Журнал аналитической химии, 2022, T. 77, № 6, стр. 569-575

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Использовали кофе молотый (марка “Петр Великий”), кофе растворимый (марка “Ambassador”), кофе зеленый (арабика, Бразилия), чай мате (Pajarito, Парагвай), чай мате (Pipore, Аргентина), чаи из артишока (Lado Actiso, Вьетнам) и (Lado Herbal, Вьетнам), артишок консервированный (Santolino, Италия), Артишока экстракт (ЗАО “Эвалар”, Россия), приобретенные на рынке г. Белгорода и/или через сеть Интернет. Для градуировки отклика детектора использовали 5CQA (chlorogenic acid hemihydrate, Aldrich, США).

Для приготовления водных настоев сухие навески материала массой 0.50 ± 0.10 г заливали кипятком (50 мл) и выдерживали в течение 10 мин. Настой отделяли от твердого остатка фильтрованием через бумажный фильтр. Аликвотную порцию 10 мл (20 мл для напитка из артишока) очищали методом твердофазной экстракции на патронах ДИАПАК С18 (БиоХимМак СТ, Россия) после подкисления 1 М водным раствором HCl (10 об. %). Кислоты реэкстрагировали с патрона 2 мл смеси 30 об. % ацетонитрила и 30 об. % муравьиной кислоты в воде. Полученный раствор разбавляли водой в соотношении 1 : 2. Для экстракции кислот из артишока консервированный растительный материал обезжиривали н-гексаном, измельчали и навеску 1.00 ± 0.10 г переносили в 50 мл 0.1 М HCl и настаивали сутки. После фильтрования экстракт очищали твердофазной экстракцией, как указано выше.

Кофеоилхинные кислоты разделяли на хроматографе Agilent 1260 Infinity с диодно-матричным детектором с записью электронных спектров поглощения в диапазоне 250–450 нм. Хроматограммы записывали, хранили и обрабатывали, используя программное обеспечение Agilent ChemStation.

Для разделения использовали хроматографические колонки 4.6 × 250 мм Kromasil 100-5-C18 и 4.6 × 250 мм Gemini^® 5 мкм С6-Phenyl 110 Å.

Для определения кофеоилхинных кислот использовали колонку Kromasil 100-5-C18 и градиентный режим элюирования с подвижными фазами А (10 об. % ИП и 0.25 об. % фосфорной кислоты в воде) и Б (20 об. % ИП и 0.25 об. % фосфорной кислоты в воде), 1 мл/мин. Режим: 0–10 мин – 40% Б; 20 мин – 100% Б; 21–30 мин – 40% Б. Для градуировки отклика детектора использовали растворы 5CQA. Температура термостата колонки 30°С.

Для регистрации масс-спектров использовали жидкостной тандемный хроматомасс-спектрометр Shimadzu LCMS-8060 в отрицательном режиме сканирования в диапазоне масс 150–750.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При выборе состава подвижных фаз учитывали необходимость подкисления для стабилизации состояния ионизации кофеоилхинных кислот. Создавали рН ~ 1.9–2 добавлением ортофосфорной кислоты (0.25 об. %), что обеспечивает подавление диссоциации карбоксильной группы хинной кислоты [14] и не сильно выходит за рамки устойчивости к гидролизу традиционных обращенных фаз [15].

Разделение дикофеоилхинных кислот на фазе С18. В качестве стационарной фазы данного типа использовали хорошо зарекомендовавшую себя в наших исследованиях фазу Kromasil 110-5-C18, имеющую большую удельную поверхность (349 м²/г) и высокую степень покрытия поверхности силикагеля модификатором (3.45 мкмоль/м²) [16].

Подвижные фазы системы ацетонитрил–0.25 об. % H₃PO₄–вода. Карта разделения ДКХ-кислот в указанной элюентной системе представлена на рис. 1, а в табл. 1 приведены параметры уравнений относительного удерживания, в которых в качестве реперного соединения использована 5CQA:

Рис. 1.

Карта разделения ДКХ-кислот в элюентной системе ацетонитрил–0.25 об. % фосфорной кислоты–вода для стационарной фазы Kromasil 110-5-C18 при 30°С. Вещества: 1 – 1,3diCQA; 2 – 1,5diCQA; 3 – 3,4diCQA; 4 – 3,5diCQA; 5 – 4,5diCQA.

В этом уравнении параметр а₁ соответствует соотношению числа молей ацетонитрила, высвобождающегося при сорбции соответствующей дикофеоилхинной кислоты, к аналогичному числу молей при сорбции 5CQA. Действительно, по модели Мураками [17] при сорбции аналита А на стационарной фазе высвобождается n(A) моль органического модификатора М с концентрацией с (моль/л):

Аналогичное выражение может быть записано для вещества B, принятого в качестве вещества сравнения:

Исключая органический модификатор из уравнений (4) и (5), получаем:

Из представленных данных следует, что при сорбции четырех из пяти дикофеоилхинных кислот параметр а₁ > 1.5, что может свидетельствовать об одновременном участии обоих радикалов кофейной кислоты при сорбции молекулы дикофеоилхинной кислоты на поверхности обращенной фазы. Это согласуется с ранее высказанным предположением о том, что сорбция на поверхности привитой фазы является основным механизмом удерживания монокофеоилхинных кислот в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ [18]. Сорбционный механизм подтверждается и разделением изомерных ДКХ-кислот, что нехарактерно для распределительного механизма.

Неожиданно низкое относительное удерживание 1,3diCQA связано с особенностями строения этой кислоты, для которой по крайней мере в одной из конформаций наблюдается внутримолекулярная ассоциация с параллельным выстраиванием ароматических колец двух радикалов кофейной кислоты, приводящая вследствие π-взаимодействий к существенному отличию этого изомера от других по УФ-спектру (рис. 2).

Рис. 2.

УФ-спектры веществ, записанные в кювете детектора. Вещества: 1 – 3CQA; 2 – 4CQA; 3 – 5CQA; 4 – кофейная кислота; 5 – 1,3diCQA; 6 – 1,5diCQA; 7 – 3,4diCQA; 8 – 3,5diCQA; 9 – 4,5diCQA. Растворитель: 20 об. % пропанола-2, 0.25 об. % ортофосфорной кислоты в воде.

Рассматриваемая хроматографическая система удобна для определения ДКХ-кислот в кофе и мате, в которых отсутствуют изомеры, содержащие кофеоильный радикал в положении 1. Однако присутствие изомера 1,5diCQA делает эту систему не очень удобной из-за проблем в разделении 1,5diCQA и 3,5diCQA.

В настоящей работе отнесение ДКХ-кислот выполняли по порядку их удерживания (после подтверждения их состава методами УФ-спектроскопии и масс-спектроскопии) в соответствии с литературными данными (см. выше). При этом такое отнесение подтверждается хроматографическим методом – соотношением параметров а₁, согласующимся с параметрами а₁ линий трендов для МКХ-кислот, найденных в этой же системе:

При сохранении аддитивности параметр а₁ должен возрастать именно в ряду (табл. 1):

В таком случае при составах подвижных фаз, при которых фактор удерживания лежит в диапазоне от 2 до 10, порядок элюирования для соответствующих ДКХ-кислот остается неизменным и соответствует порядку (1). Тем не менее из-за разности наклонов линий трендов при уменьшении концентрации ацетонитрила в “медленных” элюентах произойдет инверсия времен удерживания в одной из пар diCQA:

И, наоборот, в подвижных фазах с большей элюирующей силой (с большей концентрацией ацетонитрила) возможна другая инверсия:

Иными словами наклон линий относительного удерживания является более информативным параметром по сравнению с порядком элюирования. При этом даже в указанных выше удобных подвижных фазах порядок элюирования пары 1,5diCQA и 3,5diCQA может изменяться, так как наклон линии тренда для 1,5diCQA больше, чем для 3,5diCQA.

Подвижные фазы системы изопропанол–0.25 об. % H₃PO₄–вода. В поисках “зеленых” растворителей для отказа от экологически неблагоприятного ацетонитрила заменили его на пропанол-2. Карта разделения, в которой указаны также две линии тренда из предыдущего рисунка, представлена на рис. 3, а параметры линий трендов – в табл. 1.

Рис. 3.

Карта разделения ДКХ-кислот в элюентной системе изопропанол–0.25 об. % фосфорной кислоты–вода для стационарной фазы Kromasil 110-5-C18 при 30°С. Вещества: 1 – 1,3diCQA; 2 – 1,5diCQA; 3 – 3,4diCQA; 4 – 3,5diCQA; 5 – 4,5diCQA. Звездочкой отмечены линии трендов с рис. 1.

Из полученных данных следует, что диапазон времен удерживания пяти изомерных ДКХ расширен по сравнению с предыдущей элюентной системой, а параметры а₁ оказались немногим больше, чем для элюентов на основе ацетонитрила, что также соответствует одновременной сорбции обеими заместителями кофейной кислоты. При этом заметно изменилась и селективность разделения изомерных ДКХ-кислот. Так, существуют диапазоны составов подвижной фазы, в которых полностью разделяются все пять изомеров за время, не превышающее 20 мин, т.е. такая замена ацетонитрила на ИП не только целесообразна с точки зрения экологии, но и улучшает селективность разделения пяти изомеров дикофеоилхинных кислот. Отметим, что 1,4diCQA по имеющимся у нас данным в природных объектах встречается очень редко, а в фундаментальной работе [19] по дифференциации всех шести синтетических ДКХ-кислот по данным масс-спектров высокого порядка хроматографическое поведение изомеров не рассматривали.

Гексилфенильная фаза (Geminy C6Phenyl, С6Ph). Как и в случае фазы С18, для фазы С6Ph вначале исследовали разделение изомеров в элюентах с ацетонитрилом в качестве органического модификатора, а затем ацетонитрил заменили пропанолом-2. Параметры линий трендов для обоих органических модификаторов подвижной фазы представлены в табл. 2.

Замена стационарных фаз представляла интерес, поскольку предполагалось, что π-взаимодействия фенильных групп привитой фазы с ароматическими кольцами радикалов коричной кислоты могут изменить селективность разделения изомерных ДКХ-кислот. Экспериментально установлено, что при одинаковой концентрации ацетонитрила в подвижной фазе удерживание изомерных ДКХ-кислот, действительно, несколько увеличивается при переходе от фазы С18 к фазе С6Ph. Однако значения параметров а₁ линий трендов при этом заметно меньше, поэтому в “медленных” элюентах и в элюентах, в которых ацетонитрил отсутствует, порядок удерживания обращается. Следовательно, суммарно прочность связи ДКХ-кислот с фазой С6Ph меньше, чем с фазой С18. Однако порядок удерживания 3,4-diCQA, 3,5-diCQA и 4.5-diCQA остается таким же, как и для стационарной фазы С18 при концентрации ацетонитрила в диапазоне 20–25 об. %, а пара изомеров 1,5-diCQA и 3,5-diCQA также остается проблемной для разделения. Все это указывает на отсутствие изменения селективности разделения при рассмотренных условиях.

Замена ацетонитрила как компонента, который может обеспечивать π–π-взаимодействие сорбатов с компонентом подвижной фазы, на алифатический спирт (ИП) должна была бы исключить такие взаимодействия и усилить роль в суммарном удерживании π–π-взаимодействий сорбатов в сорбированном на фенилгексильной фазе состоянии. Однако эта замена привела только к небольшому увеличению параметров а₁ (табл. 2), хотя и для всех изомерных ДКХ кислот. Следовательно, дисперсионные взаимодействия остаются главным типом взаимодействий сорбатов со стационарной фазой, определяющих их удерживание, поэтому и порядок элюирования изомерных ДКХ-кислот мало изменился при замене растворителей – только относительное удерживание 1,5diCQA существенно снизилось, создавая новую проблемную пару, но уже с 3,4diCQA.

Таким образом, наилучший вариант хроматографической системы – это традиционная фаза С18 с элюентами на основе ИП. Именно такой вариант использовали в дальнейшем для определения содержания МКХ- и ДКХ-кислот в настоях кофе, мате и артишока (последний напиток разработан во Вьетнаме и в настоящее время импортируется в Россию).

Определение МКХ- и ДКХ-кислот в напитках. Использовали градиентный режим, обеспечивающий хорошее отделения ДКХ-кислот от сопутствующих примесей (флавониодов) и сокращающий время полного анализа образца. Хроматограммы, полученные в таком режиме, представлены на рис. 4, а результаты определения кислот приведены в табл. 3.

Рис. 4.

Хроматограммы разделения кофеоилхинных кислот четырех напитков. Напитки из: А – зеленого кофе, Б – мате, В – экстракта консервированного артишока, Г – экстракта из препарата “Артишока экстракт” (ЗАО “Эвалар”, Россия). Колонка Kromasil 110-5-C18, градиентное элюирование (см. “Экспериментальную часть”). Вещества; 1 – 3CQA; 2 – 4CQA; 3 – 5CQA; 4 – 1,3diCQA; 5 – 3,4diCQA; 6 – 3,5diCQA; 7 – 1,5diCQA; 8 – 4,5diCQA.

Анализ показал, что во всех настоях кофе доля ДКХ-кислот от общего содержания кофеоилхинных кислот составила ~10% (по площадям пиков), а максимальное суммарное содержание кислот приходится на настой зеленого кофе. В случае мате доля ДКХ-кислот существенно больше – превышает 40%, что обеспечивает ценность этого напитка в связи с более высокой биодоступностью именно ДКХ-кислот. В обоих типах напитков основные дикофеоилхинные кислоты представлены набором 3,4diCQA, 3,5diCQA и 4,5diCQA. В напитке из артишока к основным ДКХ-кислотам присоединилась 1,5diCQA, но практически отсутствовал изомер 1,3diCQA, считающийся ценным биологически активным веществом, – единственная ДКХ-кислота, получившая специальное название – цинарин [20].

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-33-90031.