, 2.70 мин – 40% А, 4.00 мин – 40% А, 5.00 мин – 10% А, 7.50 мин – 10% А, 7.51 мин – 95% А, 9.00 мин – 95% А) при скорости потока подвижной фазы 0.4 мл/мин и температуре термостата 40°C. Образцы находились в автосамплере при 5°C, для анализа использовали 10 мкл образца.

Таблица 1.  

Условия масс-спектрометрического детектирования

Параметр Значение
Температура в источнике ионизации, °C 250
Напряжение на капилляре, В 4000
Напряжение на экстрагирующей линзе, В 500
Давление газа-распылителя, мПа 0.1
Расход газа-осушителя, л/мин 5
Скорость сканирования, Гц 3
Диапазон сканирования масс, Да 150–1000
Давление газа-мишени, мТорр 1.5

Исследуемые образцы. Образы мочи получали от здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 45 лет, консервировали азидом натрия и хранили при –20°C.

Выбор дериватизирующего агента. В качестве дериватизирующего агента выбрали гидроксиламин, поскольку он обеспечивает высокую чувствительность определения, а реакция получения производных является простой и не требует специальных условий. Кроме того, возможен ввод реакционной смеси в хроматограф без дополнительных стадий очистки после получения производных. Гидроксиламин использовали ранее для определения стероидных гормонов в биологических жидкостях человека с высокой чувствительностью [3, 23, 24]. На схеме 1 приведена реакция получения производных при использовании гидроксиламина в качестве дериватизирующего агента.

Схема 1 . Образование оксимов стероидных гормонов при дериватизации гидроксиламином.

Основной недостаток использования гидроксиламина – возможное расщепление пиков на хроматограммах из-за образования нескольких стереоизомеров. Однако в том случае, когда за счет оптимизации условий градиентного элюирования не удаeтся добиться образования одного пика без ухудшения селективности, возможно интегрирование расщепленного пика без ухудшения аналитических характеристик методики.

Оптимизация условий дериватизации. Для достижения полноты протекания реакции оптимизировали такие параметры, как концентрация гидроксиламина, температура и время термостатирования. Время реакции варьировали в диапазоне от 30 до 120 мин, температуру – от комнатной до 70°C, а концентрацию гидроксиламина между 0.4 и 3.2 М. Полноту протекания реакции оценивали по наличию пиков производных и отсутствию пиков исходных соединений на хроматограммах (табл. 2).

Таблица 2.

Условия масс-спектрометрического детектирования аналитов

Аналит Брутто-формула Моноизотопная масса, Да [M+H]+, Да Погрешность определения массы, ppm Время удерживания, мин
Тестостерон C19H28O2 288.2089 289.2162 0.7 5.2
Производное тестостерона C19H29NO2 303.2198 304.2271 2.6 5.4
Дигидротестостерон C19H30O2 290.2246 291.2319 0.7 5.5
Производное дигидротестостерона C19H31NO2 305.2355 306.2428 2.6 5.6
Кортизон C21H28O5 360.1937 361.2010 0.3 3.8
Производное кортизона C21H30N2O5 390.2155 391.2227 2.0 3.8
Гидрокортизон C21H30O5 362.2093 363.2166 -0.3 3.9
Производное гидрокортизона C21H32N2O5 392.2311 393.2384 1.8 3.9
Прогестерон C21H30O2 314.2246 315.2319 1.6 5.7
Производное прогестерона C21H32N2O2 344.2464 345.2537 2.0 5.8
11α-Гидроксипрогестерон C21H30O3 330.2195 331.2268 0.3 4.5
Производное 11α- гидроксипрогестерона C21H32N2O3 360.2413 361.2486 1.9 4.9
Эстрон C18H22O2 270.1620 271.1693 3.7 4.9
Производное эстрона C18H23NO2 285.1729 286.1802 1.7 5.0
Метилтестостерон* C20H30O2 302.2246 303.2319 1.6 5.4
Производное метилтестостерона* C20H31NO2 317.2355 318.2428 2.5 5.5

*  Внутренний стандарт.

Оптимизация условий дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции. Для нахождения оптимального сочетания экстрагента и диспергента проводили следующий эксперимент: к 1 мл синтетической мочи, содержащей исследуемые соединения и внутренний стандарт с концентрациями по 100 нг/мл, добавляли 300 мкл фосфатного буферного раствора (pH 6.5). Затем при помощи шприца в образец вводили смесь экстрагента (100 мкл) и диспергента (500 мкл), после чего перемешивали смесь на вортексе в течение 15 с и центрифугировали 10 мин при 10 000 об/мин. Нижнюю фазу упаривали досуха в токе азота и добавляли раствор гидроксиламина (метанол–вода (1 : 1)) для получения производных с последующим термостатированием и анализом образца.

В качестве диспергентов рассматривали ацетон, метанол, этанол и ацетонитрил, которые хорошо растворяются как в образце, так и в экстрагенте и способствуют образованию большой поверхности контакта фаз. Ди-, три- и тетрахлорметан использовали в качестве диспергентов, поскольку они плохо растворяются в водном образце, а также имеют более высокую плотность, тем самым удовлетворяя критериям, предъявляемым к данным растворителям.

Для достижения наивысших степеней извлечения использовали многофакторный подход – план Бокса-Бенкена [25–28], который используется для оценки влияния различных факторов (независимых переменных) на аналитический сигнал (например, площадь пика – зависимая переменная), а также позволяет оценить взаимодействие между факторами.

Рассматривали четыре фактора: объем экстрагента (50, 100 и 150 мкл), объем диспергента (450, 500 и 550 мкл), количество хлорида натрия для оценки высаливающего эффекта (0, 50 и 100 мг) и количество тетрабората натрия (0, 5 и 10 мг) для изучения влияния pH на степени извлечения. Для обработки полученных результатов использовали ПО STATISTICA 10 (Statsoft).

Эксперимент проводили следующим образом: к 1 мл синтетической мочи, содержащей исследуемые соединения и внутренний стандарт (100 нг/мл), хлорид натрия (0, 50 и 100 мг) и тетраборат натрия (0, 5 и 10 мг) добавляли 0.3 мл фосфатного буферного раствора, затем шприцем вводили смесь экстрагента и диспергента. Смесь перемешивали на вортексе в течение 15 с (без перемешивания степени извлечения целевых соединений неудовлетворительные) и центрифугировали 10 мин при 10 000 об/мин. Нижнюю фазу упаривали досуха в токе азота и добавляли раствор гидроксиламина (метанол–вода (1 : 1)) для получения производных с последующим термостатированием и анализом образца.

Стоит отметить, что при анализе реальных образцов перед процедурой микроэкстракции проводили деконъюгацию глюкуронидов в условиях, оптимизированных нами ранее [8]: 30 мин при 50°C в присутствии фосфатного буферного раствора (pH 6.5) и фермента β-глюкуронидазы E. coli.

После выбора оптимальных условий пробоподготовки оценивали аналитические характеристики методики.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оптимизация условий дериватизации. Установили, что использование концентрации гидроксиламина не менее 1.6 М обеспечивает полноту протекания реакции при температуре термостатирования 70°C и времени реакции не менее 90 мин, поэтому данные условия выбрали для дальнейших экспериментов. При более низкой концентрации дериватизирующего агента и меньших времени и температуре на хроматограммах наблюдали исходные соединения или моно- и дизамещеные дериваты, например, для кортизона, кортизола, прогестерона и 11α-гидроксипрогестерона.

Оптимизация условий дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции. При оптимизациии типов экстрагента и диспергента установили, что две комбинации растворителей, а именно: ацетон–трихлорметан и ацетонитрил–трихлорметан, обеспечивают достаточные степени извлечения. При использовании ацетонитрила степени извлечения исследуемых глюкокортикоидов (кортизона и кортизола) несколько выше, в то время как ацетон приводит к увеличению степени извлечения остальных соединений, поэтому его выбрали для дальнейших экспериментов в качестве диспергента, а трихлорметан – в качестве экстрагента.

Использование плана Бокса-Бенкена позволило установить уровни факторов, обеспечивающие количественное извлечение всех аналитов. Все полученные модели были статистических значимыми ($R_{{{\text{adj}}}}^{{\text{2}}}$ > 0.9), что указывает на высокую адекватность полученных результатов. Ввиду оптимизации условий для соединений с различными физико-химическими свойствами, в некоторых случаях выбирали компромиссные значения. В результате установили, что добавление хлорида и тетрабората натрия мало влияет на степени извлечения, в то время как объем экстрагента оказывает большое влияние – с увеличением объема степени извлечения возрастают, поэтому выбрали величину 150 мкл. Влияние объема диспергента на степени извлечения меньше, величина 500 мкл обеспечивает наиболее высокие степени извлечения. В этих условиях степени извлечения аналитов составили 79–98%, при этом степени извлечения глюкокортикоидов оказались самыми низкими по сравнению с остальными соединениями.

Таким образом, выбрали следующие оптимальные условия пробоподготовки: в микроцентрифужную пробирку емк. 2 мл добавляют 1 мл образца, содержащего внутренний стандарт метилтестостерон (100 нг/мл), и 0.3 мл фосфатного буферного раствора (pH 6.5), содержащего фермент β-глюкуронидазу E. coli, образец инкубируют в течение 30 мин при 50°C. После охлаждения образца до комнатной температуры в него вводят смесь хлороформа и ацетона (150 и 500 мкл соответственно) при помощи шприца, перемешивают на вортексе 15 с и центрифугируют 10 мин при 10 000 об/мин. Нижний слой переносят в виалу, упаривают досуха в токе азота, сухой остаток растворяют в 100 мкл 1.6 М раствора гидроксиламина (метиловый спирт–вода (1 : 1)) и термостатируют виалу в течение 90 мин при 70°C с последующим анализом.

Валидация разработанного способа. Предложенный способ валидировали в соответствии с критериями FDA по валидации биоаналитических методик [29]. При валидации методики использовали синтетическую мочу ввиду сложности получения воспроизводимой матрицы с концентрациями стероидных гормонов ниже предела обнаружения.

Градуировочные зависимости строили в диапазоне концентраций 0.1–100 нг/мл (0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 нг/мл). Предел обнаружения устанавливали как концентрацию аналита, обеспечивающую соотношение сигнал : шум не менее 3 : 1, а предел определения соответствовал концентрации, определяемой с погрешностью менее 15%. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3.  

Чувствительность методики и линейный диапазон

Аналит Предел обнаружения, нг/мл Предел определения, нг/мл Линейный диапазон, нг/мл R2
Тестостерон 0.1 0.25 0.25–100 0.999
Дигидротестостерон 0.1 0.25 0.25–100 0.999
Кортизон 0.25 1.0 1.0–100 0.997
Гидрокортизон 0.25 1.0 1.0–100 0.995
Прогестерон 0.25 0.5 0.5–100 0.996
11α-Гидроксипрогестерон 0.25 0.5 0.5–100 0.998
Эстрон 0.1 0.25 0.25–100 0.996

Перекрестное загрязнение оценивали путем анализа холостого раствора после анализа 100 нг/мл раствора образца, при этом на хроматограмме холостого раствора не наблюдали пиков, соответствующих определяемым соединениям.

Правильность и воспроизводимость устанавливали при помощи анализа растворов контроля качества низкой (2.5 нг/мл), средней (10 нг/мл) и высокой (50 нг/мл) концентрации в течение одного и разных дней. Воспроизводимость выражали как относительное стандартное отклонение (sr), а правильность находили по уравнению (1):

${{e}_{r}} = {\text{ }}({{({{c}_{{{\text{опр}}}}}--{{c}_{{{\text{теор}}}}})} \mathord{\left/ {\vphantom {{({{c}_{{{\text{опр}}}}}--{{c}_{{{\text{теор}}}}})} {{{c}_{{{\text{теор}}}}}}}} \right. \kern-0em} {{{c}_{{{\text{теор}}}}}}}){\text{ }} \times {\text{ }}100,$

полученные результаты представлены в табл. 4.

Таблица 4.  

Аналитические характеристики методики (n = 15)

Аналит Концентрация раствора контроля качества, нг/мл В один день В разные дни
er, % sr, % er, % sr, %
Тестостерон 2.5 –11.2 13.2 –12.6 14.1
10 –3.5 8.2 –5.1 10.8
50 2.1 5.6 2.6 7.9
Дигидротестостерон 2.5 –11.7 11.6 –13.7 12.8
10 –4.2 7.2 –5.6 9.1
50 1.5 4.1 2.4 5.4
Кортизон 2.5 –14.2 13.4 –14.6 14.1
10 –5.1 9.2 –6.7 9.6
50 2.6 5.1 1.7 6.5
Гидрокортизон 2.5 –12.5 13.2 –14.6 13.8
10 –8.3 8.6 –7.5 10.5
50 1.1 4.2 2.6 6.0
Прогестерон 2.5 –12.7 11.8 –13.2 14.5
10 –5.5 7.9 –4.6 9.8
50 0.6 3.6 3.2 5.3
11α-Гидроксипрогестерон 2.5 –13.5 14.3 –14.5 14.8
10 –4.8 9.1 –5.2 10.2
50 1.8 5.7 4.3 6.7
Эстрон 2.5 –12.4 12.0 –13.9 13.4
10 –5.0 6.6 –7.8 8.5
50 1.4 2.5 1.3 4.7

Стабильность проб растворов контроля качества в автосамплере, прошедших через все этапы пробоподготовки, оценивали в течение 48 ч при 5°C. Установили, что отклонения в результатах не превышали 15%. Длительную стабильность оценивали в течение месяца путем проведения трех циклов заморозки (–20°C) и разморозки образцов контроля качества до комнатной температуры. В полученных результатах не было значительных отличий.

Анализ реальных образцов. Предложенный способ использовали для анализа реальных образцов с применением метода стандартной добавки. Для этого в образец мочи добавляли смеси аналитов трех концентраций (10, 50 и 100 нг/мл). На рис. 1 в качестве примера приведены хроматограммы модельного образца и образца мочи с добавкой тестостерона (10, 50 и 100 нг/мл). Степени извлечения составили 76–95%, относительное стандартное отклонение не превышало 15%, что свидетельствует о пригодности методики для анализа реальных образцов.

Рис. 1.

Хроматограммы по выделенному иону (m/z 304.2271) модельного образца (а) и образца мочи (б) с добавками 0 (1), 10 (2), 50 (3), 100 (4) нг/мл тестостерона (I).

* * *

Таким образом, разработан чувствительный, простой и воспроизводимый способ определения кетостероидов. Дериватизация с гидроксиламином позволила значительно повысить чувствительность методики для большинства соединений по сравнению с нашей предыдущей работой [8], особенно для эстрона. Анализ реальных образцов показал возможность применения предложенного способа для определения кетостероидов.

Инновационный проект выполнен при финансовой поддержке Кубанского научного фонда в рамках Конкурса научно-инновационных проектов, ориентированных на коммерциализацию № НИП-20.1/4, с использованием научного оборудования ЦКП “Эколого-аналитический центр” Кубанского государственного университета.

Список литературы

  1. Norman A.W. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. 2nd Ed. New Delhi, India: Academic Press, 2003. P. 3166. https://doi.org/10.1016/B0-12-227055-X/00606-4

  2. Biason-Lauber A. Disorders of steroid synthesis and metabolism / Physician’s Guide to the Laboratory Diagnosis of Metabolic Diseases / Eds. Blau N., Duran M., Blaskovics M.E., Gibson K.M. Berlin, Heidelberg: Springer, 2003. P. 551. https://doi.org/10.1007/978-3-642-55878-8_35

  3. Häkkinen M.R., Murtola T., Voutilainen R., Poutanen M., Linnanen T., Koskivuori J., Lakka T., Jääskeläinen J., Auriola S. Simultaneous analysis by LC–MS/MS of 22 ketosteroids with hydroxylamine derivatization and underivatized estradiol from human plasma, serum and prostate tissue // J. Pharm. Biomed. Anal. 2019. V. 164. P. 642. doi.org/https://doi.org/10.1016/j.jpba.2018.11.035

  4. Márta Z., Bobály B., Fekete J., Magda B., Imre T., Mészáros K.V., Bálint M., Szabó P.T. Simultaneous determination of thirteen different steroid hormones using micro UHPLC−MS/MS with on-line SPE system // J. Pharm. Biomed. Anal. 2018. V. 150. P. 258. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2017.12.014

  5. West C.D., Mahajan D.K., Chavré V.J., Nabors C.J., Tyler F.H. Simultaneous measurement of multiple plasma steroids by radioimmunoassay demonstrating episodic secretion // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1973. V. 36. № 6. P. 1230. https://doi.org/10.1210/jcem-36-6-1230

  6. Oerter K.E., Guardabasso V., Rodbard D. Detection and characterization of peaks and estimation of instantaneous secretory rate for episodic pulsatile hormone secretion // Comput. Biomed. Res. 1986. V. 19. № 2. P. 170. https://doi.org/10.1016/0010-4809(86)90014-5

  7. Chung S., Son G.H., Kim K. Circadian rhythm of adrenal glucocorticoid: its regulation and clinical implications // Biochim. Biophys. Acta. 2011. V. 1812. № 5. P. 581. https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2011.02.003

  8. Dmitrieva E., Temerdashev A., Azaryan A., Gashimova E. Quantification of steroid hormones in human urine by DLLME and UHPLC−HRMS detection // J. Chromatogr. B: Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2020. V. 159. Article 122390. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2020.122390

  9. Higashi T., Ogawa S. Chemical derivatization for enhancing sensitivity during LC/ESI−MS/MS quantification of steroids in biological samples: A review // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 2016. V. 162. P. 57. https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2015.10.003

  10. Higashi T. Trace determination of steroids causing age-related diseases using LC/MS combined with detection-oriented derivatization // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 2006. V. 54. № 11. P. 1479. https://doi.org/10.1248/cpb.54.1479

  11. He G., Wu Y., Lu J. Doping control analysis of 13 steroids and structural-like analytes in human urine using Quadrupole-Orbitrap LC−MS/MS with parallel reaction monitoring (PRM) mode // Steroids. 2018. V. 131. P. 1. https://doi.org/10.1016/j.steroids.2017.12.011

  12. Pitarch-Motellón J., Sancho J.V., Ibáñez M., Pozo O., Roig-Navarro A.F. Determination of selected endogenous anabolic androgenic steroids and ratios in urine by ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry and isotope pattern deconvolution // J. Chromatogr. A. 2017. V. 1515. P. 172. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2017.08.006

  13. Rincon A.V., Ostner J., Heistermann M., Deschner T. Measuring urinary cortisol and testosterone levels in male Barbary macaques: A comparison of EIA and LC−MS // Gen. Comp. Endocrinol. 2019. V. 281. P. 117. https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2019.05.017

  14. Huang X., Yuan D., Huang B. Determination of steroid sex hormones in urine matrix by stir bar sorptive extraction based on monolithic material and liquid chromatography with diode array detection // Talanta. 2008. V. 75. № 1. P. 172. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2007.10.052

  15. Saito K., Yagi K., Ishizaki A., Kataoka H. Determination of anabolic steroids in human urine by automated in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography-mass spectrometry // J. Pharm. Biomed. Anal. 2010. V. 52. № 5. P. 727. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2010.02.027

  16. Andersen D.W., Linnet K. Screening for anabolic steroids in urine of forensic cases using fully automated solid phase extraction and LC−MS−MS // J. Anal. Toxicol. 2014. V. 38. № 9. P. 637. https://doi.org/10.1093/jat/bku098

  17. Denver N., Khan S., Homer N.Z.M., MacLean M.R., Andrew R. Current strategies for quantification of estrogens in clinical research // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 2019. V. 192. Article 105373. https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2019.04.022

  18. Leong M.-I., Fuh M.-R., Huang S.-D. Beyond dispersive liquid–liquid microextraction // J. Chromatogr. A. 2014. V. 1335. P. 2. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2014.02.021

  19. Higashi T., Shimada K. Derivatization of neutral steroids to enhance their detection characteristics in liquid chromatography−mass spectrometry // Anal. Bioanal. Chem. 2004. V. 378. № 4. P. 875. https://doi.org/10.1007/s00216-003-2252-z

  20. Zhang T.-Y., Li S., Zhu Q.-F., Wang Q., Hussain D., Feng Y.-Q. Derivatization for liquid chromatography−electrospray ionization−mass spectrometry analysis of small-molecular weight compounds // Trends Anal. Chem. 2019. V. 119. Article 115608. https://doi.org/10.1016/j.trac.2019.07.019

  21. Kushnir M.M., Rockwood A.L., Bergquist J., Varshavsky M., Roberts W.L., Yue B., Bunker A.M., Meikle A.W. High-sensitivity tandem mass spectrometry assay for serum estrone and estradiol // Am. J. Clin. Pathol. 2008. V. 129. № 4. P. 530. https://doi.org/10.1309/LC03BHQ5XJPJYEKG

  22. Sarigul N., Korkmaz F., Kurultak İ. A new artificial urine protocol to better imitate human urine // Sci. Rep. 2019. V. 9. Article 20159. https://doi.org/10.1038/s41598-019-56693-4

  23. Keski-Rahkonen P., Huhtinen K., Poutanen M., Auriola S. Fast and sensitive liquid chromatography-mass spectrometry assay for seven androgenic and progestagenic steroids in human serum // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 2011. V. 127. № 3-5. P. 396. https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2011.06.006

  24. Liu Q., Chi Q., Fan R.-T., Tian H.-D., Wang X. Quantitative-profiling method of serum steroid hormones by hydroxylamine-derivatization HPLC−MS // Nat. Prod. Bioprospect. 2019. V. 9. № 3. P. 201. https://doi.org/10.1007/s13659-019-0204-3

  25. Mousavi L., Tamiji Z., Khoshayand M.R. Applications and opportunities of experimental design for the disper-sive liquid−liquid microextraction method — A review // Talanta. 2018. V. 190. P. 335. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2018.08.002

  26. Ferreira S.L.C., Bruns R.E., Ferreira H.S., Matos G.D., David J.M., Brandão G.C., da Silva E.G.P., Portugal L.A., dos Reis P.S., Souza A.S., dos Santos W.N.L. Box-Behnken design: An alternative for the optimization of analytical methods // Anal. Chim. Acta. 2007. V. 597. № 2. P. 179. https://doi.org/10.1016/j.aca.2007.07.011

  27. Ebrahimi-Najafabadi H., Leardi R., Jalali-Heravi M. Experimental design in analytical chemistry – Part I: Theory // J AOAC Int. 2014. V. 97. № 1. P. 3. https://doi.org/10.5740/jaoacint.sgeebrahimi1

  28. Bezerra M.A., Santelli R.E., Oliveira E.P., Villar L.S., Escaleira L.A. Response surface methodology (RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry // Talanta. 2008. V. 76. № 5. P. 965. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2008.05.019

  29. Food and Drug Administration Gguidance. Bioanalytical Method Validation. Guidance for Industry. https://www.fda.gov/files/drugs/published/Bioanalytical-Method-Validation-Guidance-for-Industry.pdf, 2018 (02.04.2021).

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Журнал аналитической химии

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал