Биоорганическая химия, 2020, T. 46, № 1, стр. 65-76

ВВЕДЕНИЕ

Грамотрицательные альфа-протеобактерии рода Azospirillum из семейства Rhodospirillaceae являются типичными представителями ризосферы диких и культивируемых злаков [1]. На сегодняшний день род Azospirillum включает 21 вид, большинство из которых способны увеличивать урожайность растений, оказывая множественное воздействие на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях [2]. Рост-стимулирующий потенциал азоспирилл реализуется посредством продукции фитогормонов, улучшения минерального питания, фиксации атмосферного азота, снижения биотических и абиотических стрессов, биоконтроля патогенов и других механизмов [3, 4].

В начальные этапы формирования растительно-микробных ассоциаций с участием азоспирилл вовлечены гликополимеры бактериальной поверхности – капсульные полисахариды и липополисахариды (ЛПС) [5]. Стимулирующий эффект, оказываемый азоспириллами на растения, является весомой причиной для изучения молекулярного механизма ассоциативного взаимодействия и требует детального изучения структуры ЛПС.

ЛПС состоит из трех химически, биологически и биосинтетически различающихся компонентов, ковалентно связанных друг с другом: липида А, корового олигосахарида и О-специфического полисахарида (ОПС). ОПС является вариабельным доменом ЛПС; многообразие его возможных структур обусловлено природой, количеством, типом связей и конфигурацией моносахаридных остатков, образующих повторяющиеся звенья, а также наличием заместителей неуглеводной природы [6]. Липиду А, напротив, присуща общая консервативность строения в пределах бактериального рода при наличии микрогетерогенности, обусловленной разнообразием остатков – вторичных – жирных кислот (ЖК), ацилирующих ЖК, связанные с сахаром, степенью ацилирования и фосфорилирования. Гетерогенность строения липида А может быть связана со многими факторами, в том числе адаптацией бактерий к изменяющимся условиям среды, степенью завершенности биосинтеза и частичной модификацией препарата во время выделения [7].

Считается, что многие фундаментальные свойства бактерий определяются условиями экологической ниши, в которой они обитают. Известно, что азоспириллы хорошо адаптируются к условиям существования, обладают высокой конкурентоспособностью и не имеют строгой специфичности к растению-хозяину [8]. Кроме того, в последнее время описаны “неризосферные” виды, способные заселять нехарактерные для азоспирилл ниши. Из отработанного дорожного покрытия выделен представитель нового вида A. picis [9], из сульфидного источника – A. thiophilum [10], из пресной воды – A. griseum [11], из ферментированных молочных продуктов – A. ramasamyi [12], из микробной топливной ячейки – A. humicireducens [13]. Культура A. rugosum была выделена из загрязненных нефтью почв [14]. Активность в утилизации нефти в качестве источника углерода и энергии, возрастающая в присутствии малата, одного из компонентов корневых экссудатов растений, была отмечена и для ряда ризосферных штаммов A. brasilense и A. lipoferum [15], что делает их перспективными агентами для инокуляции при фиторемедиации загрязненных нефтью почв.

В последние годы установлены структуры OПС для 50 ризосферных штаммов A. brasilense, A. lipoferum [16], A. halopraeferens [17], A. fermentarium [18] и A. dobereinerae [19]. Данные о строении липида А азоспирилл в основном ограничены составом жирных кислот, а полная структура была опубликована для единственного штамма A. lipoferum SpBr17 [20].

В настоящей работе приводятся сведения о строении О-специфического полисахарида и липида А типового штамма ранее не изученной в этом отношении бактерии A. rugosum DSM-19657.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Из сухой биомассы бактерий A. rugosum DSM-19657 водно-фенольной экстракцией был выделен ЛПС, в результате деградации которого в мягких кислых условиях были получены ОПС и липид А. Моносахаридный анализ ОПС в виде ацетатов полиолов методом ГЖХ выявил наличие Rha, Glc, GlcN и Fuc3N в соотношении ~4.9 : 2.4 : 1.4 : 1 (отклик детектора). Анализ продуктов полного гидролиза ОПС методом ГЖХ в виде ацетилированных (S)-2-октигликозидов позволил установить D-конфигурацию Glc и GlcN и L-конфигурацию Rha.

¹³C-ЯМР-спектр ОПС (рис. 1) содержал сигналы различной интенсивности, свидетельствующие о нерегулярности строения полимера. В спектре присутствовали сигналы нескольких аномерных углеродов при δ 98.2–105.6 м.д., двух HOCH₂-групп остатков Glc и GlcNAc при δ 61.9 и 62.2 м.д., двух углеродов, связанных с азотом (C2 GlcNAc и C3 Fuc3NAc) при δ 52.3 и 56.8 м.д., нескольких CH₃–C-групп (отвечающих C6-атомам остатков Fuc3NAc и Rha) при δ 16.6 и 17.4–18.0 м.д., других углеродов моносахаридных колец при δ 67.6–83.1 м.д., двух N-ацетильных групп (CH₃ при δ 23.3 и 23.5 м.д., CO при δ 175.1 и 175.6 м.д.). Отсутствие сигналов в диапазоне δ 83–88 м.д., характеристичных для фуранозидов, свидетельствовало о том, что все моносахариды в составе ОПС являются пиранозидами. Соответственно, в ¹H-ЯМР-спектре ОПС присутствовали сигналы нескольких аномерных протонов при δ 4.76–5.37 м.д., ряда CH₃–C-групп (H6 Rha и Fuc3NAc) при δ 1.23–1.32 м.д., другие протоны моносахаридных колец при δ 3.43–4.50 м.д., двух N-ацетильных групп при δ 2.06 м.д. Учитывая схожесть моносахаридного состава ОПС A. rugosum с составом ОПС A. brasilense Jm125A2, установленным нами ранее [21], мы провели сравнение 1D- и 2D-ЯМР-спектров ОПС этих штаммов. В результате сравнения была выявлена практически полная идентичность мажорных серий сигналов в спектрах, что свидетельствовало об идентичности повторяющихся звеньев ОПС. На основании этих данных сигналы в спектрах ¹H- и ¹³С-ЯМР были отнесены с использованием ¹H,¹H COSY, TOCSY, ROESY, и ¹H,¹³С HSQC-экспериментов (табл. 1).

Рис. 1.

¹³С-ЯМР-спектры ОПС A. rugosum DSM-19657 (вверху) и A. brasilense Jm125A2 (внизу). Арабские цифры относятся к атомам углерода в моносахаридных остатках, обозначенных в табл. 1 и в тексте.

Таким образом, ОПС A. rugosum состоит из повторяющихся звеньев двух типов, идентичных по структуре A. brasilense Jm125A2:

В составе липида А методом ГЖХ метиловых эфиров жирных кислот (ЖК) были выявлены преобладающие 14:0 (3-OH)-, 16:0 (3-OH)- и 18:1-кислоты, на долю которых приходилось более 85% от суммы идентифицированных ЖК. Также были обнаружены 16:0- (11%), 16:1- (2%) и 19:0- (1%) кислоты. Природа О-связанных жирных кислот была установлена с применением мягкого щелочного гидролиза в 12.5% NH₄OH, в условиях которого эфирные ацильные и ацилоксиацильные группы менее устойчивы, по сравнению с ациламидными и ацилоксиациламидными [22]. В результате О-дезацилирования наблюдалось снижение содержания ЖК 14:0 (3-OH) по отношению к другим кислотам, что свидетельствовало о эфирном типе связи этой первичной кислоты, а вторичные кислоты ацилируют амидосвязанную ЖК 16:0 (3-OH). Методом ГЖХ ацетилированных метилгликозидов в составе липида А были идентифицированы GlcN и GalA в соотношении ~2 : 1. Полученные данные указывали на сходство строения липида А A. rugosum и A. lipoferum SpBr17 [20], для последнего продемонстрировано наличие трисахаридного остова следующей структуры: GlcpN(1→6)GlcpN(1↔1)GalpA, в котором оба остатка GlcpN ацилированы кислотой 16:0 (3-OH) в положении 2 и кислотой 14:0 (3-OH) в положениях 3 и 3', а остатки вторичных кислот этерифицируют первичную ЖК 16:0 (3-OH) в положении 2'. Учитывая консервативность строения липида А в пределах бактериального рода, мы приняли, что сахарный остов липида А A. rugosum идентичен таковому A. lipoferum.

МАЛДИ-масс-спектр отрицательных ионов липида А, записанный в режиме рефлектрона, содержал несколько групп сигналов депротонированных молекул [M – H]^– в диапазоне m/z 1023.7–1756.1, отличающихся природой и количеством остатков жирных кислот (рис. 2). В спектре присутствовали три обособленные группы пиков с наиболее интенсивными сигналами в каждой группе при m/z 1287.9, 1514.0 и 1740.1 (рис. 3), которые соответствовали три-, тетра- и пентаацильным типам молекул, содержащих остаток GalA и два остатка GlcN, ацилированных кислотами 16:0 (3-OH), 14:0 (3-OH) и 18:1 (табл. 2). Разница в массах 26 и 16 Да между сигналами в группах была обусловлена различной длиной вторичных жирных кислот и соответствовала наличию идентифицированных ГЖХ-анализом остатков насыщенных кислот 16:0 и 19:0 вместо ненасыщенной 18:1 (табл. 2). Разница между наиболее интенсивными сигналами пента-, тетра- и триацильных типов составляла 226 Да, что соответствовало одному остатку первичной кислоты 14:0 (3OH). Сигнал при m/z 1023.7, отличающийся на 264 Да от наиболее интенсивного сигнала триацильного липида А, соответствовал диацильному типу, несущему только остатки 16:0 (3-OH) и лишенному остатка вторичной кислоты 18:1. Отсутствие в спектре сигналов с разницей 80 Да свидетельствовало об отсутствии фосфорилирования липида А.

Рис. 2.

МАЛДИ-масс-спектры липида А A. rugosum, записанные в режиме детектирования отрицательных (вверху) и положительных (внизу) ионов.

Рис. 3.

МАЛДИ-МС/МС иона с m/z 1514.0 липида А A. rugosum.

МАЛДИ-масс-спектр положительных ионов липида А, записанный в режиме рефлектрона, содержал соответствующие сигналы натриевых аддуктов [M + Na]⁺ и [M – H + 2Na] ⁺ для три-, тетра- и пентаацильных типов липида А в диапазоне m/z 1285.8–1802.2 (рис. 2, табл. 2).

Для подтверждения строения липида А и доказательства положения вторичных кислот были записаны МС/МС-спектры наиболее интенсивных сигналов в режиме детектирования положительных и отрицательных ионов. Спектры второго порядка [M – H]-иона с m/z 1514.0 (рис. 3) подтверждали предполагаемое строение липида А и содержали сигналы осколочных ионов, указывающие на последовательное элиминирование остатков 14:0(3-OH)- и 18:1-ЖК. Отщепление вторичной кислоты 18:1 происходило в виде нейтральной молекулы, так как в спектре присутствовали только сигналы с характеристичной разницей масс 282 Да, но не наблюдалось таковых, возникающих в ходе отщепления кетена и альдегида с разницами масс 264 и 222 Да, соответственно [23].

Элиминирование остатка ЖК 14:0(3-OH) происходило различными путями, о чем свидетельствовало присутствие в спектре сигналов с разницей 244, 226 и 184 Да. Максимальная разница масс 244 Да соответствовала отщеплению кислоты в виде нейтральной молекулы, отличие в 226 Да отвечало потере кетена, а 184 Да – альдегида, протекающему через перегруппировку МакЛафферти. Хотя последний тип фрагментации наиболее часто упоминается для N-связанных ЖК [24, 25], он отмечен и для ЖК-остатков, связанных сложноэфирной связью [26].

В средней области МС/МС-спектра [M – H]^–-иона с m/z 1514.0 наблюдались сигналы при m/z 987.8, 1005.6 и 1047.7 (рис. 3), соответствующие отщеплению одного ацильного остатка 18:1 и одного остатка 14:0(3-OH) от родительского иона (–(282 + 244), –(282 + 226), –(282 + 184) Да, соответственно). Образование промежуточного продукта фрагментации с m/z 742.3 происходило в результате потери родительским ионом с m/z 1514.0 остатка 18:1 в виде нейтральной молекулы (–282 Да) с образованием осколка с m/z 1232.0 и его последующей диссоциации по пути ^0.2A₂ (здесь и далее используется номенклатура фрагментации углеводов Домон и Кастелло [27]). Диацильный фрагмент с m/z 742.3 (рис. 3) в ходе дальнейшего расщепления теряет остаток 14:0(3-OH) в виде нейтральной ЖК (–244 Да) с образованием иона при m/z 498.3.

Последовательное отщепление остатка N-связанной ЖК 16:0(3-OH) в виде кетена и воды от осколка с m/z 1005.6 приводило к образованию фрагмента с m/z 731.7. В результате дегидратации последнего происходило образование иона при m/z 713.7, а его фрагментация по пути ^0,4A₂ приводила к возникновению осколка с m/z 456.2, отщепление гликольальдегида (–60 Да) от которого, предположительно, приводило к образованию иона, детектируемого при m/z 396.2. В области низкомолекулярных продуктов МС/МС-спектра также присутствовали ионы [M – H]^– депротонированных молекул 14:0(3-OH)- и 18:1-ЖК при m/z 243.3 и 281.2 соответственно.

Предполагаемые структуры и пути фрагментации [M – H]^–-иона с m/z 1514.1 липида А A. rugosum в МС/МС-спектрах приведены на рис. 4. МС/МС-спектр иона [M – H]^– при m/z 1287.9 содержал характеристичные осколки при m/z 1005.6, 731.7, 456.2, образование которых происходило по аналогии с приведенной схемой.

Рис. 4.

Предполагаемые структуры и пути фрагментации [M – H]-иона липида А с m/z 1514.0. Структуры изображены в виде нейтральных молекул.

Таким образом, были отнесены наиболее интенсивные сигналы в МС/МС-спектре [M – H]^–-ионов. Следует отметить, что представленная на рисунке схема фрагментации [M – H]^–-иона тетраацильного липида А при m/z 1514.0, в котором 14:0(3-OH) находится в положении 3 проксимального остатка GlcN будет также справедлива и для липида А, в котором ЖК 14:0(3-OH) замещает положение 3 дистального кольца GlcN. В то же время, о положении вторичной кислоты 18:1, ацилирующей 16:0(3-OH) дистального звена GlcN, однозначно свидетельствовало наличие иона [^0.4A₂-H]^– при m/z 456.2, поскольку фрагментация альтернативного по структуре иона, в котором ЖК 18:1 связана с 16:0(3-OH)-кислотой проксимального GlcN, не приводила бы к образованию осколков, наблюдаемых в МС/МС-спектрах.

МС/МС-спектр иона [M + Na]⁺ при m/z 1738.2 (рис. 5), соответствующего пентаацильному типу липида А, несущего по два остатка 14:0(3-OH) и 16:0(3-OH), а также один остаток 16:0, содержал характеристичные сигналы осколков, образующихся в результате последовательного отщепления GalA по путям С₂ и B₂ [27] с разницей масс 176 и 194 Да соответственно, остатка 14:0(3-OH) в виде кислоты или кетена (–244 или –226 Да), остатка 16:0 (–256 Да) и фрагмента 16:0(3-OH) в виде альдегида (–212 Да) в диапазоне m/z 605.0–1562.1. Серия наиболее интенсивных сигналов осколочных ионов, получающихся в ходе данного пути фрагментации, присутствовали в рассматриваемом спектре в диапазоне m/z 1073.5–1562.1 и соответствовали потере одного, двух или трех вышеуказанных фрагментов. Менее интенсивные сигналы [M + Na]⁺ при m/z 817.4, 831.2 и 861.3 соответствовали отщеплению четырех фрагментов, а ион при m/z 605.0 отвечал элиминированию GalA, двух остатков 14:0(3-OH), а также по одному остатку 16:0(3-OH) и 16:0 от родительского иона.

Рис. 5.

МАЛДИ-МС/МС иона при m/z 1738.2 липида А A. rugosum.

В средней области МС/МС-спектра присутствовали интенсивные сигналы осколка [^0,4A₂ + Na]⁺ при m/z 962.4, дальнейшая фрагментация которого сопровождалась последовательным элиминированием остатков 16:0 и 14:0(3-OH) с образованием осколка с m/z 461.8. МС/МС-спектр также содержал менее интенсивный сигнал иона при m/z 902.5, соответствующего продукту B₁ фрагментации по гликозидной связи. В результате отрыва от этого фрагмента остатков 14:0(3-OH) (–226 и –244 Да) и 16:0 (–256 Да) наблюдалось образование ионов [M + Na]⁺ при m/z 646.2, 658.2 и 676.2 соответственно (рис. 6).

Рис. 6.

Предполагаемые структуры и пути фрагментации [M + Na]⁺-иона при m/z 1738.2. Структуры изображены в виде натриевых аддуктов нейтральных молекул.

На основании комплексного анализа химического состава и МАЛДИ-масс-спектров была установлена структура липида А A. rugosum (рис. 7), который представляет собой смесь молекул пента-, тетра- и триацильных типов, отличающихся друг от друга количеством остатков первичной О-связанной 14:0(3-OH). Микрогетерогенность в пределах каждого из типов липида А с разной степенью ацилирования, обусловлена природой вторичных жирных кислот, ацилирующих остаток N-связанной 16:0(3-OH) кольца дистального GlcN. Анализ масс-спектров второго порядка при установлении структуры липида А A. rugosum продемонстрировал распределение вторичных жирных кислот, аналогичное таковому для A. lipoferum SpBr17, предложенному ранее на основе данных масс-спектрометрии первого порядка. Отличительной особенностью липида А A. rugosum является присутствие остатков вторичной ЖК 19:0, не идентифицированной в липиде А штамма SpBr17.

Рис. 7.

Структура липида А A. rugosum.

Таким образом, на основании данных химического анализа, спектроскопии ЯМР и МАЛДИ-масс-спектрометрии для типового штамма нового вида бактерий A. rugosum было установлено сходство строения ОПС и липида А с таковыми компонентами изученных ранее видов A. brasilense и A. lipoferum. Межвидовая распространенность близких по строению повторяющихся звеньев ОПС продемонстрирована ранее и для других представителей рода Azospirillum [15] и может свидетельствовать об отсутствии видовой приуроченности в отношении структуры этих традиционно вариабельных компонентов ЛПС, которая, скорее всего, определяется особенностями экологической ниши обитания. Сходство строения липида А A. rugosum и A. lipoferum позволяет предположить наличие близкородственных структур у других представителей данного рода.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культивирование бактерий. Штамм Azospirillum rugosum DSM-19657 (IBPPM 629) предоставлен Коллекцией ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН (г. Саратов). Культивирование бактерий проводили в жидкой малатно-солевой среде с витаминами [28] до окончания экспоненциальной фазы роста при температуре 30°С и перемешивании на вибростенде. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 0.15 М растворе NaCl и смывали с поверхности капсульный материал механическим перемешиванием в течение 5 сут с ежедневной сменой отмывающего раствора.

Выделение ЛПС, ОПС и липида А. ЛПС выделяли из высушенных ацетоном бескапсульных клеток горячим 45% водным раствором фенола без разделения слоев [29]. Примеси белков осаждали из раствора ЛПС добавлением 40% CCl₃CO₂H до конечного значения рН 2.7. Деградацию ЛПС проводили 2% CН₃CO₂H при 100°С в течение 4 ч. Осадок липида А отделяли центрифугированием, промывали водой и трижды обрабатывали смесью CHCl₃ : CH₃OH : H₂O (10 : 10 : 9, v/v) [30]. Супернатант, содержащий ОПС, разделяли гель-хроматографией на колонке с Toyopearl TSK HW-50 (Toyosoda, Япония) в 1% AcOH, контролируя элюцию с помощью дифференциального проточного рефрактометра Knauer (Германия). Фракцию высокомолекулярного О-специфического полисахарида концентрировали и лиофилизовали.

О-Дезацилированние ЛПС проводили в 12.5% NH₄OH при 37°С в течение 16 ч. Модифицированный ЛПС выделяли гель-фильтрацией на колонке с Toyopearl TSK HW-40 (Toyosoda, Япония) в 1% AcOH.

Моносахаридный анализ. Анализ моносахаридного состава и абсолютных конфигураций сахаров проводили методом ГЖХ ацетатов полиолов [31], ацетилированных метилгликозидов и ацетилированных 2-(S)-октилгликозидов [32] на хроматографе Hewlett-Packard 7820А с капиллярной колонкой HP-5 (Hewlett-Packard, США). Градиент температуры от 160°C (1 мин) до 290°C, скорость нагрева 7°C/мин.

Состав жирных кислот. Состав жирных кислот ЛПС в виде метиловых эфиров жирных кислот определяли с помощью ГЖХ на хроматографе GС-2010 (Shimadzu, Япония), снабженном колонкой DB-5 (Agilent, США). Метилирование выполняли методом, описанным в работе [33].

ЯМР-спектроскопия. Спектры ЯМР записывали на спектрометре DRX-700 (“Bruker”, Германия) в растворе 99.96% D₂O при 30°С (внутренний стандарт – ацетон, δ_C 31.45, и 3-триметилсилилпропаноат-d₄, δ_H 0.0. Образцы предварительно лиофилизовали дважды из 99.9% D₂O. Двумерные спектры записывали с использованием стандартного математического обеспечения (компании “Bruker”, Германия); для сбора и обработки данных использовали программу TOPSPIN 2.1. В экспериментах TOCSY и NOESY время смешивания составляло 150 и 200 мс соответственно.

МАЛДИ-масс-спектрометрия. К 1 мкл раствора липида А (1 мг/мл) добавляли 3 мкл раствора 2,5-дигидроксиацетофенона (10 мг/мл, CH₃CN : H₂O, 1 : 1 по объему), 1 мкл полученной смеси точечно наносили на стандартные планшеты для МАЛДИ и высушивали на воздухе. Масс-спектрометрию осуществляли на времяпролетном МАЛДИ-масс-спектрометре Autoflex speed компании “Bruker Daltonics” (Германия), снабженном азотным лазером (337 нм), в режиме рефлектрона с использованием программного обеспечения FlexControl (версия 3.4; Bruker Daltonics). Спектры записывали в режиме детектирования положительных и отрицательных ионов. МС/МС-спектры записывали в режиме диссоциации, индуцированной соударениями (CID). Для внешней калибровки масс использовали смесь сульфатированных олигосахаридов [34]. Обработку полученных результатов проводили с использованием программного обеспечения Flexanalysis (версия 3.4; Bruker Daltonics). МС-спектры получали аккумуляцией 1500 выстрелов лазера, МС/МС-спектры – 6000–7000 выстрелов при минимальной энергии лазера, требующейся для ионизации образца.