Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 4, стр. 392-402

ВВЕДЕНИЕ

Флуоресцентное мечение ДНК широко используется в молекулярно-биологических исследованиях и медицинской диагностике. Возможность введения метки непосредственно в процессе ферментативной реакции амплификации (ПЦР, реакция удлинения праймера и др.) значительно упрощает процедуру получения образцов для проведения анализа. Для этого применяются флуоресцентно-меченные производные трифосфатов дезоксинуклеозидов (fluor-dNTP), в которых флуорофор введен по азотистому основанию [1, 2]. Важную роль при ферментативном получении флуоресцентно-меченных ДНК играет не только выбор физико-химических характеристик используемых флуорофоров (хемостойкость и фотостабильность, молярный коэффициент поглощения и квантовые выходы флуоресценции), но и способность соответствующих fluor-dNTP выступать в качестве субстратов для ДНК-полимераз [3, 4].

Одним из наиболее распространенных нуклеотидов для введения модификаций, в том числе флуоресцентных меток, является 2'-дезоксиуридин [5]. В качестве полимераз для ферментативного синтеза меченых ДНК часто используются коммерчески доступные термостабильные полимеразы Taq (семейство A) и Vent (exo-) (семейство B) (КФ 2.7.7.7), способные воспринимать в качестве субстрата производные 5'-трифосфатов 2'-дезоксиуридина [6, 7].

В ряду меток для флуоресцентного маркирования ДНК выделяются пентаметиновые индоцианиновые (индодикарбоцианиновые) красители ряда Сy5, которые обладают яркой флуоресценцией в ближнем ИК-диапазоне, достаточно химически стабильны и светостойки [8, 9]. Индоцианиновые красители широко используются во многих молекулярно-биологических приложениях [10, 11]. Широкое применение флуоресцентно-меченных трифосфатов нуклеозидов в составе молекулярно-биологических систем диагностики делает крайне важным изучение их совместимости с полимеразами и эффективности в гибридизационном анализе.

Ранее нами обнаружена зависимость эффективности встраивания трех производных 5'-трифосфатов 2'-дезоксиуридина, флуоресцентно-меченных индодикарбоцианиновыми красителями, от суммарного электрического заряда маркера в ходе ПЦР короткого олигонуклеотида. Показано, что эффективность уменьшается в ряду: нейтрально заряженный, положительно заряженный и отрицательно заряженный красители [12, 13]. Несколько позже для оценки эффективности флуоресцентно-меченных трифосфатов мы использовали мультиплексную ПЦР с последующим гибридизационным анализом нуклеиновых кислот [14]. Возможность применения различных производных ряда индодикарбоцианиновых красителей для использования в гибридизационном анализе генетических мишеней ДНК человека исследована нами в работе [15], кинетика образования меченых ПЦР-продуктов для анализа человеческого генома в ПЦР в реальном времени с TaqMan-зондом определена в работе [16] для четырех коммерчески доступных Taq-полимераз.

В настоящей работе проведено комплексное изучение субстратной эффективности цвиттер-ионных fluor-dUTP в реакциях амплификации ДНК-полимеразами, не обладающими корректирующей экзонуклеазной активностью, включающее: а) исследование кинетики амплификации с определением эффективности ПЦР (Е), б) определение выхода продуктов реакции для каждого модифицированного производного, в) тестирование на биологических микрочипах для определения чувствительности и специфичности гибридизационного анализа. По совокупности полученных нами ранее данных [13, 14] в качестве флуорофоров выбраны два индодикарбоцианиновых красителя с нейтральным распределенным зарядом (цвиттер-ионы), каждый из которых связывался по С5-положению пиримидинового цикла с помощью линкеров различной длины. В качестве бактериальной генетической мишени для изучения субстратной эффективности fluor-dUTP выбран фрагмент гена rpoB возбудителя туберкулеза человека Mycobacterium tuberculosis длиной около 200 п.о.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Флуоресцентно-меченные дезоксиуридинтрифосфаты (рис. 1), содержащие в своей структуре цвиттер-ионные индодикарбоцианиновые красители, различающиеся спектрально-люминесцентными характеристиками, гидрофильностью и пространственной структурой флуорофора, объединены в две группы по количеству сульфогрупп на флуорофоре. Производные fluor-dUTP, содержащие краситель с четвертичной N-алкиламмониевой группой (обозначены, как соединения группы (II)) и N-сульфоалкильным заместителем (обозначены как соединения группы (III)), дополнительно упорядочены в два ряда в зависимости от длины линкера, отдаляющего флуорофор от пиримидинового основания. Два образованных ряда включали в себя шесть fluor-dUTP с двумя типами флуорофоров (II) и (III), связанных линкерами различной длины (а, б, в).

Рис. 1.

Строение флуоресцентно-меченных дезоксиуридинтрифосфатов.

Для изучения кинетики амплификации в присутствии модифицированных субстратов fluor-dUTP (II) или (III) проводили ПЦР в режиме реального времени с использованием Taq-ДНК-полимеразы (семейство А) и Vent (exo-)-ДНК-полимеразы (семейство B). В качестве контрольного образца сравнения использовали fluor-уридинтрифосфат (I), характеристики которого подробно представлены в работе [13]. Контрольный образец (I) содержит в своей структуре электронейтральный флуорофор с сульфогруппой в положении 5 индоленинового фрагмента; выбор электронейтрального контрольного образца продиктован удобством сравнения с электронейтральными исследуемыми образцами. Для выбора оптимальной концентрации fluor-dUTP проводили амплификацию (рис. 1), варьируя концентрацию от 0 до 48 мкМ. Рассчитывали эффективность амплификации (E) по углу наклона прямого участка S-образной кривой накопления сигнала [17, 18].

Степень ингибирования fluor-dUTP определяли на основании результатов ПЦР в режиме реального времени с использованием различных концентраций модифицированных нуклеозидтрифосфатов (II) и (III). Кривые накопления сигналов на примере соединения (IIIв) приведены на рис. 2. При концентрациях fluor-dUTP менее 4 мкМ ингибирующий эффект проявлялся как незначительный для всех исследованных образцов. При этом значения сигналов флуоресценции в последующем гибридизационном анализе полученных ПЦР-продуктов были выше фоновых сигналов в 2–4 раза, что недостаточно для проведения рутинного клинического анализа. При концентрациях fluor-dUTP, превышающих 16 мкМ, в случае Taq-полимеразы значительно возрастал ингибирующий эффект; при концентрации 48 мкМ наблюдалось полное ингибирование полимеразы. Vent (exo-)-ДНК-полимераза показала способность к эффективной амплификации в присутствии больших концентраций модифицированного субстрата (оптимум достигал 32 мкМ). Для корректного сравнения кинетики ПЦР для соединений двух исследуемых рядов fluor-dUTP в качестве рабочей концентрации выбрали 8 мкМ. Концентрация лимитировалась эффективностью амплификации с Taq-полимеразой. Проводили ПЦР в режиме реального времени при частичном замещении dTTP на каждый из fluor-dUTP (при их концентрации 8 мкМ) в трех повторах для каждого производного dUTP (II) и (III) (рис. 2). В каждом случае общая концентрация (dTTP + + mod-dUTP) составляла 200 мкМ. В качестве контрольного субстрата использовали немодифицированный (природный) dTTP в концентрации 200 мкМ.

Рис. 2.

ПЦР с Taq-полимеразой (а) и Vent (exo-)-полимеразой (б) в режиме реального времени и расчетные значения эффективности амплификации (Е) при концентрации fluor-dUTP, равной 8 мкМ.

Расчет эффективности амплификации E проводили по углу наклона прямого участка S-образной кривой накопления сигнала [17, 18]. Авторы работы [17] для определения эффективности ПЦР в режиме реального времени использовали два альтернативных метода: по последовательным разбавлениям образца с определением значения порогового цикла и по углу наклона прямого участка графика накопления, изображенного в логарифмическом масштабе. Данные, полученные методом последовательных разбавлений, который отличается большими требованиями к подготовке образцов и требует отдельных расчетов для каждого используемого разведения образца, хорошо коррелировали с данными метода расчета по углу наклона прямого участка S-образной кривой. Мы выбрали второй из протестированных методов, поскольку основным его преимуществом является непосредственное вычисление эффективности амплификации из отрезка прямой линии регрессии.

Выявлено влияние химической природы флуорофора в структуре fluor-dUTP на степень ингибирования ДНК-полимераз в ПЦР. В выбранных условиях оценки эффективности амплификации зависимость от длины линкера оказалась несущественной, в отличие от гибридизационного анализа (см. ниже), где этот фактор играл решающую роль для исследованных fluor-dUTP с электронейтральными индодикарбоцианиновыми красителями. Гораздо больший эффект в ПЦР определяла гидрофобность флуорофора. Так, ряд (IIa–в) показал воспроизводимо более высокую эффективность амплификации и более высокий выход целевого продукта по сравнению с рядом (IIIa–в) (табл. 1).

Для определения выхода продукта проводили три серии ПЦР для каждой из полимераз и для каждого fluor-dUTP без применения интеркалирующего красителя в процессе реакции. Количество циклов амплификации сокращали до 32 по сравнению с ПЦР в режиме реального времени, где применяли 40 циклов амплификации. Выход продукта оценивали по оптической плотности соответствующих полос в агарозном геле при окрашивании бромистым этидием (рис. 3) с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH, США); данные приведены в табл. 1.

Рис. 3.

Ингибирующий эффект при разных концентрациях fluor-dUTP в ПЦР-смеси с Taq-полимеразой (а) и Vent (exo-)-полимеразой (б) на примере соединения (IIIв).

Показано, что эффективность ПЦР и выход целевого продукта воспроизводимо больше для всех fluor-dUTP (II) и (III) по сравнению с контрольным образцом (I). При сравнении с природным dTTP эффективность амплификации была ниже для каждого из fluor-dUTP, что говорит об ингибировании полимераз, причем и в этом случае для контрольного образца (I) ингибирующий эффект был максимальным (табл. 1). Выход продукта хорошо коррелировал с рассчитанными значениями эффективности ПЦР. Для всех исследованных fluor-dUTP в группах (II) и (III) эффективность амплификации и выход целевого полноразмерного продукта были несколько выше в случае Vent (exo-)-полимеразы по сравнению с Taq-полимеразой.

Рис. 4.

Электрофореграммы, полученные в цифровом формате RAW с сохранением данных попиксельной интенсивности сигнала для измерения выхода полноразмерного продукта ПЦР с Taq-полимеразой (а) и Vent (exo-)-полимеразой (б): 4% агарозный гель, окрашивание бромистым этидием, 1 – маркер длин двухцепочечных ДНК GeneRuler 50bp (Thermo Scientific, США); 2 – dTTP; 3 – (I); 4 – (IIа); 5 – (IIб); 6 – (IIв); 7 – (IIIа); 8 – (IIIб); 9 – (IIIв); 10 – отрицательный контрольный образец.

Гибридизационный анализ проводили на биологических микрочипах коммерческой тест-системы “ТБ-Биочип”, рассчитанной на одновременную мультиплексную гибридизацию ПЦР-продуктов фрагментов пяти генов. Поскольку в данном случае мы гибридизовали лишь один продукт асимметричной ПЦР (фрагмент гена rpo B), то сигналы вычисляли лишь с участка чипа, соответствующего этому гену. Принципиальная схема данного участка чипа, а также пример гибридизационной картины приведены на рис. 5. Концентрацию гибридизуемых продуктов выравнивали с учетом полученных данных выхода продукта для каждого модифицированного производного рядов (II) и (III). Гибридизацию целевых продуктов в равных концентрацях проводили с целью избежать эффектов влияния концентрации продукта на эффективность гибридизации (интенсивность сигнала, отношение совершенных и несовершенных дуплексов). Величину гибридизационных сигналов совершенных дуплексов использовали в качестве непрямого фактора оценки степени встраивания метки в ПЦР-продукт в ходе амплификации при равных концентрациях гибридизуемого ПЦР-продукта (рис. 6). Отношение сигналов совершенных и несовершенных дуплексов применяли в качестве критерия специфичности встраивания модифицированных нуклеотидов в растущую цепь ДНК и возможных неспецифических взаимодействий групп-флуорофоров с компонентами чипа, ухудшающих специфичность гибридизационного анализа. Гибридизацию проводили в трех повторах для каждого флуоресцентно-меченного производного (II) и (III). Величину отношения совершенных и несовершенных дуплексов (дискриминационное отношение) также вычисляли по каждой вариабельной позиции и затем находили среднее значение по чипу (табл. 1).

Рис. 5.

Принципиальная схема участка чипа, содержащего зонды, комплементарные анализируемому фрагменту гена rpo B M. tuberculosis (сверху) и гибридизационная картина (негатив) ПЦР-продукта, полученного с помощью соединения (IIб) в качестве субстрата и референс-штамма дикого типа M. tuberculosis H37rv, не содержащего мутаций в данном регионе, в качестве матрицы для амплификации. На схеме черным цветом обозначены ячейки, соответствующие дикому типу M. tuberculosis (отсутствует устойчивость к рифампицину), серым цветом – мутантные варианты. Схема поделена на зоны в соответствии с аминокислотными заменами по отдельным позициям кодируемого белка. Анализ осуществляется путем сравнения интенсивности сигнала в ячейке, соответствующей дикому типу, с сигналами ячеек, соответствующих мутантным вариантам, для каждой индивидуальной зоны. Д.Т. – дикий тип, Мут. – мутация. Схема анализа гибридизационных сигналов подробно описана в публикациях [19, 20].

Рис. 6.

Диаграммы интенсивности флуоресцентных сигналов совершенных дуплексов чипа (чувствительность гибридизационного анализа). Сигнал дуплекса, образованного ПЦР-продуктом, содержащим нуклеотид (I) для Taq-полимеразы, нормирован на единицу.

При гибридизационном анализе на биочипах в ряду fluor-dUTP (III) полученная усредненная интенсивность флуоресцентных сигналов высокая и варьирует в незначительных пределах. Наличие четвертичной аммониевой группы в структуре fluor-dUTP (IIа) ухудшило эффективность встраивания по сравнению с контрольным образцом (I). Однако увеличение длины линкера привело к постепенному росту эффективности встраивания в ряду трифосфатов (IIа–в). Такая тенденция роста эффективности встраивания в зависимости от длины линкера прослеживается только в случае трифосфатов (IIа–в), содержащих в своей структуре нейтрально заряженный краситель с четвертичной аммониевой группой. В случае ряда (IIIа–в) увеличение длины линкера выше среднего значения практически не повлияло на интенсивность гибридизационных сигналов, что хорошо соответствует полученным ранее данным для мультиплексной гибридизации [14].

Следует отметить, что средний уровень гибридизационных сигналов для фрагмента чипа, соответствующего гену rpo B, несколько ниже средних сигналов, получаемых в случае мультиплексной гибридизации [14]. Это может быть обусловлено высоким процентным содержанием G⋅C-пар в исследуемом фрагменте, а также обнаруженной внутренней структуре типа “шпилька”, что несколько уменьшает общую интенсивность гибридизационного сигнала в условиях эксперимента.

При анализе отношения сигналов ячеек с совершенными и несовершенными дуплексами (дискриминационная способность тест-системы) корреляция данных для различных fluor-dUTP обусловлена скорее интенсивностью целевых сигналов и приводит при их низких значениях к низкому разрешению (низкой дискриминации). Во всех случаях, кроме соединения (IIа) для Vent (exo-)-полимеразы, дискриминация достаточна для надежной интерпретации гибридизационной картины при диагностическом применении чипа. В упомянутом же случае низкий уровень дискриминации обусловлен низким целевым сигналом и, соответственно, высоким отношением фонового сигнала к целевому.

Оценка степени встраивания флуоресцентно-меченных dUTP с помощью гибридизационного анализа показала отсутствие прямой зависимости включения метки от эффективности fluor-dUTP в ПЦР и от выхода целевого продукта. Флуоресцентно-меченные уридинтрифосфаты (II) и (III) показали различную эффективность в ПЦР и различный выход целевого продукта в зависимости от химического строения флуорофора, но не от длины линкера, т.е. по группам (II) и (III), но не в рядах а-б-в. При этом длина линкера оказывает гораздо большее влияние на субстратную эффективность, определяя степень встраивания меток. Наиболее ярко этот эффект наблюдался при увеличении длины линкера с так называемого “короткого” до “среднего” для флуорофора с четвертичной аммониевой группой (табл. 1).

Краситель, связанный по 5-положению пиримидинового основания, ориентирован в широкую бороздку двунитевых ДНК и не должен влиять на образование двойной спирали комплементарных цепей ДНК. Однако краситель с двумя сульфогруппами и четвертичной аммониевой группой имеет значительные геометрические размеры, которые, как мы предполагаем, стерически затрудняют работу ДНК-полимеразы. Увеличение длины линкера, соединяющего пиримидиновое основание с красителем, уменьшает стерические препятствия. Молекула моносульфированного красителя более компактна, и увеличение длины линкера, по-видимому, не приводит к уменьшению стерических препятствий и увеличению встраивания модифицированного нуклеотида в растущую de novo цепь ДНК.

При этом увеличение длины линкера увеличивает гидрофобность (липофильность) красителя и модифицированного нуклеотида в целом, увеличивает неспецифическое взаимодействие с ДНК и ДНК-полимеразой и уменьшает эффективность встраивания модифицированных нуклеотидов в растущую цепь ДНК. Поэтому, с ростом длины линкера наблюдается первоначальный рост эффективности встраивания модифицированных нуклеотидов, а затем эффективность начинает снижаться.

В условиях проведения эксперимента Vent (exo-)-полимераза показала несколько большие эффективность амплификации и выход продукта по сравнению с Taq-полимеразой для всех исследованных образцов флуоресцентно-меченных производных dUTP в широком диапазоне концентраций (0–48 мкМ). По эффективности амплификации при высоких концентрациях fluor-dUTP полимераза Vent (exo-) существенно превосходила Taq-полимеразу. По совокупности показателей чувствительности и специфичности при проведении гибридизации на биочипах (уровень сигнала и дискриминирующая способность) наиболее эффективными оказались электронейтральные производные со средней длиной линкера (IIб) и (IIIб).Таким образом, исследованные fluor-dUTP пригодны для введения метки в ПЦР-продукты с помощью Taq- и Vent (exo-)-ДНК-полимераз для последующего гибридизационного анализа.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе применяли следующие реагенты: немодифицированные трифосфаты дезоксинуклеозидов (dNTPs) (Thermo Scientific, США); полимеразы Taq (Thermo Scientific, США) и Vent (exo-) (New England Biolabs, США); флуоресцентный краситель для ПЦР EvaGreen (Biotium, США); бромид этидия (Хеликон, Россия) – для окрашивания агарозных электрофорезных гелей. В качестве маркера длин продуктов применяли GeneRuler 50 bp DNA Ladder (Thermo Scientific, США). Воду для приготовления растворов получали на установке Milli-Q (EMD Millipore, США). Для хроматографической очистки олигонуклеотидов применяли колонку BDS Hypersil C18 (Thermo Scientific, США). Остальные реактивы и растворители приобретены в компаниях “Sigma-Aldrich” (США), “Acros Organics” (Бельгия) и “Fluka” (США) и имели качество “reagent grade” или “biochemical grade”. В работе использованы полуавтоматические пипетки (Gilson, Франция), амплификатор PTC-220 (Bio-Rad, США), амплификатор для ПЦР в режиме реального времени IQ5 (BioRad, США), центрифуга-вортекс “Микроспин” FV-2400 (Biosan, Латвия), высокоскоростная центрифуга для микропробирок Frontier 5515 (Ohaus, США), система для горизонтального электрофореза (ООО “Хеликон”, Россия), транс-иллюминатор TCP-20.МС 254/312 нм (Vilber Lourmat, Франция), цифровой фотоаппарат EOS 500D (Canon, Япония) с оптическим фильтром SYBR photographic filter S7569 (Molecular Probes, США). Олигонуклеотиды синтезировали с помощью автоматического синтезатора ABI 394 DNA/RNA (Applied Biosystems, США). Измерение концентрации олигонуклеотидов и ДНК проводили с помощью спектрофотометра для микрообъемов NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США).

Свойства и синтез использованных в настоящей работе флуоресцентно-меченных трифосфатов дезоксиуридина описаны ранее [14].

ДНК-матрицы для исследований кинетики амплификации и субстратной эффективности флуоресцентно-меченных трифосфатов дезоксиуридина. Для определения эффективности амплификации использовали матрицу, полученную в результате проведения ПЦР фрагмента гена rpo B из деконтаминированной геномной ДНК Mycobacterium tuberculosis, штамм H37rv, и праймеры: прямой 105f (5'-CGTGGAGGCGATCACACCGCAGACGTTG-3') и обратный 293r (5'-AGTGAGACGGGTGCACGTCGCGGACCT-3'), впервые описанные в работе [19]. Полученный ПЦР-продукт очищали на спин-колонках (Bio-Rad, США), растворяли в деионизованной воде качества MQ и доводили концентрацию до 10⁴ копий/мкл. Ту же матрицу применяли в симметричной гнездовой ПЦР для определения выхода продуктов амплификации и в асимметричной гнездовой ПЦР для получения преимущественно одноцепочечных продуктов для гибридизационного анализа.

Эффективность амплификации с помощью ПЦР в режиме реального времени. Для определения кинетики амплификации по накоплению флуоресцентного сигнала EvaGreen для каждого флуоресцентно-меченного трифосфата дезоксиуридина проводили ПЦР в режиме реального времени на приборе BioRad IQ5. Использовали праймеры: прямой 1272f (5'-CGCCGCGATCAAGGAGTTCT-3') и обратный 1398r (5'-TCACGTGACAGACCGCCGGG-3') [19]. Использовали Taq- и Vent (exo-)-ДНК-полимеразы, количество которых в реакционную смесь брали согласно рекомендациям производителя. Реакционная смесь содержала природные дезоксинуклеозидтрифосфаты dATP, dCTP, dGTP в концентрации 200 мкM каждый, а также флуоресцентно-меченный дезоксиуридинтрифосфат (I)–(III), в концентрации от 0 до 48 мкМ для изучения ингибирующего эффекта и 8 мкМ для определения кинетики и выхода продукта ПЦР. Суммарную концентрацию каждого нуклеозидтрифосфата (I)–(III) и природного dTTP доводили до 200 мкM с помощью 2 мМ раствора природного dTTP.

Температурно-временной профиль ПЦР состоял из предварительной денатурации при 95°С в течение 3 мин, за которой следовали 40 циклов: 95°С (денатурация ДНК) в течение 30 с, 64°С (отжиг праймеров) в течение 30 с, 72°С (достройка праймеров) в течение 30 с и далее завершающая инкубация при 72°С в течение 5 мин.

Эффективность реакции определяли по углу наклона прямого участка S-образной кривой накопления ДНК, представленной в логарифмическом масштабе. Использовали следующую формулу для расчета эффективности: Е = 10^tg α, где E – эффективность амплификации (динамический показатель накопления флуоресцентного сигнала), tg α – тангенс угла наклона линейного участка кривой накопления флуоресцентного сигнала.

Выход продуктов амплификации. Для определения количества наработанного ПЦР-продукта проводили ПЦР по симметричному типу для получения двухцепочечной ДНК. Температурно-временной режим аналогичен примененному для ПЦР в реальном времени, за исключением количества циклов амплификации, которое составляло 32 цикла. Полученные ПЦР-продукты разделяли в 4% агарозном геле, количество продукта оценивали по оптической плотности соответствующих полос в дорожках геля с использованием программы ImageJ (NIH, США).

ПЦР с флуоресцентно-меченными трифосфатами дезоксиуридина (I)–(III) для последующего проведения гибридизации на биочипах. Для подготовки образцов для гибридизации проводили асимметричную гнездовую ПЦР (с внутренними праймерами 1272f и 1398r) [19, 20] в соотношении 10/1. Использованное соотношение праймеров позволяет получать преимущественно одноцепочечный продукт для последующей гибридизации с иммобилизованными зондами биочипа. В качестве матрицы использовали более длинный фрагмент, полученный с помощью праймеров 105f и 293r. Получение матрицы для асимметричной ПЦР представлено выше. Соотношение компонентов реакции (кроме соотношения праймеров) и концентрация нуклеозидтрифосфата (I)–(III) (8 мкМ) – как в случае определения кинетики ПЦР, но без интеркалирующего красителя EvaGreen. Температурно-временной режим аналогичен примененному для ПЦР в реальном времени, за исключением количества циклов амплификации, которое составляло 32 цикла. Полученный ПЦР-продукт при необходимости разбавляли деионизованной водой качества MQ для выравнивания концентраций ПЦР-продуктов с учетом данных определения выхода продуктов по электрофорезу – для последующего проведения гибридизационного анализа.

Гибридизация на биологических микрочипах. Гибридизацию продуктов ПЦР осуществляли на чипах, входящих в состав коммерческой тест-системы “ТБ-Биочип”. Гибридизационная смесь состояла из гибридизационного буфера (20 мкл, 1.5 М гуанидинтиоцианат, 75 мМ буфер HEPES рН 7.5, 7.5 мМ EDТА) и реакционной смеси (10 мкл) после проведения асимметричной ПЦР и определения выхода целевого продукта. Полученную смесь перемешивали на встряхивателе типа “вортекс” и центрифугировали в течение 10 с при 1000 g. Полученную гибридизационную смесь (30 мкл) вносили в одно из отверстий реакционной камеры биочипа. Гибридизацию проводили при 37°C в течение 10–12 ч. По окончании гибридизации биочип трижды промывали дистиллированной водой при 37°C, снимали гибридизационную камеру и высушивали биочип в потоке воздуха.

Регистрация результатов гибридизации. Регистрацию флуоресцентного изображения микрочипа выполняли на универсальном аппаратно-программном комплексе (УАПК) (ООО “БИОЧИП-ИМБ”, Россия) для анализа биологических микрочипов с использованием специализированного программного обеспечения ImageWare® (ООО “БИОЧИП-ИМБ”, Россия).

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 14-14-01090-П.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований и с использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.