Биоорганическая химия, 2020, T. 46, № 3, стр. 280-285

ВВЕДЕНИЕ

Bacillus cereus способен вызывать пищевые отравления и раневые инфекции чаще у людей с ослабленным иммунитетом и является одной из распространенных причин внутрибольничных инфекций. Секретируемые бактерией токсины, образуют наноразмерные поры в клеточных мембранах, что приводит к утечке клеточных компонентов. Одним из факторов вирулентности условно-патогенного микроорганизма B. cereus является порообразующий токсин гемолизин II (HlyII) [1]. Цитолитическая активность гемолизина II была изучена в клеточных культурах, эритроцитах [2], плоских бислойных мембранах [3], гепатоцитах мыши [4], а также дафниях [5] и харовых водорослях [6]. В зрелом состоянии этот токсин является гомологом α-токсина Staphylococcus aureus с 38%-ной идентичностью на уровне аминокислот [1]. HlyII по сравнению с α-токсином S. aureus имеет С-концевое удлинение из 94 аминокислотных остатков, обозначаемых как CTD (С-терминальный домен) [1, 7]. Делеционный вариант HlyII, лишенный CTD, обладает в 8 раз меньшей гемолитической активностью на эритроцитах кролика по сравнению с интактным HlyII [7]. Механизм, согласно которому этот домен влияет на активность HlyII, неизвестен. При поиске белков (BLAST), имеющих аминокислотную гомологию с С-концевым доменом, обнаружен лишь один участок плазмидной локализации у Bacillus anthracis, который является фрагментом гена с неизвестной функцией. Фрагмент, соответствующий остаткам 337–410 в HlyII, обнаружен в плазмиде XO1 (ID последовательности: AJH43116.1, 29.73% идентичности последовательности гипотетического белка AW20_5667 B. anthracis str. Sterne) [8]. Этот факт может указывать на возможность горизонтального переноса генетической информации и его селективного закрепления в составе гемолизина [9]. Наличие С-концевой избыточности ранее описано для некоторых порообразующих белков Vibrio species. Характерные домены с лектин-подобной пространственной структурой, связывают гликановые рецепторы на поверхности клеток-мишеней [10, 11]. Подобное расположение CTD в молекуле HlyII B. cereus позволяет предположить его важность при связывании с мембранами клеток инфицированного организма для обеспечения локального повышения концентрации токсина, обеспечивающего образование препоры. Однако, отсутствие гомологии аминокислотной последовательности в С-концевых доменах токсинов B. cereus и V. species [12] не позволяет предположить, что С-концевой домен HlyII функционирует по аналогичному механизму.

Данная работа посвящена, получению МА к CTD, и выяснению с их помощью возможной роли CTD во взаимодействии с эритроцитами кролика.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение моноклональных антител к CTD. Для получения МА в качестве антигена был использован рекомбинантный препарат CTD. При создании генетической конструкции вспомогательный His-tag был размещен на С-конце молекулы, предполагая, что данная последовательность не будет влиять на функции белкового домена. В работе [9] показано, что пространственная структура CTD уникальна для пороформирующих токсинов и состоит из нескольких β-тяжей, организованных в бочкоподобную структуру с α‑спиралями внутри. C-концевые аминокислоты молекулы CTD не участвует в формировании общей структуры домена. Эта модель была получена с помощью ЯМР мутантной формы CTD, в которой пролин в 405 положении заменен на метионин. Такая замена обеспечила существование только транс-изомера CTD, что позволило создать его пространственную модель.

При иммунизации CTD возникли проблемы. Длительная иммунизация животных CTD не приводила к развитию значимого иммунного ответа, только одна особь из 4 экспериментальных групп после девятой иммунизации (группа № 2) демонстрировала высокое содержание специфических антител в сыворотке крови – около 1/1 000 000. Титр остальных при этом составлял не более 1/32 000. Титры сывороток иммунных мышей определяли методом непрямого тИФА на планшетах с иммобилизованным CTD. Высокий титр свидетельствовал о формировании достаточного пула плазматических клеток для получения гибридомных клеточных линий, стабильно продуцирующих МА, как in vitro, так и in vivo. Спленоциты особи, демонстрирующей высокий уровень специфических антител в сыворотке крови, были использованы в качестве источника лимфоцитов для получения гибридом, секретирующих МА против CTD, по методу Келлера и Мильштейна [13]. Отбор гибридом, секретирующих специфичные антитела, проводили непрямым тИФА по взаимодействию надклеточных супернатантов с иммобилизованным на иммунопланшеты CTD. Отобраны 27 гибридом, которые были дважды клонированы методом лимитирующих разведений. По результатам оценки пролиферативной активности и стабильности продукции антител было отобрано 24 стабильных гибридомных клона, секретирующих МА против CTD. Все полученные антитела содержали в своем составе легкую цепь κ (каппа), 22 принадлежали к классу G, подклассу 1, тяжелая цепь HlyIIС‑18 и HlyIIС‑40–IgG2b. В иммуноблоттинге все МА взаимодействовали как с CTD, так и с интактным HlyII (рис. 1).

Рис. 1.

Взаимодействие МА против CTD с HlyII–His₆ в иммуноблоттинге. Над треками указаны названия МА. Левый трек – стандарты молекулярных масс.

Взаимодействие CTD с эритроцитами. Несмотря на то, что в настоящее время нет информации о возможной функции CTD, логично предположить наличие способности взаимодействовать с прокариотическими клетками. МА были использованы для подтверждения этого предположения. Эксперимент проводили с использованием в качестве модели эритроцитов кролика. Взаимодействие CTD с эритроцитами определяли в составе иммунных комплексов CTD-МА-bio, схема эксперимента представлена на рис. 2. В качестве отрицательного контроля использовали не иммунные иммуноглобулины мыши биотинилированные так же, как и МА. Для эксперимента использовали биотинилированные МА: HlyIIС‑15, HlyIIС‑16, HlyIIС‑23, HlyIIС‑30, HlyIIС‑34, HlyIIС‑37. Иммунные комплексы (CTD-МА-bio) добавляли к суспензии эритроцитов. После часовой инкубации либо при 20°С, либо при 37°С эритроциты трижды отмывали избытком PBS, содержащим 5% бычьей сыворотки для удаления возможного неспецифического взаимодействия CTD с эритроцитами. Комплексы эритроцитов со связавшимися иммунными комплексами разрушали обработкой 0.1 М Gly HCl, pH 2.5. После удаления дебриса центрифугированием супернатанты нейтрализовали 1 М Трис-HCl, pH 8.0. Наличие антител в супернатантах свидетельствовало о взаимодействии CTD в составе иммунных комплексов с эритроцитами. Антитела в супернатантах выявляли методом тИФА по взаимодействию с иммобилизованными на иммунопланшеты антителами кролика против иммуноглобулинов мыши. Биотинилированные антитела детектировали стрептавидин-пероксидазой. Полученные результаты представлены в виде диаграммы на рис. 3. В лизатах эритроцитов выявлялись МА HlyIIС‑16 и HlyIIС‑23, следовательно, иммунные комплексы CTD c этими антителами связывались с эритроцитами, а сами антитела не препятствовали связыванию CTD с эритроцитами. Относительное содержание HlyIIС‑23 было на 48% ниже, чем HlyIIС‑16, что может указывать на взаимодействие с неидентичными эпитопами. Взаимодействие CTD с мембранами эритроцитов носило температурно-зависимый характер. При комнатной температуре содержание антител в супернатантах падало на 29%, по сравнению с данными, полученными после инкубации при 37°С, что свидетельствовало о более низкой эффективности взаимодействия CTD с эритроцитами при понижении температуры. МА HlyIIС‑15, HlyIIС‑30, HlyIIС‑34 и HlyIIС‑37 не детектировались в супернатантах. Этот результат позволяет предположить, что их эпитопы на поверхности белка расположены таким образом, что эти МА в составе иммунных комплексов не позволяют CTD взаимодействовать с эритроцитами. Взаимодействие CTD с эритроцитами наблюдали только при использовании определенных антител (HlyIIС‑16 и HlyIIС‑23), эпитопы которых на молекуле домена не влияли на его связывание с клетками. Этот факт указывает на то, что взаимодействие CTD ориентировано относительно поверхности эритроцита.

Рис. 2.

Взаимодействие CTD с кроличьими эритроцитами, тИФА. Схема эксперимента.

Рис. 3.

Относительное содержание биотинилированных МА против CTD в лизатах эритроцитов после взаимодействия иммунных комплексов CTD-МА с мембранами эритроцитов. Результаты представлены за вычетом фоновых значений в присутствии биотинилированных нормальных иммуноглобулинов мыши.

Таким образом, экспериментально доказано, что CTD способен взаимодействовать с эритроцитами, и это явление не связано со случайным налипанием CTD на поверхность эритроцитов. Использование биотинилированых антител к CTD позволило заключить, что гемолизин II обладает дополнительной функциональной активностью – адгезией к поверхности эукариотических клеток, а сам CTD играет существенную роль в этом процессе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Штаммы, плазмиды и ферменты. E. coli BL21 (DE3) (Novagen, Германия) была использована для трансформации pET29b(+) (Novagen, Германия). Эндонуклеазы рестрикции KpnI и NdeI (Thermo Scientific, Waltham, MA США), T4-DNA лигаза (NEB, США), белковые маркеры (Abcam, Англия) и ДНК электрофорезные маркеры (Fermentas, Литва), TaqSE-ДНК полимераза, (SibEnzyme, Россия), dNTP смесь (Thermo Scientific, Waltham, MA США). Encyclo-ДНК полимераза (Evrogen, Россия). Эндотоксин экстрактор (Силекс, Россия). Конъюгат антител козла с пероксидазой хрена (Thermo Scientific, США). Конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена (Thermo Scientific, США). Тотальную ДНК Bacillus cereus ATCC 14579 использовали в качестве матрицы.

Экспрессия и очистка CTD His₆. ПЦР-продукт, кодирующий CTD был клонирован с использованием вектора pET29b (+) по сайтам NdeI и KpnI. Все конструкции были подтверждены секвенированием ДНК. Последовательность ДНК, кодирующая CTD, была амплифицирована с помощью праймеров:

CTD_KpnI_Rev: 5'-TTAGGTACCGATCTGTTTAATCTCGATA

CTD_NdeI_For: 5'-TTACATATGGATAACCAAAAAGCCCTT.

Используемые гены и праймеры были произведены коммерчески (Евроген, Россия). Аминокислотная последовательность CTD-His₆ состояла из C-концевой избыточности HlyII, тромбинового сайта, шести остатков гистидина и линкера. Экспрессию CTD-His₆E. coli BL21 (DE3) индуцировали при достижении культурой оптической плотности при 600 нм 0.5–0.6, добавляя изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид до конечной концентрации 1 мМ при 37°C. Далее проводили культивирование с аэрацией в течение 3 часов. Очистку CTD проводили согласно [14]. Концентрации белков определяли согласно [15].

Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ. Антиген CTD сорбировали в течение ночи при 4°C из концентрации 1 мкг/мл в 0.05 М карбонатном буфере (рН 9.6) на поверхность лунок планшетов для ИФА (Costar, США). Перед нанесением образцов свободные центры связывания пластика блокировали 30 мин 1% (w/v) раствором желатина в PBST, инкубацию антител с антигеном проводили 1 ч при 37°C. Добавляли конъюгат антител козла против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена в PBST, в разведении согласно инструкции производителя. После каждой стадии планшеты отмывали PBST не менее 6 раз. В качестве субстрата пероксидазы использовали 4 мМ раствор орто-фенилендиамина (Sigma, США) в цитрат-фосфатном буфере (26 мМ лимонная кислота, 50 мМ Na₂HPO₄, рН 5.0), содержащем 0.003% (v/v) Н₂О₂. После развития окраски реакцию останавливали добавлением равного объема 10% (v/v) серной кислоты и определяли оптическое поглощение при 490 нм с помощью фотометра iMark для микропланшетов, BioRad. Значение оптического поглощения в лунках без добавления специфических антител, соответствующее неспецифическому связыванию конъюгата с иммобилизованным антигеном (отрицательный контроль) вычитали из оптического поглощения в экспериментальной лунке.

Получение моноклональных антител к CTD. 4 группы по 5 мышей линии ВALB/c иммунизировали интраперитонеально. Первую иммунизацию проводили в полном адъюванте Фрейнда (Sigma, США), последующие – в неполном адъюванте, интервал между инъекциями составлял 2 недели. Дозы инъекции составляли: в первой группе 15 мкг/одно животное, во второй – 45, в третьей – 95, в четвертой – 45 с предварительной обработкой антигена 0.25% глутаровым альдегидом. Гибридизацию спленоцитов мыши и миеломы SP2/0 проводили с помощью полиэтиленгликоля по методу Келлера и Мильштейна [13].

Наработка и выделение моноклональных антител. МА выделяли аффинной хроматографией на белок А сефарозе [16] из культуральных жидкостей гибридом, секретирующих МА.

Изотипирование антител. Определение типов тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов проводили методом тИФА с помощью набора для изотипирования иммуноглобулинов мыши “Rapid ELISA mouse mAb Isotyping Kit” (Termo scientific, США) согласно инструкции производителя.

Конъюгирование антител с биотином. Антитела биотинилировали, используя раствор N-гидроксисукцинимидного эфира биотина (Sigma, США) в диметилсульфоксиде с концентрацией 1 мг/мл. Эфир биотина добавляли с 20 кратным молярным избытком. Смесь инкубировали 4 часа при комнатной температуре. Для удаления непрореагировавшего реагента смесь диализовали против PBS в течение ночи. Определение активности биотинилированных МА проводили методом непрямого тИФА по взаимодействию с иммобилизованным на пластик антигеном. Реакцию проявляли стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена в разведении согласно инструкции производителя. Для визуализации реакции также использовали орто-фенилендиамин.

Иммуноблоттинг. Электрофоретическое разделение белков проводили в 12% полиакриламидном геле в присутствии β-меркаптоэтанола и SDS по методу Лэммли [17] в камере типа Bio-Rad MiniProtean Tetra System (Bio-Rad, США). В качестве маркеров молекулярной массы использовали “Prism Ultra Protein Ladder” (3.5–245 кДа). Электрофорез в концентрирующем геле проводили при силе тока 20 мА, в разделяющем – 100 мА. Для получения иммуноэлектрофореграммы содержимое геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond ECL RPN 203D (GE Healthcare, Швеция).

Взаимодействие CTD с эритроцитами, тИФА. CTD инкубировали в концентрации 0.4 мкМ с 0.13 мкМ каждого из биотинилированных МА и биотинилированных не иммунных IgG мыши в присутствии 5% бычьей сыворотки, в PBS. Инкубацию проводили либо в течение двух часов при комнатной температуре, либо 1 час при 37°С. К реакционным смесям добавляли эритроциты до концентрации 1% (v/v), инкубировали 1 час либо при 37°С, либо при комнатной температуре. Далее эритроциты трижды отмывали PBS, содержащим 5% бычьей сыворотки, центрифугируя 2500 об./мин в течение 4 минут. Осадки эритроцитов лизировали 100 мкл 0.1 М Gly HCl, pH 2.5 в течение 5 минут при перемешивании, затем центрифугировали 10 000 об./мин в течение 5 мин. Супернатанты отбирали и нейтрализовали 7.5 мкл 1 М Трис-HCl, pH 8.0. рН контролировали универсальной индикаторной бумагой, в каждый из них вносили Tween 20 до концентрации 0.1%. Супернатанты вносили в лунки планшета для ИФА с предварительно иммобилизованными антителами кролика против иммуноглобулинов мыши из концентрации 8 мкг/мл. Далее реакцию проводили также как и тИФА. Связавшиеся антитела выявляли добавлением стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена, в разведении согласно инструкции производителя.