Журнал аналитической химии, 2021, T. 76, № 7, стр. 634-647

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Методы исследования. Основной применяемый метод – пьезокварцевое микровзвешивание массивом сенсоров с разной селективностью и чувствительностью к аналитам; прибор – многоканальный анализатор газов “AquaStok” с методологией “электронный нос” (ООО “Сенсорика – Новые Технологии, Россия [10]). Прибор имеет управляемую ячейку детектирования объемом 60.0 см³ в виде цилиндра с крышкой и патрубками для ввода газовой фазы (рис. 1а), которая позволяет регулировать вариант напуска анализируемой смеси газов: инжекторный или фронтальный.

Рис. 1.

Многоканальный анализатор газов “AquaStok” (а) и образец пробы цервикальной слизи перед измерением (б).

Измерительными элементами анализатора газов “AquaStok” являются химические пьезосенсоры на основе пьезорезонаторов ОАВ-типа (генерация объемных акустических волн) с базовой частотой колебаний 10–13 МГц (ОАО “Пьезо”, Москва), чувствительность и селективность которых регулируется нанесением сорбентов различной природы. В качестве чувствительных слоев применяли твердотельные сорбенты и наноматериалы: синтезированный по известной методике наноструктурированный биогидроксиапатит Ca₅(PO₄)₃OH (ГА), карбоксилированные многостенные углеродные нанотрубки (МУНТ_COOH, Черноголовка, Институт проблем технологии микроэлектроники и особочистых материалов РАН), нитрат цирконила ZrO(NO₃)₂⋅2H₂O (ЦР), ч. д. а., (Россия, ЛенРеактив), электроды сенсора наносили фазы различной массы (2.0–6.0 мкг). Каждому сенсору с определенным модификатором индивидуальной массы в массиве присваивали номер: сенсор № 1 – МУНТ_COOH, сенсор № 2 – ЦР, сенсор № 3 – ГА, сенсор № 4 – ГА, сенсор № 5 – ГА, сенсор № 6 – ЦР, сенсор № 7 – МУНТ_COOH. Твердотельные фазы наносили из суспензий в ацетоне/толуоле. Фазы на основе одного вещества разных масс позволяют дополнительно варьировать чувствительность и селективность по отношению к отдельным группам соединений.

Предварительно по индивидуальным веществам (спирты С₂–С₅ нормального и разветвленного строения; кислоты С₁–С₄; ацетон, метилэтилкетон, ацетальдегид, формальдегид; алкилацетаты С₁–С₄; аммиак, амины линейного и циклического строения; арены) оценивали селективность и кинетические особенности сорбционно-десорбционных процессов на выбранном массиве стабилизированных газовых сенсоров. Для каждого выбранного или группы близких аналитов устанавливали идентификационные параметры A_i/j [11, 12], которые в дальнейшем служили для их обнаружения в биопробах. Предел определения массивом сенсоров составляет по группам соединений: для кетонов – 20 ррm по ацетону, для спиртов – 10 ppm по этанолу, для аренов – 2 ppm по толуолу, 20 ppb по аммиаку и для аминов – 5 ppb по диэтиламину).

Аналитическая информация многоканального анализатора газов “AquaStok” представлена в виде набора выходных кривых сигналов сенсоров – хроночастотограмм (рис. 2а); дискретных сигналов сенсоров, сформированных в виде круговых диаграмм – “визуальных отпечатков” максимальных сигналов пьезосенсоров (рис. 2б); кинетических “визуальных отпечатков”, сформированных по сумме откликов в отдельные моменты времени взаимодействия (рис. 2в) и расчетными параметрами на их основе.

Рис. 2.

Аналитическая информация многоканального анализатора газов “AquaStok”: набор хроночастотограмм (а), “визуальный отпечаток” максимальных сигналов сенсоров (б), кинетический “визуальный отпечаток” в парах пробы цервикальной слизи (для примера) (в).

При этом откликом для каждого элемента матрицы является частота колебаний кварцевой пластины в каждый момент времени (F, Гц), но более информативными являются сигналы сенсоров – изменение частоты колебаний кварцевой пластины в определенные моменты времени (ΔF, Гц) и аналитические сигналы, максимально связанные с концентрацией и природой аналита, – наибольшие изменения частот колебаний сенсоров при сорбции за 80 с (ΔF_max, Гц) и характеризующие эффективность сорбции органических соединений на фазах сорбентов. Важной информацией являются расчетные характеристики на основе выделенных сигналов каждого сенсора и обработанных по определенному алгоритму, напрямую не выделяются в программном обеспечении прибора качественные и количественные параметры.

Количественным параметром микровзвешивания массивом пьезосенсоров является площадь “визуального отпечатка” сигналов сенсоров, S_{в. о}, Гц·с (расчетный параметр), которая определяется суммарной массой адсорбированных фазами легколетучих органических веществ за все время измерения. Это интегральный и наиболее полный расчетный аналитический сигнал “электронного носа”.

Задачи качественного анализа соединений, регистрируемых выбранным массивом сенсоров, решали по параметрам парной эффективности сорбции А_i/j – отношению максимальных сигналов отдельных пьезосенсоров ΔF_i/ΔF_j (где i, j – различные покрытия электродов/номера сенсоров в массиве). Этот параметр характеризует соотношение в пробе концентрации различных классов соединений и идентичен для разбавленных смесей паров коэффициенту селективности – отношению чувствительностей микровзвешивания веществ двумя сорбентами [9, 11]. Еще один параметр, отражающий постоянство состава смеси летучих соединений в околосенсорном пространстве – форма “визуального отпечатка” сигналов сенсоров с характерными распределениями по осям откликов, которая определяется в условиях измерения набором и концентрацией соединений в биопробе.

Объекты исследования. Работу проводили на базе ООО “МЦПП” (Медицинский центр профессиональной патологии, Воронеж) совместно с врачом-гинекологом с соблюдением правил и этики исследований (протокол этического комитета № 7 от 30.11.2017 г. ФГБОУ ВО “ВГМУ им. Н.Н. Бурденко”).

Для оценки гинекологического состояния пациентов анализировали состав газовой фазы, выделяемой пробой цервикальной слизи. Оценка природы и концентрации легколетучих соединений цервикальной слизи позволяет выявить патологии в здоровье и отследить их состояние на разных стадиях, в том числе в процессе лечения и ремиссии.

Для фиксирования летучих органических соединений на покровное стекло (рис. 1б) помещали пробу цервикальной слизи (мазок диаметром ≈3–5 мм) и проводили измерение при температуре (24 ± 1°С) не позднее чем через 5 мин после отбора пробы для фиксирования достоверных результатов.

Измерение проводили по авторской методике в течение 200 с. На покровном стекле пробу цервикальной слизи (пробу отбирал гинеколог) помещали в крышку-держатель ячейки детектирования, закрывали ячейку и в течение 80 с фиксировали отклик сенсоров при сорбции свободно диффундирующих из мазка веществ, затем убирали пробу с крышкой и фиксировали сигналы при самопроизвольной десорбции веществ с поверхности модификаторов. Условия эксперимента и конструкция ячейки предусматривают воспроизводимость условий циклов сорбция/десорбция.

На предварительном этапе изучили возможность проведения такого анализа и сравнения состава летучих соединений, выделяемых цервикальной слизью, по 20 пробам (предварительная выборка). С помощью предварительной выборки оптимизировали временные интервалы сорбции и десорбции на выбранном массиве сенсоров, режим измерения (фронтальный или инжекторный) и площадь мазка. По оптимизированной методике проанализировали 40 проб пациентов. Для правильной интерпретации результатов “электронного носа” применяли диагноз врача, описание им состояния, выраженность поражения, которую определяли по результатам микробиологического исследования в лаборатории Центра.

Моделирование результатов пьезокварцевого микровзвешивания легколетучих соединений, выделяемых биопробами, по методу главных компонент и их классификацию методом независимого моделирования аналогий классов (SIMCA) проводили в программе The Unscrambler X v.10.0.1 (CamoSoftware AS, Осло, Норвегия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Основные задачи исследования – оценка возможности применения массива сенсоров для решения задачи тест-анализа биопроб, построение модели, связывающей регистрируемые сигналы и расчетные параметры массива сенсоров и классификацию биопроб по критериям: наличие/отсутствие/интенсивность патологий, приоритетно – воспалений и инфекций, требующих назначение антибиотиков; распознавание в смеси легколетучих соединений слизи органических биомолекул, специфических для разных патологий или максимально присутствующих в пробе.

В идентичных условиях в кабинете врача по разработанной методике проанализировали 40 биопроб. Для разработки аналитического решения по экспрессной оценке здоровья и состояния заболевания выбраны 30 пациентов условно здоровых (плановое обследование) и с близким набором воспалений и отклонений от уловной нормы, включая две пробы, заведомо не входящие в выбранные группы (отсутствие во время исследования или ранее перенесенных инфекций и воспалений, но не здоровые). Выбирали пациентов с диагнозами, предполагающими антибактериальное лечение с разной историей воспалений (активная форма, ремиссия, обострение). Пробы для выбранных 30 пациентов анализировали с применением массива сенсоров и оценивали возможность разделения их на группы: “условно здоровые” (норма), “воспаление/инфекция”, “ремиссия” (состояние сразу после лечения или ранее перенесенные, хронические формы воспаления). При этом пробы цервикальной слизи разделили на 2 выборки: 20 проб – обучающая выборка и 10 проб – проверочная выборка. На основании предварительного диагноза врача пробы из обучающей выборки разделили на группы “условно здоровые”, “воспаление/инфекция” и “ремиссия” (табл. 2). Число проб из каждой группы в обучающей выборке различалось и формировалось естественным путем по наличию пациентов.

Приоритетными факторами, влияющими на результаты, являются объем пробы; время от момента забора пробы до начала тестирования.

На оставшихся 10 пробах, некоторые из которых могут быть отнесены к выбранным группам, но не включенных в обучающую и проверочную выборки, изучали зависимость аналитического сигнала массива сенсоров, связанного с концентрацией летучих биомолекул (S_в.о., Гц⋅с), от времени с момента отбора слизи до измерения. Время выдержки (τ_в, мин) изменяли с шагом 1 мин в интервале от 1 до 15 мин для не менее чем для двух–трех проб из каждой группы и не относящихся к ним. Установлена устойчивая отрицательная корреляция между этими характеристиками: $S_{{{\text{в}}{\text{.о}}{\text{.}}}}^{0}$ = –2218τ_в (R² = 0.97), где $S_{{{\text{в}}{\text{.о}}{\text{.}}}}^{0},$ Гц⋅с – сигнал при минимальном времени выдержки (2 мин). По этой зависимости с учетом шума системы и усредненных сигналов для проб из группы “условно здоровые” (минимальное содержание легколетучих соединений) установили время от момента забора пробы до измерения, которое не должно превышать трех минут. Полученная зависимость позволяет рассчитать время, при котором могут быть допущены ложноположительные и ложноотрицательные решения ранжирования проб по группам. Так, в группу “условно здоровые” могут попасть пробы из группы “воспаление/инфекция” после 15-минутного выдерживания от момента забора до измерения. Пробы из группы “инфекции/воспаление” в группу “ремиссия” ложно могут быть отнесены при увеличении времени от забора до измерения до восьми минут. Еще более критичным является несоблюдение времени измерения для проб из группы “ремиссия”. Так, если время до момента измерения превысит 3 мин, то для таких биопроб существенно повысится доля ложноотрицательных результатов. При этом пробы из группы “ремиссия” устойчиво попадают в группу “условно здоровые”. При отсутствии инфекций и воспаления время выдержки пробы от момента забора до измерения является основным фактором риска получения ложного результата.

В связи с этим для обеспечения надежности принятия решения при ранжировании проб на группы время от момента забора биоматериала до начала измерения не должно превышать 3–5 мин. Это требование соответствует условию разработки экспрессных методик анализа в режиме “на месте”.

Для решения задачи идентификации летучих биомолекул, выделяемых биопробами, важно постоянство идентификационных параметров A_i/j. Установлено, что в течение изученного времени выдержки биопроб выбранные качественные параметры постоянны (табл. 3). Во всем интервале оптимизированного времени применение параметров A_i/j обеспечивает правильность распознавания ключевых аналитов (табл. 4).

Разработаны алгоритм и методика анализа мазков цервикальной слизи в режиме “на месте” не позднее чем через 5 мин после забора врачом в гинекологическом кабинете. Установлено, что интегральные количественные аналитические сигналы массива сенсоров S_{в. о.} значимо отличаются для каждой из выделенных групп и для проб, не вошедших в рассматриваемые группы.

Для выделенной обучающей выборки выполнен МГК-анализ абсолютных сигналов каждого сенсора и интегрального аналитического сигнала массива сенсоров. Установлено, что уже по первой главной компоненте объясненная дисперсия составляет 98% и позволяет разбить выборку на три независимые группы (рис. 3).

Рис. 3.

График счетов МГК-модели по параметрам массива сенсоров (аналитические сигналы сенсоров 2, 4, 6 и S_{в. о.}) для проб из обучающей выборки.

Наибольшие нагрузки для первой главной компоненты наблюдаются для аналитических сигналов сенсоров 2, 4, 6 и S_{в. о.}, что согласуется с характеристиками селективности фаз на этих сенсорах к биомолекулам (приоритетно амины, кислоты, кетоны и др.), высокое содержание которых связано с негативными процессами воспаления и деструкции тканей. Сигналы остальных сенсоров незначимы для решения поставленной задачи и могут быть исключены из массива. Это позволит уменьшить размеры ячейки детектирования и повысить предел определения аналитов. Однако именно площадь фигуры сигналов всего массива сенсоров S_в. о. с учетом перекрестной сорбции веществ на всех сорбентах является интегральной количественной характеристикой, отражающей вклад всех сенсоров и детектируемых ими молекул. Применение этого расчетного параметра более надежно по сравнению с аналитическими сигналами отдельных сенсоров. Построена диаграмма распределения количественных показателей сорбции легколетучих соединений биопроб цервикальной слизи из обучающей выборки для групп “условно здоровые” (норма), “воспаление/инфекция”, “ремиссия” (рис. 4).

Рис. 4.

Диаграмма распределения количественных показателей проб из обучающей выборки.

Установлено, что наименьший аналитический сигнал (S_{в. о.}, Гц⋅с) незначительно превышающий трехкратный шум массива сенсоров (±30 Гц⋅с), характерен для группы “условно здоровые” (до 50 Гц⋅с), что существенно ниже значений для группы “инфекция/воспаление” (от 50 000 до 75 000 Гц⋅с). Промежуточное значение S_в. о., также значимо отличающееся от значений для групп “условно здоровые” и “воспаление/инфекция”, характерно для группы “ремиссия” (от 15 000 до 25 000 Гц⋅с). Это позволяет выделить диапазоны нормированных в пределах минимального (шум) и максимального (жидкая проба) количественных параметров массива изученных сенсоров, соответствующих границам однозначного принятия решений о состоянии биопробы и процессов в организме: надежное отнесение к группе “условно здоровые” соответствует нормированным откликам массива до 1%, к группе “ремиссия” относятся пробы по нормированным площадям сигнала в диапазоне (20–40)%, к группе “воспаление/инфекция” – больше 60% от максимально выбранного сигнала с учетом доверительного интервала. Не входящие в указанные интервалы нормированные значения также информативны и указывают на тенденцию смещения состояния биопробы и процессов в организме относительно исходного, т.е. обострение ремиссии при нормированных значениях S_в. о. больше 40%; наличие изменений с неявно выраженным течением – при значении этого параметра от 1 до 20%. При воспроизводимом отборе массы/объема проб и соблюдении времени выдержки пробы между отбором и измерением, наиболее значимым и простым параметром для прогнозирования качественного диагноза (условно здоров, воспаление, ремиссия) и оценки тенденции изменения гинекологического здоровья является S_{в. о.} (Гц⋅с). Так как на значение этого параметра сильно влияют условия отбора, для обеспечения правильности ранжирования проб на группы необходимо строго соблюдать условия выполнения методики анализа.

Интегральный количественный параметр массива сенсоров (S_{в. о.}, Гц⋅с) связан с концентрацией легколетучих соединений биопроб, т.е. с учетом избирательности фаз на сенсорах в массиве – со степенью выраженности воспаления. Идентифицировать возбудителей можно по природе доминирующего легколетучего соединения, выделяющегося из биопробы (табл. 1). Однако объем выборки недостаточен для изучения состава смеси соединений над цервикальной слизью только с одним видом возбудителя. Как правило, диагноз для выбранных групп пациентов соответствует микст-инфекции (любое сочетание вагинальных инфекций). В то же время, независимо от причины перенесенного или острого воспаления, состав выделяемых слизью легколетучих соединений может быть частично определен по набору выбранных идентификационных параметров, установленных для тест-веществ.

Установлено, что из выделенных стабильных параметров A_i/j для выбранных групп проб различаются показатели А(2/7), А(1/5), А(5/6), значения которых отражают изменение состава летучих соединений для биопроб из разных групп классификации (табл. 5).

Чем большее число параметров А_i/j для групп “воспаление/инфекция”, “ремиссия” отличается от таковых для группы “условно здоровые”, тем существеннее отличия по составу смеси легколетучих соединений проб, которые с высокой степенью вероятности отражают наличие и интенсивность протекания патогенных процессов в организме [9].

Сравнение показателей позволило установить, что пробы из группы “ремиссия” характеризуются идентичным составом легколетучих соединений, концентрация которых значимо больше, чем для группы “норма” и меньше, чем для группы “инфекция/воспаление”.

По идентификационным параметрам, полученным на этапе обучения массива сенсоров, установлены выделяющиеся из биопроб разных классификационных групп соединения (табл. 6).

По расчетным качественным и количественным параметрам не диагностируются и не проявляются симптомы диагноза “миома матки малых размеров”. Количественные показатели детектирования летучих соединений биопроб массивом выбраных сенсоров достаточны для предсказания процессов ремиссии и наличия ранее перенесенных заболеваний в стадии ремиссии, при этом не обязательно инфекционных (например, образование спаек), а также активных воспалительных процессов любой природы. Это является наиболее ценным с точки зрения информативности предлагаемого подхода. По совокупности двух типов параметров (количественного S_{в. о.} и качественного A_i/j) сводится к минимуму ошибочное отнесение проб в группы “условно здоровые”, “ремиссия”, “воспаление/инфекция”. Чувствительность установления наличия патологии с применением предложенной методики составляет 100%.

Для поиска корреляций откликов сенсоров массива с более детальными диагнозами (идентификация типа возбудителя или вида воспаления) необходимо существенное увеличение объема выборки с индивидуальными и микст-инфекциями (многочисленные микробные ассоциации). На этом этапе исследования специфичность по возбудителям такой классификации невысока или отсутствует в случае сложных воспалений. Однако полученные данные позволяют сделать несколько общих заключений об особенностях качественного состава летучих соединений цервикальной слизи (вещества указаны в порядке уменьшения значимости) при наличии инфекции:

1) В пробах с диагнозом врача “бактериальный вагиноз, хронический вагинит” преобладают кислоты С₂–С₄, спирты С₂–С₅, алкилацетаты, альдегиды, амины; при наличии кист – амины; для внутреннего эндометриоза характерно завышенное содержание аминов, ацетона, спиртов С₃–С₅; для кандидоза – аминов, спиртов; при андексите завышено содержание спиртов С₃–С₅ нормального и разветвленного строения.

2) Во всех пробах из группы “воспаление/инфекция” фиксируется присутствие аминов линейной и циклической структуры, что соответствует природе процессов в тканях.

Для проверки правильности предложенного алгоритма проанализировали данные, полученные для 10 проб из проверочной выборки. Регистрируемые и расчетные показатели для данных проб представлены в табл. 7. Сопоставление полученных результатов с данными обучающей выборки позволяет ранжировать пробы в группы:

1) по количественному параметру массива сенсоров – площади “визуальных отпечатков” (S_{в. о.}) – пробы 8*, 9*, 10* относятся к группе “ремиссия”, остальные пробы (с 1* по 7* включительно) – в группу “воспаление/инфекция” (см. табл. 7);

2) наиболее критическое состояние и развитие патогенных процессов в организме характерно для пробы 2* (табл. 7);

3) по набору параметров качественного и количественного состава легколетучих соединений биопроб цервикальной слизи из проверочной выборки установлено, что ни одна из проб не принадлежит группе “условно здоровые”;

4) неустойчивая оценка и классификация для проб 8*, 9* (табл. 7) между группами “ремиссия” и “условно здоровые” связаны с минимальным уровнем изменений биопробы (устойчивая ремиссия). Т.е. по данным “электронного носа” возможны оценка уровня ремиссии заболеваний и начала заболеваний, а также успех обратного процесса – оценка эффективности лечебных мероприятий.

Для повышения надежности прогноза по простым расчетным критериям необходимо существенно увеличить выборку с конкретными диагнозами и однозначным отнесением в какую-либо из трех выбранных групп. Вероятность неточного прогноза состояния цервикальной слизи относится к группе “ремиссия” и составляет 23%. Вероятность принятия ложноотрицательного решения по отнесению проб к группе “воспаление/инфекция” стремится к нулю.

Применили подход идентификации компонентов для проб из проверочной выборки (табл. 8). На основании полученных данных пробы проверочной выборки отнесены в группы ранжирования “условно здоровые”, “воспаление/инфекция”, “ремиссия”. По результатам микробиологических исследований уточнен диагноз. С помощью метода независимого моделирования аналогий классов (SIMCA) пробы из проверочной выборки безошибочно отнесены в соответствующие группы (табл. 9). Правильность отнесения пробы в группы ранжирования “условно здоровые”, “воспаление/инфекция”, “ремиссия” составляет по модели 90%.

Установлено, что в обеих выборках во всех группах проб, кроме “условно здоровые”, фиксируется присутствие многих классов органических соединений: спиртов, кетонов, молочной кислоты, аминов, алкилацетатов, ацетальдегида. Различия наблюдаются между группами “инфекция/воспаление” и “ремиссия” в количественных параметрах микровзвешивания – в величине сигналов единичных сенсоров и площади “визуального отпечатка” – суммарного количественного параметра, а значит в содержании этих соединений.

* * *

Показана и положительно оценена возможность экспрессной (не более 5 мин) оценки присутствия в пробе и содержания легколетучих соединений – маркеров патологических состояний и процессов у пациенток гинекологического профиля в режиме “на месте”. Разработан способ определения легколетучих соединений биопроб (мазки цервикальной слизи шейки матки) на приборе “AquaStok” с фронтальным режимом самопроизвольной диффузии паров, установлены количественные регистрируемые и расчетные параметры ранжирования проб на группы. Способ апробирован при диспансеризации населения в условиях выезда. Наноматериалы и твердотельные сорбенты позволяют сократить цикл измерения “от пробы до пробы” до 5 мин с характеристикой и ранжированием проб на группы в режиме реального времени. Производительность 30–35 проб/в смену. Минимальное время жизни изученных сенсоров от 8 (МУНТ) до 12 (ЦР и ГА) месяцев. Результаты апробации разработанного подхода оценены врачами-гинекологами как практически важные и повышающие качество предоставления услуг населению, способствующие сохранению здоровья, существенно сокращающие неоправданный прием антибиотиков.