Журнал аналитической химии, 2021, T. 76, № 5, стр. 454-466

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выполняли качественный анализ двух искусственных смесей. Одна смесь на основе этилового спирта содержала 27 веществ, входящих в состав ветеринарного препарата АСД-2Ф. Для большего увеличения числа пиков различных веществ на протяженности всей хроматограммы в смесь включали некоторые вещества, не входящие в состав АСД-2Ф, но близкие к ним по химическому строению и доступные для приобретения, а именно уротропин и 6-метилурацил. Вторая смесь на основе гексана содержала двадцать н-алканов от гептана до гексакозана. Содержание компонентов в обеих смесях подбирали такое, которое исключало бы перегрузку колонки.

Исследования проводили на хроматографе Хроматэк-Кристалл-5000.1. Комплектация хроматографа: испаритель капиллярный, детектор пламенно-ионизационный (ПИД) и капиллярная колонка VB-1701 30 м × 0.32 мм × 0.50 µм. Режим работы хроматографа: температура испарителя 250°С, температура ПИД 250°С, начальная температура колонки 120°С, выдержка начальной изотермы 5 мин, скорость подъема температуры колонки 10°С/мин, конечная температура колонки 230°С. В качестве газа-носителя использовали гелий в режиме поддержания постоянного давления перед колонкой 100 кПа, коэффициент деления потока 1/30, режим экономии газа. Газовый режим ПИД: расход водорода 30 мл/мин, расход воздуха 300 мл/мин, поддув инертного газа (гелия) 30 мл/мин. Объем вводимой в испаритель пробы 1 мкл. Пробу вводили вручную. Общая продолжительность – 35 мин.

Время удерживания компонентов определяли в минутах с точностью до четвертого знака после запятой с помощью программного обеспечения, прилагаемого к хроматографу. Использовали программное обеспечение “Хроматэк Аналитик 3.0”.

В условиях повторяемости проводили серию из трех анализов в течение одного рабочего дня с интервалом между анализами 60 ± 1 мин. Всего выполнили десять серий анализов каждой смеси в разные дни с разными промежутками между днями проведения анализа, что соответствует условиям внутрилабораторной прецизионности с изменением фактора “время”. Полученные экспериментальные данные в форме результатов измерений, сбалансированных по рекомендуемым [13] однородным уровням, приведены в табл. 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Время хроматографического удерживания для каждого компонента, полученное в условиях повторяемости [14], т.е. в одной серии, состоящей из трех анализов, усредняли и находили его выборочное СО. Для каждой серии анализов обнаружена зависимость значения СО от времени, отчетливо проявляющаяся на этапе подъема температуры колонки. Результаты, полученные после усреднения данных по всем сериям, иллюстрирует рис. 2. Оценка СО на участке начальной изотермы составила ~0.001 мин, а на участке конечной изотермы − ~0.01 мин.

Выборочное уравнение линейной регрессии на участке программирования температуры, параметрически идентифицируемое по методу наименьших квадратов, имеет вид:

где $\hat {\sigma }$ – оценка условного математического ожидания стандартного отклонения времени хроматографического удерживания, мин; τ – текущее время анализа, мин.

Для установления зависимости СО от температуры колонки учитывали, что температура начальной изотермы составляла 120°С, температура конечной изотермы 230°С, подъем температуры осуществлялся линейно со скоростью 10°С/мин. В результате аналогичная регрессионная зависимость, связывающая температуру колонки и СО времени хроматографического удерживания, имеет вид:

где t – температура колонки, °С.

Основной метрологической характеристикой уравнения регрессии [15 ] применительно к данной задаче является СО суммарной погрешности (суммарной стандартной неопределенности) однократного измерения выходной величины y, в качестве которой выступает СО времени хроматографического удерживания. Входной величиной x является время хроматографического удерживания. В дальнейшем приняты следующие обозначения:

Значения выходной координаты y рассчитывали по формуле:

где ${{x}_{{ij\ell }}}$ – время хроматографического удерживания j-го компонента в 𝓁-ом анализе i-ой серии; ${{\bar {x}}_{{ij}}}$ – среднее время хроматографического удерживания j-го компонента в i-ой серии; k – число анализов в одной серии.

Исходные данные для этого расчета представлены в табл. 1. Полученные значения выходной координаты $y$ представлены в табл. 2.

Применяемые для расчета неопределенности уравнения регрессии формулы зависят от следующих условий: 1) наличие или отсутствие корреляции между погрешностями определения входной величины; 2) наличие или отсутствие равноточности измерений при определении входной величины.

Погрешность определения любой физической величины определяется композицией случайных и систематических погрешностей [16]. В случае прямых измерений в нормальных условиях систематическая погрешность определяется только основной погрешностью средства измерений [17]. Для данного аппаратно-программного хроматографического комплекса возможно задание предела прецизионности определения времени хроматографического удерживания вплоть до 1 × 10^–4 мин и менее. При этом минимальное значение СО этого показателя составляет порядка 0.001 мин, т.е. на порядок больше, вследствие чего систематической погрешностью можно пренебречь. Таким образом, для оценки наличия корреляции между погрешностями определения времени хроматографического удерживания достаточно оценить корреляцию между СО времен хроматографического удерживания отдельных компонентов.

По набору данных, представленных в табл. 2, столбцы которой интерпретировали как значения случайных величин, коэффициенты корреляции рассчитывали по формуле:

где u и v – номера компонентов, для которых оценивается корреляция; m – количество серий анализов.

Среднее значение выходной координаты, усредненное по всем сериям анализов для j-ого компонента, составило

Результаты расчета коэффициентов корреляции приведены в табл. 3.

Правильность гипотезы о значимости коэффициента корреляции оценивали по критерию Стьюдента. Коэффициент корреляции считали значимым при выполнении условия:

t > t_кр(α, f),

где t и t_кр – соответственно наблюдаемое и критическое значения критерия Стьюдента, α – уровень значимости, f – число степеней свободы:

f = n – 2,

где n – количество компонентов хроматограммы на участке программирования температуры.

Наблюдаемое значение критерия Стьюдента

Если в последнюю формулу подставить вместо наблюдаемого значения критерия Стьюдента критическое и разрешить ее относительно коэффициента корреляции, то получим его минимальное значение, при котором наличие корреляции будет оцениваться положительно.

Для доверительной вероятности p = 0.95 и n = 11 при двусторонней альтернативной гипотезе критическое значение t_кр(0.05, 9) = 2.26 [14]. Тогда минимальное значение $r_{{u{v}}}^{{\min }}$ = 0.60. Соответственно этому значению ситуацию наличия или отсутствия корреляции между СО времени хроматографического удерживания отдельных компонентов иллюстрирует табл. 4. “Да” означает наличие корреляции в строке табл. 4, “нет” – ее отсутствие. Подсчет относительной частоты наличия корреляции между отдельными компонентами (рис. 3) показал, что в 80% случаев СО времен хроматографического удерживания соседних пиков коррелируют между собой. Таким образом, в целом корреляция между погрешностями определения входной величины имеет место.

Равноточность измерений при определении входной величины оценивали путем проверки однородности дисперсий входной величины отдельного компонента по всем сериям измерений.

Дисперсия ВХУ j-го компонента по всем сериям измерений составляет:

Среднее значение ВХУ j-го компонента в серии по всем сериям измерений:

Результаты расчетов приведены в табл. 5.

Гипотеза об однородности дисперсий принимается при выполнении условия:

G < G_кр(α, f₁, n),

где G и G_кр – соответственно наблюдаемое и критическое значения критерия Кохрена, f₁ – число степеней свободы отдельной дисперсии, n − количество суммируемых дисперсий, равное количеству компонентов:

где $s_{{\max }}^{2}$ – максимальная из сравниваемых дисперсий.

По результатам расчетов получено, что G = = 0.397; при этом критическое значение G_кр(0.05, 29, 11) = 0.165 [18, c. 469].

Таким образом,_{неопределенность^{уравнения регрессии необходиморассчитыватьдля случая наличия корреляциимеждупогрешностями определения входной величиныи отсутствия равноточности измерений при определении входной величины.}}

В данном случае суммарная стандартная неопределенность однократного измерения выходной величины y определяется по формуле [15 ] :

где ${{u}_{\Sigma }}\left( {\left. y \right|x} \right)$ – суммарная стандартная неопределенность однократного измерения выходной величины y в точке х; ${{s}_{\Sigma }}\left( {\left. y \right|x} \right)$ – СО суммарной погрешности однократного измерения выходной величины y в точке х; n – количество условных средних, используемых для оценки неопределенности уравнения регрессии, равное количеству компонентов хроматограммы на участке программирования температуры; х – входная координата уравнения регрессии (время хроматографического удерживания); ${{\bar {x}}_{j}}$ – среднее значение входной координаты в j-ой точке уравнения регрессии; $s\left( {{{x}_{j}}} \right)$ – СО значения входной координаты в j-ой точке; $\bar {\bar {x}}$ – общее среднее значение входной координаты; y – выходная координата уравнения регрессии (СО времени хроматографического удерживания); ${{s}^{2}}(\bar {y})$ – дисперсия общего среднего значения выходной координаты; b – коэффициент регрессии.

Дисперсия общего среднего значения выходной величины:

где ${{s}^{2}}\left( {{{{\bar {y}}}_{j}}} \right)$ – дисперсия среднего значения выходной координаты в j-ой точке уравнения регрессии: где ${{s}^{2}}\left( {{{y}_{j}}} \right)$ – дисперсия выходной координаты в j-ой точке уравнения регрессии:

Промежуточные результаты расчетов представлены в табл. 6. Используя их, нетрудно определить порядки величин, входящих в уравнение (1):

Тогда Таким образом, Аналогично Тогда Таким образом,

Из полученных неравенств следует, что вторым слагаемым в формуле (1) можно пренебречь, и данная формула примет вид:

После подстановки числовых данных в итоге получена следующая функция, описывающая оценку СО суммарной погрешности (суммарной стандартной неопределенности) уравнения регрессии:

Результирующий график, на котором изображены экспериментальные данные, кривая регрессии и доверительные интервалы, приведен на рис. 4. Коэффициент охвата при переходе к расширенной неопределенности принят равным двум [15 ] .

Поскольку в хроматографии для характеристики прецизионности широко применяется относительное СО, те же зависимости приведены и для этого параметра (рис. 5). Как видно, в режиме программирования температуры хроматографической колонки ОСО ВХУ не превышает 0.2%.

* * *

Таким образом, для случая внутрилабораторной прецизионности с изменением фактора “время” на примере газового хроматографа Хроматэк-Кристалл-5000.1 установлено следующее: 1) при дозировании пробы вручную в режиме одноступенчатого программирования температуры колонки фактически достижимая величина ОСО ВХУ не превышает 0.2 отн. %, что существенно увеличивает надежность идентификации компонентов пробы по сравнению с заявленной в описании типа средства измерения для изотермического режима; 2) стандартное отклонение времени хроматографического удерживания зависит от температуры хроматографической колонки и в режиме программирования температуры его значение существенно увеличивается; 3) полученная функциональная метрологическая характеристика уравнения регрессии позволяет рассчитать суммарную стандартную неопределенность в оценке стандартного отклонения времени хроматографического удерживания. Полученные результаты могут быть использованы для расчета доверительного интервала времени хроматографического удерживания, обеспечивающего достоверную идентификацию веществ.