Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 4, стр. 441-445

Двухиндикаторный метод гибридизационного анализа НК служит способом, повышающим надежность молекулярно-генетических исследований. В этом методе анализируемая проба содержит маркер, флуоресцирующий в ближней ИК-области спектра, а олигонуклеотидный зонд, находящийся в ячейке, маркирован оптически-независимым красителем с максимумом флуоресценции на длине волны ~550 нм. Флуоресцентное маркирование олигонуклеотидных зондов позволит вычислять их концентрацию в ячейке биочипа и проводить корректировку сигналов в ячейках, в которых образовались совершенные и несовершенные дуплексы [1].

Нами предложена молекулярная конструкция (XIII) на основе индокарбоцианинового красителя (Cy3) и аминокислоты лизин, которая содержит активированную карбоксильную группу и защищенную алифатическую аминогруппу. Карбоксильная группа предложенной конструкции предназначена для связывания с олигонуклеотидным зондом, содержащим аминолинкер, а аминогруппа служит для иммобилизации флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда на полимерную подложку или в полисахаридную ячейку биочипа (рис. 1). Выбор полисульфированного индокарбоцианинового красителя (X) с реакционно-способной карбоксильной группой в положении 3 индоленинового фрагмента обусловлен его повышенной водорастворимостью, фотостабильностью и хемостойкостью, а также спектрально-люминесцентными характеристиками и требуемым оптическим диапазоном флуоресценции в области 550 нм. Кроме того, введение карбоксильного заместителя в положение 3 индоленинового фрагмента позволило синтезировать водорастворимый краситель с четырьмя симметрично-расположенными сульфогруппами, что привело к значительному увеличению квантового выхода флуоресценции по сравнению с коммерчески-доступным Су3, содержащим две сульфогруппы [2] (табл. 1).

Схема 1 . Схема синтеза N ^ε-тритиллизина. Условия: i – MeOH, AcCl, 20°C, 18 ч; ii – TrCl, Et₃N, CHCl₃, 20°C, 3 ч; iii – 5 М HCl, (CH₃)₂CO, t_кип, 1 ч; iv – 1 М NaOH, t_кип, 5 мин.

Нами осуществлен многостадийный синтез N^ε-тритиллизина (VI) из лизин гидрохлорида (II) (схема 1 ). Использование тритильной группы в качестве защитной группировки для ε-аминогруппы лизина предполагает проведение предварительной этерификации карбоксильной группы путем ее превращения в сложный эфир (III). Именно использование метилового эфира лизина помогает провести реакцию тритилирования по обеим аминогруппам молекулы, затем снять эту защиту с карбоксильной группы, не затронув остальные защитные группы. Метиловый эфир лизина (III) синтезировали с количественным выходом действием смеси метилового спирта и ацетилхлорида нагреванием при 40°C в течение 4 ч [3]. Дитритилирование гидрохлорида (III) проводили по стандартной методике действием хлороформного раствора тритилхлорида в присутствии триэтиламина [4, 5]. Селективное детритилирование α-аминогруппы лизина (IV) проводили действием 5 М соляной кислоты в ацетоне [5]. Последующий щелочной гидролиз метилового эфира (V) проводили действием 1 М водного раствора гидроксида натрия [5].

Нами предложен и осуществлен синтез полисульфированного индокарбоцианинового красителя (X), основанный на двухстадийной конденсации солей индолениния (VII), (IX) и N,N '-дифенилформамидина (VIII) в смеси уксусный ангидрид–уксусная кислота при добавлении в качестве конденсирующего агента безводного ацетата калия (схема 2 ) [6–8]. Молекулярную конструкцию (XI) получали реакцией конденсации красителя (X) и N^ε-тритиллизина (VI) с предварительной активацией карбоксильной группы красителя действием DSC в DMF. Использование конъюгата (XI) в виде его активированного эфира для флуоресцентного маркирования олигонуклеотидов не увенчалось успехом, скорее всего из-за возможного экранирования реакционного центра молекулы соседними с ним группами атомов. Для снижения пространственных затруднений в молекуле карбоксильную группу конъюгата (XI) дополнительно амидировали 6-аминокапроновой кислотой (XII).

Схема 2 . Схема синтеза молекулярной конструкции на основе полисульфированного индокарбоцианинового красителя и N^ε-тритиллизина. Условия: i – Ac₂O, AcOH, 118°C, 2 ч (1 стадия), Ac₂O, AcOH, AcOK, 118°C, 4 ч (2 стадия); ii – DSC, DMF, 20°C, 4 ч; iii – DSC, DMF, 20°C, 4 ч.

Для всех индокарбоцианиновых красителей (X), (XI), (XIII) найден молярный коэффициент поглощения (ε) и относительный квантовый выход флуоресценции (Φ) в метаноле и водном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) (10 мМ калий фосфатный буфер, 0.9% NaCl, рН 7.4) (табл. 1).

Рис. 1.

Строение флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда.

Конъюгат краситель – лизин (XIII) переводили в активную форму в виде пара-нитрофенилового эфира и конденсировали в водно-органической среде с олигонуклеотидными зондами, содержащими аминолинкер с С6-спейсером (рис. 1). Детритилирование ε-аминогруппы лизинового фрагмента красителя проводили нагреванием при 90°C в течение 45 мин натрий-цитратного буферного раствора (15 мM, pH 5.5) флуоресцентно-меченного олигонуклеотида. Строение промежуточных и целевых соединений подтверждено данными УФ-, ¹Н-ЯМР-спектроскопии и MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Полученные таким образом модифицированные олигонуклеотидные зонды (I) будут использованы для проведения нормировки гибридизационных сигналов на биочипах [9].