Журнал аналитической химии, 2022, T. 77, № 12, стр. 1073-1079

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы. Стандартные образцы тестостерона, кортизона, гидрокортизона (кортизола), кортикостерона, прогестерона, 11α-гидроксипрогестерона (схема 1 ) и метилтестостерона (внутренний стандарт) приобретали у Sigma-Aldrich (США).

Cхема. 1. Структурные формулы определяемых соединений.

Метил-трет-бутиловый эфир (для ВЭЖХ-ИК-УФ, 99.9%) и метанол (для ВЭЖХ) приобретали у PanReac (Испания) и J.T. Baker (Великобритания) соответственно. Использовали дихлорметан, трихлорметан и тетрахлорметан, этилацетат, гексан (99%) (ЭКОС-1, Россия), а также дигидрофосфат калия, гидрофосфат натрия, тетрагидроборат натрия и гидроксид натрия (99%) для приготовления буферных растворов (Вектон, Россия).

Приборы и оборудование. Для УВЭЖХ-МС/МС-анализа использовали систему, состоящую из ультравысокоэффективного жидкостного хроматографа Dionex Ultimate-3000 и тройного квадрупольного масс-спектрометра Thermo TSQ Access Max (San-Jose, USA). Для разделения аналитов применяли аналитическую колонку Phenomenex Kinetex С18 (100 × 2.1 мм, 1.7 мкм), оснащенную соответствующей предохранительной колонкой в режиме градиентного элюирования при температуре термостатирования 40°C (табл. 1).

Для ионизации исследуемых соединений использовали нагреваемый источник ионизации электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов (табл. 2). Аналиты детектировали в режиме мониторинга выбранных реакций посредством соударительной диссоциации иона-предшественника (газ-мишень аргон, давление 1.5 мТорр) и определения ионов-продуктов (табл. 3). Условия детектирования в режиме мониторинга выбранных реакций оптимизировали путем напуска определяемых веществ в камеру источника ионизации с использованием шприцевого ввода.

Приготовление стандартных растворов. Стандартные растворы стероидных гормонов с концентрацией 1 мг/мл готовили в метаноле и хранили при 4°C в течение месяца. Градуировочные растворы с концентрациями 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 нг/мл готовили последовательным разбавлением стандартных растворов в метаноле и хранили при 4°C в течение месяца. Растворы контроля качества с концентрациями 10, 50 и 250 нг/мл готовили отдельно от градуировочных растворов в метаноле. Рабочий раствор внутреннего стандарта метилтестостерона с концентрацией 200 нг/мл в метаноле хранили в холодильной камере при 4°C.

Фосфатный буферный раствор (pH 8) готовили с использованием 0.067 М растворов дигидрофосфата калия и гидрофосфата натрия. Для приготовления боратного буферного раствора (pH 10) применяли 0.05 М раствор тетрагидробората натрия и 0.1 М раствора гидроксида натрия.

Отбор проб слюны. Образцы смешанной слюны получали естественной секрецией. Перед отбором проб добровольцы (мужчины и женщины в возрасте 20–45 лет) не употребляли еду и воздерживались от курения в течение часа, а за 10 мин ополаскивали рот водой. Анализ образцов проводили сразу после отбора проб. Образцы слюны хранили при −20°C.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор условий отбора проб слюны для анализа. Поскольку результаты анализа зависят от условий отбора проб слюны, предварительно рассмотрели влияние различных факторов на концентрации стероидных гормонов.

Коммерчески доступные контейнеры, такие как Salivette®, являются одними из наиболее широко используемых для получения образцов слюны. Тем не менее исследования показали, что содержащийся в них тампон, пропитываемый слюной при жевании, может влиять на результаты определения гормонов. Так, применение синтетического тампона существенно не влияет на результаты определения кортизола, в то время как концентрации других стероидных гормонов, в частности тестостерона, изменяются при его использовании [1]. Применение хлопкового тампона приводит к сорбции аналитов и, соответственно, к искажению результатов, поэтому оптимальным является прямой отбор проб слюны [2].

Прямой отбор проб можно проводить со стимулированием секреции слюны (например, лимонной кислотой, жвачкой без сахара, парафином) или без него. При использовании жвачки наблюдали увеличение концентрации тестостерона и кортизола, что затрудняет ее использование. Стимулирование слюноотделения различными методами приводило к изменению концентрации кортизона, поэтому при определении стероидного профиля оптимальным является отбор нестимулированной слюны в обычные полипропиленовые пробирки [1].

Другим важным требованием является отсутствие крови в слюне из-за механических повреждений в полости рта, например, при чистке зубов. Поскольку концентрации стероидных гормонов в слюне значительно ниже по сравнению с содержанием в крови, в случае ее попадания в слюну получаемые результаты будут значительно завышены. В случае присутствия в образце слюны 0.1–0.2% крови она приобретает розовый оттенок, что позволяет визуально оценить загрязнение анализируемого образца [6].

Кроме того, при определении глюкокротикоидов необходимо учитывать влияние фермента 11β-гидроксистероиддегидрогеназы II, под действием которого в слюнных железах происходит конверсия кортизола в неактивную кетоформу (кортизон) [2]. Это приводит к расхождениям в получаемых результатах, поэтому необходимо определять не только активную форму (кортизол), но и его неактивную кетоформу.

Оптимизация условий жидкостно-жидкостной экстракции. При оптимизации типа экстрагента рассматривали следующие растворители: ди-, три- и тетрахлорметан, этилацетат, гексан и метил-трет-бутиловый эфир. К 1 мл модельного образца (дистиллированная вода), содержащего исследуемые соединения с концентрацией 50 нг/мл, добавляли 1 мл экстрагента, перемешивали в течение 30 с на вортексе, центрифугировали образец 10 мин при 4000 об/мин, шприцем отбирали фазу экстрагента, упаривали ее досуха и вновь растворяли в 150 мкл смеси метанол–вода (1 : 1, по объему).

Этилацетат, хлороформ и метил-трет-бутиловый эфир обеспечивали количественное извлечение всех аналитов (>70%). Для дальнейших исследований выбрали метил-трет-бутиловый эфир ввиду его невысокой температуры кипения (55°C), а также меньшей токсичности по сравнению с хлорированными растворителями.

Оптимальный объем экстрагента, pH и время перемешивания на вортексе устанавливали с применением многофакторного анализа (план Бокса–Бенкена). Для обработки полученных результатов использовали ПО STATISTICA 10 (Statsoft). Уровни факторов представлены в табл. 4.

Для нахождения оптимальных уровней исследуемых факторов в модельный образец (1 мл, концентрация аналитов 50 нг/мл) добавляли 0.3 мл буферного раствора (pH 8 и 10) или 0.3 мл дистиллированной воды (pH 6). Затем в образец добавляли метил-трет-бутиловый эфир и перемешивали его на вортексе в течение 30 с. После этого водный слой вымораживали при −35°C и переносили эфир, содержащий аналиты, в пробирку для упаривания на твердотельном нагревателе при 60°C с последующим растворением сухого остатка в 150 мкл смеси метанол–вода (1 : 1, по объему) для анализа.

Все полученные модели оказались значимыми, поскольку скорректированные коэффициенты детерминации ($R_{{{\text{adj}}}}^{2}$) превышали 0.9. Поскольку свойства определяемых соединений отличаются, оптимальные уровни факторов также имели разные значения для исследуемых аналитов. Объем метил-трет-бутилового эфира оказывал наибольшее влияние на степени извлечения аналитов: с увеличением объема экстрагента степень извлечения возрастала, поэтому для дальнейших исследований выбрали объем 1.5 мл, который в совокупности с другими факторами обеспечивал высокие степени извлечения аналитов. Время перемешивания также влияет на степени извлечения аналитов, при этом значение 30 с оптимально для всех аналитов. Увеличение pH среды не приводило к получению более высоких степеней извлечения аналитов, поэтому в последующих экспериментах буферный раствор не добавляли.

Таким образом, пробоподготовку проводили в следующих условиях: к 1 мл образца слюны добавляли внутренний стандарт (метилтестостерон с конечной концентрацией 20 нг/мл). Затем вносили 1.5 мл метил-трет-бутилового эфира, перемешивали на вортексе в течение 30 с, центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин, вымораживали водную фазу при −35°C с последующим переносом органической фазы в другую пробирку и ее упариванием досуха при 60°C с растворением сухого остатка в 150 мкл смеси метанол–вода (1 : 1, по объему). В этих условиях степени извлечения аналитов составляли 91–98%. Степени извлечения рассчитывали как отношение площади пика соединения в растворе, прошедшем через все стадии пробоподготовки, к площади пика этого соединения в модельном растворе.

Валидация разработанного способа. Стероидные гормоны являются эндогенными соединениями, для них отсутствуют матрицы, не содержащие целевых аналитов, поэтому валидацию методики проводили на модельных растворах (дистиллированная вода), а также с использованием метода введено–найдено на реальных образцах с учетом критериев Food and Drug Administration (США) по валидации биоаналитических методик [15].

Градуировочные зависимости строили в диапазоне концентраций 0.05–50 нг/мл (0.05, 0.10, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5, 10, 25, 50 нг/мл). Предел обнаружения соответствовал концентрации, обнаруживаемой при соотношении сигнал/шум, равном 3, в то время как пределу определения соответствовала концентрация аналита, устанавливаемая с погрешностью 15%. Полученные результаты представлены в табл. 5.

Правильность и воспроизводимость контролировали путем анализа растворов контроля качества на трех уровнях концентраций: низком (1 нг/мл), среднем (5 нг/мл) и высоком (25 нг/мл) в течение одного и нескольких дней. Воспроизводимость оценивали с помощью относительного стандартного отклонения (s_r), а правильность с применением уравнения (1):

где e_r – относительная погрешность. Полученные результаты представлены в табл. 6.

Стабильность реальных образцов слюны, содержащих исследуемые аналиты, оценивали в течение месяца с проведением двух циклов заморозки (–20°C) и разморозки до комнатной температуры. Аналиты сохраняли стабильность в течение этого времени, поскольку полученные результаты отличались менее чем на 15% от первоначальных, что согласуется с результатами [10].

Стабильность растворов в автосамплере оценивали в течение 36 ч при 5°C. Результаты показали, что образцы остаются стабильными в данном временном диапазоне.

Возможность перекрестного загрязнения оценивали путем анализа холостого раствора после анализа образца с концентрацией стероидных гормонов 50 нг/мл. Установили, что на хроматограмме холостого образца отсутствуют пики с MRM-переходами, аналогичными целевым соединениям.

Анализ реальных образцов. Предложенный способ использовали для анализа реальных образцов, полученных от добровольцев. Перед проведением анализа образцы центрифугировали в течение 10 мин при 10000 об/мин. Анализ проводили методом введено–найдено путем добавления растворов контроля качества низкой (1 нг/мл), средней (5 нг/мл) и высокой (25 нг/мл) концентраций. Установили, что матричные компоненты существенно не влияют на получаемые результаты, поскольку погрешность определения составила <15%.

* * *

Таким образом, разработан и валидирован простой и чувствительный (пределы обнаружения в диапазоне 0.05–0.25 нг/мл) способ определения стероидных гормонов методом ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием в слюне человека. Возможность одновременного чувствительного определения стероидных гормонов различных классов делает слюну перспективной матрицей для диагностических целей, обладающей большим количеством преимуществ по сравнению с кровью.

Инновационный проект выполнен при финансовой поддержке Кубанского научного фонда в рамках Конкурса научно-инновационных проектов, ориентированных на коммерциализацию № НИП-20.1/4.