1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биоорганическая химия
  4. T. 47, № 3, 2021

Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 3, стр. 413-416

Лабильность стационарных и времяразрешенных оптических свойств конформационно фиксированного производного хромофора СFP

А. М. Богданов 1, Д. А. Горбачев 1, Э. Р. Зайцева 1, 2, А. Ю. Смирнов 1, Н. С. Балеева 1, *, М. С. Баранов 1, 3

1 ФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН
117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Россия

2 Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева
125047 Москва, Миусская площадь, 9, Россия

3 Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова
117997 Москва, ул. Островитянова, 1, Россия

* E-mail: nsbaleeva@gmail.com

Поступила в редакцию 16.09.2020
После доработки 26.09.2020
Принята к публикации 29.09.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Изучено сольватохромное поведение модельного соединения, имитирующего хромофор цианового флуоресцентного белка (CFP), в спектральном и временном доменах. Анализ времяразрешенного флуоресцентного сигнала, проведенный в 40 растворителях, принадлежащих к различным классам, показал, что липофильное окружение способствует увеличению, а ароматические растворители и третичные амины – уменьшению времени жизни флуоресценции этого соединения. На основании проведенного исследования сделаны предположения о возможностях рационального дизайна CFP-подобных белков.

Ключевые слова: имидазолоны, хромофоры, циановый флуоресцентный белок, CFP, оптические свойства

Традиционные методы флуоресцентной визуализации опираются на детекцию и анализ сигнала в спектральном домене, где основной характеристикой служит длина волны. Поскольку полосы поглощения и испускания большинства флуорофоров имеют заметную ширину, такой подход позволяет проводить раздельную детекцию флуоресцентного сигнала лишь в 3–5 спектральных каналах одновременно. Альтернативным подходом к разделению флуоресцентных сигналов становится их детекция во временном домене, где отдельные фотоны регистрируются относительно момента возбуждения флуоресценции. Этот принцип позволяет в одном спектральном канале визуализировать несколько маркеров, контрастных по времени жизни флуоресценции. На сегодняшний день методы времяразрешенной флуоресцентной визуализации (FLIM и схожие) находят все большее применение в области биомедицинских исследований.

Флуоресцентные белки (ФБ) выступают одной из важнейших меток в биологической флуоресцентной микроскопии и уже более 20 лет используются для многоцветного мечения. В то же время поведение ФБ во временном домене изучено менее подробно. Как правило, время жизни флуоресценции ФБ жестко привязано к величине квантового выхода флуоресценции (КВФ) и в пределах спектральной группы ФБ варьирует достаточно слабо, однако существует ряд исключений из этого правила – выявлены белки с увеличенным [1–5] или укороченным [6] временем жизни. В этих случаях увеличение или уменьшение времени жизни не приводит к пропорциональному изменению величины КВФ, что свидетельствует о том, что взаимосвязь этих характеристик может различаться не только для химически отличающихся хромофоров, но и для идентичного хромофора в разном белковом окружении [7]. Таким образом, открываются возможности для дизайна ярких ФБ, имеющих одинаковый хромофор, но различающихся по времени жизни флуоресценции. На данный момент не существует модели, достоверно предсказывающей время жизни флуоресценции флуорофоров в зависимости от их окружения, а поиск новых ФБ с разными временами жизни с помощью случайного мутагенеза представляется достаточно трудоемким. В связи с этим перспективным представляется изучение поведения модельных веществ, имитирующих строение хромофоров ФБ, в различных средах, в свою очередь, моделирующих ближайшее аминокислотное окружение хромофора в составе белка.

В настоящей работе мы изучили влияние среды на оптические характеристики модельного хромофора белка CFP (соединение (I), схема 1 , табл. 1) и выявили ряд закономерностей. В использованную выборку растворителей вошли различные полярные протонные и апротонные вещества, вещества различной степени гидрофобности и вязкости, а также ароматические соединения, фторированные производные и различные амины. В большинстве случаев время жизни флуоресценции колебалось в области 5.0–5.7 нс и практически не зависело от полярности растворителя. Заметное отличие наблюдалось в ряду различных ароматических растворителей (производных бензола), у которых эта величина снижалась на 0.5–1.0 нс. Еще ниже она оказывалась в различных аминах (до 1.5 нс), а в сильно липофильных средах фторированных растворителей наблюдался ее рост (>6 нс). Также мы показали, что для данного хромофора нет прямой корреляции между КВФ и временем жизни. Так, наибольшие значения КВФ наблюдались для вышеупомянутых ароматических растворителей, в которых время жизни флуоресценции было сравнительно коротким. Значительное падение одновременно КВФ и среднего времени жизни флуоресценции наблюдалось в аминах, однако в этом случае кинетика затухания флуоресценции описывалась биэкспоненциальной моделью, что, как мы предполагаем, связано с наличием отдельного процесса гашения флуоресценции, например, за счет переноса электрона от растворителя [8]. Неожиданным наблюдением стало очень слабое влияние вязкости на оптические свойства – в ряду различных спиртов характеристики оказались схожими.

Таблица 1.  

Оптические свойства модельного соединения (I) в различных растворителях

Растворитель Время жизни флуоресценции, нс Максимум поглощения, нм Коэффициент экстинкции Максимум эмиссии, нм КВФ, %
Вода 5.55 476 26 000 520 59
Ацетонитрил 5.71 460 25 000 507 68
Этилацетат 5.28 468 27 000 504 64
Диэтиловый эфир 5.50 475 29 500 501 88
Диметилацетамид 5.13 470 27 000 510 63
Диоксан 5.15 472 26 000 502 65
Метилэтилкетон 5.32 469 26 000 509 59
Циклогексанон 5.16 470 24 500 514 64
NMP 5.07 468 27 000 510 41
Диметилсульфооксид 5.08 479 29 500 512 62
Уксусная кислота 5.61 479 28 000 515 66
Октан 5.70 Плохо растворим
Метанол 5.64 475 29 000 512 54
Этанол 5.51 482 29 000 516 66
Пропанол-1 5.46 486 29 000 514 62
Бутанол-1 5.41 486 27 500 515 70
Гексанол-1 5.40 487 29 000 515 75
Деканол-1 5.46 488 28 500 515 69
Додеканол-1 5.38 489 24 500 512 72
Изоамиловый спирт 5.47 489 27 500 512 71
Изопропанол 5.53 485 29 500 507 69
Бутанол-2 5.37 484 29 000 514 65
Октанол-2 5.40 489 29 500 507 74
Третбутанол 5.52 486 31 500 515 64
Хлороформ 5.48 481 29 000 514 74
Дихлорэтан 5.44 472 28 500 508 71
Дихлорметан 5.51 474 30 000 509 80
Триэтиламин 1.44 485 24 000 504 11
TMEDA 1.62 478 28 000 504 10
N-Этилморфолин 3.21 479 27 000 510 30
Трифторэтанол 6.43 478 28 000 519 60
Перфторбензол 6.34 470 22 000 505 61
Фтортолуол 6.63 474 25 500 505 61
Фторацетон 5.65 484 28 000 530 35
Тетрафторпропан 5.92 476 24 500 519 59
Октафторпентанол 6.04 473 28 000 519 61
Дихлорбензол 4.95 482 26 500 510 76
Хлорбензол 4.89 480 28 500 509 74
Бензол 4.73 480 28 500 504 75
Толуол 4.74 480 28 500 502 78
Пиридин 4.70 478 27 000 515 66

Примечание: NMP – N-метилпирролидон, TMEDA – тетраметилэтилендиамин.

Схема 1 . Хромофор белка CFP и модельное соединение (I).

Среди аминокислотных остатков близкого хромофорного окружения флуоресцентных белков семейства CFP можно выделить Arg96, Gln183, Tyr/Ala145, His/Asp148, Thr203, Glu222 [1, 9]. Первые два остатка консервативны и вовлечены в созревание хромофора [10], остатки в положениях 145 и 148 фиксируют планарную конформацию хромофора [9], а остатки в положениях 203 и 222 могут рассматриваться как потенциальные мишени для мутагенеза при создании в хромофорном окружении условий, аналогичных исследованным в настоящей работе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Спектры поглощения в УФ- и видимом диапазоне регистрировали на спектрофотометре Cary 100 Bio (Varian, США), спектры флуоресценции – на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian, США).

(Z)-4-((2-(Дифторборил)-1H-индол-3-ил)метилен)-1,2-диметил-1H-имидазол-5(4H)-он (I) синтезировали по методике, предложенной ранее [11].

Измерение времени жизни флуоресценции производили на специально сконструированной для съемки макрообъектов установке, основанной на fdFLIM-системе LIFA (Lambert Instruments, Нидерланды). Для возбуждения флуоресценции использовали импульсный источник модулированного излучения из набора Multi-LED (Lambert Instruments, Нидерланды; λ = 471 нм, частота повторения импульсов 20 МГц). Для детекции сигнала использовали камеру Toggel (Lambert Instruments, Нидерланды) с присоединенным к ней светосильным фотообъективом 50–100/1.8 (Sigma, Япония), снабженным эмиссионным фильтром HQ510lp (Chroma, США). Калибровку системы производили с помощью калибровочного образца “зеленая акриловая пластина” (τ = 4.2 нс) из набора FSK5 (Thorlabs, США). Настройку параметров детекции и математическую обработку данных производили с помощью программы LIFA Tau Software 1.2.0 (Lambert Instruments, Нидерланды).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Перспективной модификацией белка CFP служит введение липофильных остатков (например, Leu, Ile в положения 203 и 222 полипептидной цепи) в белковое окружение хромофора для увеличения времени жизни флуоресценции или ароматических и амин-содержащих остатков (например, Trp или Phe в положение 203 и Lys в положение 222 полипептидной цепи) для его снижения.

Список литературы

  1. Goedhart J., Stetten D., Noirclerc-Savoye M., Lelimousin M., Joosen L., Hink M.A., van Weeren L., Gadella T.W.J., Royant A. // Nat. Commun. 2012. V. 3. P. 751–755. https://doi.org/10.1038/ncomms1738

  2. Sarkisyan K.S., Goryashchenko A.S., Lidsky P.V., Gorbachev D.A., Bozhanova N.G., Gorokhovatsky A.Y., Pereverzeva A.R., Ryumina A.P., Zherdeva V.V., Savitsky A.P., Solntsev K.M., Bommarius A.S., Sharonov G.V., Lindquist J.R., Drobizhev M., Hughes T.E., Rebane A., Lukyanov K.A., Mishin A.S. // Biophys. J. 2015. V. 109. P. 380–389. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.06.018

  3. Bindels D.S., Haarbosch L., van Weeren L., Postma M., Wiese K.E., Mastop M., Aumonier S., Gotthard G., Royant A., Hink M.A., Gadella T.W.J. // Nat. Methods. 2017. V. 14. P. 53–56. https://doi.org/10.1038/nmeth.4074

  4. Matela G., Gao P., Guigas G., Eckert A., Nienhaus K., Nienhaus G. // Chem. Commun. 2017. V. 53. P. 979–982. https://doi.org/10.1039/C6CC09081H

  5. Piatkevich K.D., Malashkevich V.N., Morozova K.S., Nemkovich N.A., Almo S.C., Verkhusha V.V. // Sci. Rep. 2013. V. 3. P. 1847. https://doi.org/10.1038/srep01847

  6. Mamontova A.V., Solovyev I.D., Savitsky A.P., Shakhov A.M., Lukyanov K.A., Bogdanov A.M. // Sci. Rep. 2018. V. 8. P. 13224. https://doi.org/10.1038/s41598-018-31687-w

  7. Плетнева Н.В., Горячева Е.А., Артемьев И.В., Архипова С.Ф., Плетнев В.З. // Биоорг. химия. 2019. Т. 45. С. 339–347. [Pletneva N.V., Goryacheva E.A., Artemyev I.V., Arkhipova S.F., Pletnev V.Z. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2019. V. 45. P. 187–194]. https://doi.org/10.1134/S0132342319030047

  8. Inada T.N., Kikuchi K., Takahashi Y., Ikeda H., Miyashi T. // J. Photochem. Photobiol. A. 2000. V. 137. P. 93–97. https://doi.org/10.1016/S1010-6030(00)00352-X

  9. Malo G.D., Pouwels L.J., Wang M., Weichsel A., Montfort W.R., Rizzo M.A., Piston D.W., Wachter R.M. // Biochemistry. 2007. V. 46. P. 9865–9873. https://doi.org/10.1021/bi602664c

  10. Wood T.I., Barondeau D.P., Hitomi C., Kassmann C.J., Tainer J.A., Getzoff E.D. // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 16211–16220. https://doi.org/10.1021/bi051388j

  11. Baleeva N.S., Tsarkova A.S., Baranov M.S. // Tet. Lett. 2016. V. 57. P. 3043–3045. https://doi.org/10.1016/j.tetlet.2016.06.006

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биоорганическая химия

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал