Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 5, стр. 539-554

ВВЕДЕНИЕ

Злокачественные новообразования – одна из основных причин смертности в России и мире. Эффективность противоопухолевой терапии остается недостаточно высокой [1] по причине незначительной селективности соединений, развития лекарственной устойчивости опухолевых клеток [2, 3], повышенной гидрофобности [4, 5] и низкой эффективности доставки препаратов в опухоль [6, 7], серьезных побочных эффектов и др. [8, 9]. С целью решения вышеперечисленных проблем актуальной задачей является оптимизация структуры химических соединений – кандидатов в лекарственные средства. В настоящем обзоре анализируются химические классы синтетических липидов – перспективных соединений, не получивших требуемое внимание исследователей.

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ СВОЙСТВА ЛИПИДОВ

Исследования противоопухолевых свойств липидов начались во второй половине ХХ века, когда обнаружили, что небольшие количества природного фосфолипида 2-лизофосфатидилхолина (соединение (I), рис. 1) существенно увеличивают фагоцитарную активность макрофагов [10]. Это означало, что соединение (I) может играть активную роль в механизмах защиты организма. Однако фосфолипид (I) нестабилен и быстро трансформируется в фосфатидилхолин (II) или глицерофосфохолин (III) под действием ацетилтрансферазы или лизофосфолипазы, что не позволило использовать соединение (I) как лекарственное средство [11].

Рис. 1.

Превращение 2-лизофосфатидилхолина (I) в фосфатидилхолин (II) или глицерофосфохолин (III).

Установление структуры фактора активации тромбоцитов (PAF, соединение (IV), рис. 2) стало важным шагом для поиска новых противоопухолевых соединений. В эндотелиальных клетках соединение (IV) индуцирует подвижность, экспрессию молекул адгезии, способствует разрушению внеклеточного матрикса, миграции клеток и неоангиогенезу [12]. Активация рецепторов PAF индуцирует антиапоптотические факторы, способствуя выживанию опухолевых клеток [13, 14]. Предполагают, что сочетание антагонистов PAF-рецепторов с химиотерапией может быть перспективным для терапии опухолей [15]. Немало соединений липидной природы имеют структурную схожесть с соединением (IV), что объясняет возможность разработки противоопухолевых агентов на основе тех или иных липидов.

Рис. 2.

Структурная формула фактора активации тромбоцитов (IV), эдельфозина (V) и его структурного аналога (VI).

Исследования биологической активности синтетических и природных аналогов PAF показали, что различные модификации типа связи в положении C1, а также заместителей в положениях C2 глицерина приводят к появлению у липидных аналогов PAF антагонистических свойств. Поскольку соединение (IV) вызывает сильную агрегацию тромбоцитов, его трудно использовать в практике [16]. Синтезировано большое количество структурных аналогов PAF, проявляющих противоопухолевые свойства благодаря воздействиям на различные механизмы: ингибирование клеточных ферментов, индукцию некроза, активацию эффекторов иммунитета, ограничение метастазирования [17, 18].

Биологическое действие PAF-подобных глицеролипидов с простой эфирной связью зависит от длины углеводородных заместителей, формирующих их гидрофобный домен. Замена ацетильной группы при С2-атоме глицерина на короткоцепную алкильную группу приводит к появлению противоопухолевых свойств [19]. Цвиттер-ионные фосфолипиды алкильного типа – структурные аналоги PAF – не обладают способностью агрегировать тромбоциты, но ингибируют пролиферацию опухолевых клеток и вызывают их гибель. Эти липиды обладают противоопухолевым, противовирусным и антибактериальным действием и, в отличие от многих противоопухолевых лекарственных агентов, не вызывают серьезных побочных эффектов, за исключением гемолиза [20–22].

Дальнейшие разработки привели к синтезу 1‑О-октадецил-2-O-метил-3-глицерофосфохолина (ET-18-OCH₃, эдельфозин, соединение (V), рис. 2), который показал более высокую противоопухолевую активность, чем соединение (I) [23]. Последующие исследования подтвердили, что эдельфозин и родственные алкиллизофосфолипиды обладают потенциальной противоопухолевой активностью [17, 24]. Эдельфозин был первым успешным глицерофосфолипидом после PAF (IV), проявляющим активность в микромолярных концентрациях, и дошел до II фазы клинических испытаний, он стал считаться “золотым стандартом” среди противоопухолевых липидов. Необходимо отметить, что первоначально не был определен механизм действия эдельфозина, из-за его сходства с соединением (IV) наиболее вероятными мишенями считали PAF-рецепторы. Позднее было показано, что добавление эдельфозина к клеткам HL60 с низким уровнем экспрессии PAF-рецепторов вызывает апоптоз [25], в то время как инкубация эдельфозин-чувствительных клеток с соединением (IV) не приводила к апоптозу [26].

Эдельфозин – первый противоопухолевый агент, взаимодействующий с липидными рафтами на периферии клеток [27, 28]. Он накапливается в эндоплазматическом ретикулуме, что вызывает особую форму стрессового ответа и апоптоз, а также ингибирует синтез фосфатидилхолина путем инактивации фосфохолинцитидилтрансферазы [29, 30], обладает некоторой избирательностью действия и менее токсичен для неопухолевых клеток [17, 31, 32]. Селективность цитотоксического действия эдельфозина объясняется тем, что в трансформированных клетках увеличивается скорость эндоцитоза [33, 34].

Замена метильной группы на этильную при С2-атоме глицерина эдельфозина значительно уменьшает цитотоксический эффект (табл. 1, [19]; соединение (VI), рис. 2).

Эдельфозин обладает высокой гемолитической активностью [19], имеет относительно низкую биодоступность (<10% при однократном введении) и малую скорость выведения из организма [35]. Эти факторы обусловили поиск более эффективных структурных аналогов эдельфозина [36, 37]. Поиск менее гемотоксичных, более стабильных и не менее активных аналогов эдельфозина продолжается. Синтезированы положительно заряженные и нейтральные липиды, среди которых выделяются глицеролипиды, гликоглицеролипиды и поликатионные глицеролипиды (глицерополиамины) (схема 1 ).

Схема 1 . Классификация противоопухолевых липидов.

Побочные эффекты эдельфозина и его аналогов определяют необходимость разработки новых способов доставки соединений для улучшения биодоступности. При парентеральном введении достигается быстрое распределение в органах [38], однако из-за гематотоксичности фосфорсодержащих глицеролипидов приходиться ограничивать их дозы. Пероральное введение соединения (V) обеспечивает необходимую концентрацию в плазме крови только при многократном применении [35]. Подкожное введение и поверхностное [39] нанесение глицеролипидов также не обеспечивают эффективную концентрацию в плазме, однако в отдельных случаях используются для терапии кожных метастазов и минимизации системных побочных эффектов [40]. Современные подходы к улучшению биодоступности и доставки глицеролипидов включают использование липидных наночастиц [41–43]. Помимо улучшения биодоступности, при инкапсуляции соединения (V) в липидные наночастицы удалось преодолеть резистентность клеток лейкоза к эдельфозину [39].

В обзоре приведена классификация фосфорсодержащих и бесфосфорных липидов с противоопухолевой активностью (схема 1 ), обоснованы структурные модификации различных липидов и проанализированы механизмы их действия.

Первичный анализ активности проводился нами с использованием МТТ-теста, в котором оценивали цитотоксичность соединения для опухолевых и неопухолевых клеток. Глицеролипиды добавляли к клеткам в конечных концентрациях 0.1–50.0 мкМ. После 72-часовой инкубации жизнеспособные клетки восстанавливали тетразолиевую соль (реагент МТТ) в нерастворимый формазан; количество последнего (по поглощению света длиной волны 575 нм) определяли в колориметрической реакции. Цитотоксичность соединений рассчитывали как 50%-ные рост-ингибирующие концентрации (IC₅₀), сравнивая степени поглощения света формазаном в клетках, обработанных соединениями, и в интактных (контрольных) клетках. В наших исследованиях соединения со значением IC₅₀ > 20–50 мкМ для опухолевых линий не представляли интереса. Цитотоксичность IC₅₀ ≤ 20 мкМ считали условным порогом для дальнейших испытаний.

АНАЛОГИ ЭДЕЛЬФОЗИНА

Тиоэфирный вариант эдельфозина – илмофозин (соединение (VII), рис. 3) – продемонстрировал цитотоксичность in vitro и in vivo [44]; в клинических испытаниях илмофозин не показал активность у пациентов и вызывал схожие с эдельфозином побочные эффекты [45]. Аналогичная ситуация наблюдалась для милтефозина (гексадецилфосфохолин, соединение (VIII)), хотя в доклинических испытаниях он показывал более высокую по сравнению с соединением (V) биодоступность и накопление в плазме крови [46]. При этом милтефозин в значительной степени метаболизируется фосфолипазами до неактивных метаболитов и токсичен при пероральном и внутривенном введении [47]. Однако соединение (VIII), в отличие от эдельфозина (V), введено в клиническую практику для лечения отдельных опухолей (лимфома кожи, поверхностные метастазы рака молочной железы) и лейшманиоза [48]. Замена холиновой части в милтефозине на гетероциклический пиперидин (перифозин, cоединение (IX)) привела к расширению круга чувствительных опухолевых клеток и к благоприятной фармакокинетике: перифозин (IX) всасывается из желудочно-кишечного тракта в течение 24 ч и не подвергается метаболическим превращениям. Максимальное накопление в опухоли достигается через 48 ч [49, 50]. Эти данные позволяют использовать перифозин (IX) для перорального применения, как и милтефозин (VIII). Известно, что перифозин (IX), как и эдельфозин (V), вызывает апоптоз и селективен к миеломе [31]. Эруцилфосфохолин (X) и его гомолог эруфозин (XI) активны против опухолей головного мозга [51, 52].

Рис. 3.

Фосфорсодержащие противоопухолевые липиды: илмофозин (VII), милтефозин (VIII), перифозин (IX), эруцилфосфохолин (X) и эруфозин (XI).

Серьезные недостатки эдельфозина и его фосфорсодержащих аналогов – гидролиз под действием фосфолипаз и выраженный гемолитический эффект – положили начало структурно-функциональным исследованиям бесфосфорных липидов.

БЕСФОСФОРНЫЕ ПОЛОЖИТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫЕ ЛИПИДЫ

Поиск перспективных бесфосфорных аналогов эдельфозина предусматривал варьирование гидрофобных и гидрофильных структурных доменов. Все рассматриваемые далее бесфосфорные липиды можно условно подразделить на три основных типа (рис. 4): 1) положительно заряженные глицеролипиды (рис. 4а); 2) положительно заряженные гликоглицеролипиды (рис. 4б); 3) поликатионные глицеролипиды (рис. 4в).

Рис. 4.

Бесфосфорные положительно заряженные глицеролипиды.

Для каждой группы проводились структурно-функциональные исследования, в ходе которых выявлялся вклад отдельных доменов в цитотоксичность. Анализ зависимости активности от структуры в значительной степени осложняется тем, что разные по природе злокачественные клетки сильно различаются по чувствительности к “липидотерапии”. При этом увеличение токсичности, вызванное изменением структуры липида, иногда приводит к снижению селективности действия.

Положительно заряженные глицеролипиды. В результате многолетних структурно-функциональных исследований разработан класс бесфосфорных аналогов эдельфозина – алкильные катионные глицеролипиды [53]. Эти соединения разнообразны по структуре; общее – наличие положительно заряженной “головки” и гидрофобных заместителей, размещенных на глицериновой матрице (рис. 4а). Различают глицеролипиды с катионной “головкой”, присоединенной к глицериновому фрагменту непосредственно или через спейсерную группу.

Анализ взаимосвязей “структура–активность” показал, что длина цепи заместителей при атомах С1 и С2 глицерина, тип катионной “головки” и наличие спейсерной группы, отделяющей ее от глицеринового фрагмента, оказывают значительное влияние на активность липида [19, 54]. Для цитотоксической активности существенным оказывается наличие в структуре алкильных катионных глицеролипидов следующих фрагментов [19]: 1) длинноцепного алкильного заместителя в С1-положении глицеринового остова (14–19 атомов углерода); 2) короткоцепного алкильного заместителя в С2-положении (1–2 атома углерода); 3) катионной “головки”, представленной гетероциклическими и алифатическими аминами с набором различных функциональных групп и присоединенной непосредственно к С3-атому глицеринового остова или через спейсерную группу ацильного типа.

Механизм действия катионных алкильных глицеролипидов до конца не изучен, хотя предполагается, что он включает эндоцитоз и попадание глицеролипидов в ранние эндосомы [55]. Установлено, что противоопухолевые глицеролипиды способны встраиваться в мембраны злокачественных клеток, вызывая биофизические (изменение текучести плазматической мембраны) и биохимические изменения, приводя к лизису клетки [56].

Основная причина особого внимания к бесфосфорным катионным глицеролипидам алкильного типа состоит в том, что они оказывают лишь незначительное отрицательное воздействие на неопухолевые клетки (в т.ч. клетки крови), что делает эти соединения безопасными [57].

Получены и исследованы новые катионные глицеролипиды с различными алифатическими или гетероциклическими аминами. Представленные в табл. 1 данные для бесфосфорных глицеролипидов (рис. 4а) свидетельствуют о том, что клетки линии аденокарциномы толстой кишки НСТ116 чувствительны ко всем липидам (XIIa–XIIg) [36, 53, 57]. Наиболее высокую активность проявили соединения с метилимидазолиевой (XIIe) и этилимидазолиевой (XIIf) катионными головками. Значения показателей IC₅₀ для остальных исследуемых соединений не превышали 20 мкМ.

Линия клеток аденокарциномы яичника SKOV-3 оказалась в меньшей степени подвержена действию соединений (XIIa–XIIc). Приемлемые результаты показали липиды с пиридиниевым (XIId), метилимидазолиевым (XIIe), этилимидазолиевым (XIIf) и диметил-2-гидроксиэтиламониевым (XIIg) фрагментами (IC₅₀ не превышают 13 мкМ). Значения показателей IC₅₀ для остальных соединений составляли более 35 мкМ, что указывает на незначительный цитотоксический эффект этих соединений для линии SKOV-3.

Для самой устойчивой к тестируемым липидам линии аденокарциномы молочной железы MCF-7 значимый цитотоксический эффект был достигнут при действии липидов с пиридиниевой (XIId) и диметил-2-гидроксиэтиламониевой (XIIg) полярными головками. Для остальных бесфосфорных соединений IC₅₀ составляла более 20 мкМ. Для MCF-7 липиды с имидазолиевой группой в полярном домене (XIIe, XIIf) оказались малотоксичными, а липиды с метилпиперидиниевой (XIIa), метил-4-гидроксипиперидиниевой (XIIb) и метилморфолиниевой (XIIс) группами не вызывали гибель 50% клеток в интервале используемых концентраций (0.1–50.0 мкМ).

На клетках линии В16 (меланома мыши) липиды с гетероциклическими пиридиниевой (XIId), метилимидазолиевой (XIIe), этилимидазолиевой (XIIf) и диметил-2-гидроксиэтиламониевой (XIIg) головками оказались более токсичными, чем соединения с метилпиперидиниевой (XIIa), метил-4-гидроксипиперидиниевой (XIIb) и метилморфолиниевой (XIIc) катионными головками.

В отличие от перечисленных адгезионных культур, для суспензионных (лейкоз) клеток (линия HL60) все исследованные липиды, кроме соединений с метилпиперидиниевой (XIIa), метил-4-гидроксипиперидиниевой (XIIb) и особенно с метилморфолиниевой (XIIс) группами, оказали выраженный цитотоксический эффект, незначительно превышающий цитотоксичность эдельфозина (V). Наиболее активным для линии HL60 оказалось соединение с метилимидазолиевой (XIIe) гетероциклической головкой. Установлено, что наличие четвертичной аммониевой группы необходимо для проявления активности, а наличие гидроксильной группы в катионной головке, напротив, несколько снижает цитотоксичность соединений. На линии K562 исследования для данной группы соединений не проводились.

Изучение действия на неопухолевые клетки (фибробласты) показало, что 50%-ная гибель клеток наступает при действии липидов (XIId–XIIg) в концентрациях, превышающих 25 мкМ [53]. Слабое воздействие на фибробласты может свидетельствовать об избирательности бесфосфорных алкильных глицеролипидов к опухолевым клеткам. Это важное свойство выгодно отличает указанный хемотип от эдельфозина (V) [53].

Положительно заряженные гликоглицеролипиды. Гликозилированные противоопухолевые алкильные липиды (GAELs) представляют собой класс синтетических противоопухолевых липидов, в котором сахарный остаток заменяет фосфохолиновый фрагмент эдельфозина (V). GAELs – гликолипиды с выраженной цитотоксичностью для ряда опухолевых моделей [58, 59]. Особенности этих соединений включают апоптоз-независимый механизм гибели клеток и способность элиминировать стволовые клетки опухоли. Цитотоксичность некоторых GAELs превосходит таковую наиболее изученного представителя негликозилированных алкильных липидов – эдельфозина (V) [60].

Детали молекулярных механизмов действия GAELs неизвестны. На стволовых опухолевых клетках показано, что GAELs вызывают неапоптотическую гибель, что делает эти соединения перспективными для преодоления лекарственной устойчивости [58, 59, 61, 62]. Гликозилированные липиды проникают в клетки рака молочной железы по механизму эндоцитоза и включаются в ранние эндосомы [55, 61]. GAELs предотвращают созревание эндоцитарных пузырьков, что приводит к образованию крупных кислых вакуолей (возможно, вследствие параптоза). По-видимому, в результате высвобождения катепсинов из вакуолей в цитозоль индуцируется гибель по механизму, отличающемуся от классического апоптоза [61].

Одним из оснований для изучения GAELs стало наблюдение, согласно которому определенные виды растений (например, овес) способны частично заменять фосфоглицеролипиды на гликоглицеролипиды (липиды на основе моно- или олигосахаридов) в условиях недостатка фосфора [63]. Это наблюдение предполагает, что глицеролипид, включающий углеводное звено, может имитировать фосфохолин-глицеролипиды за счет полярности углеводной группы [63].

Одно из направлений поиска новых противоопухолевых глицеролипидов – изменение взаиморасположения катионного домена, глицеринового остова и углеводного фрагмента (рис. 4б). Углеводное звено может размещаться в центре молекулы (XIII–XV) или занимать терминальное положение (XVI). В качестве углеводного фрагмента выступают остатки глюкозы, галактозы, маннозы и глюкозамина. Катионная головка представлена, как и в случае катионных глицеролипидов, гетероцикическими основаниями (рис. 4б) [64].

Из табл. 1 видно, что наибольшую активность на клетках K562 и HCT116 проявили гликолипиды, включающие маннозу с пиридиниевой катионной головкой (XIIIa) [64]. Маннозоглицеролипид с метилимидазолиевой катионной головкой (XIIIb), галактоглицеролипиды (XIVa, XIVb) и глюкозаминглицеролипиды (XVa, XVb) (приведены наши неопубликованные данные) показали хорошие результаты на линиях K562, HL60, HCT116 и B16. Значительно уступают им соединения с терминально расположенным углеводным остатком (XVIa–XVIc, рис. 4б) [64, 65]. Данное исследование указывает на целесообразность дальнейшей разработки GAELs, содержащих маннозу.

Поликатионные глицеролипиды. В качестве катионных доменов глицеролипидов предложено использовать полиамины с открытой или замещенной терминальной группой. Такой выбор объясняется структурой и биологическими свойствами полиаминов. В этот класс входят природные соединения путресцин, спермин и спермидин. Положительный заряд четырех аминогрупп позволяет спермину и спермидину взаимодействовать с отрицательно заряженными молекулами: нуклеиновыми кислотами, АТФ, фосфолипидами и белками [66, 67]. Бо́льшая часть полиаминов находится именно в связанном с РНК состоянии [68]. Спермин и спермидин способны ремоделировать хроматин и, таким образом, воздействовать на экспрессию генов [69, 70]. Ингибирование ферментов, участвующих в биосинтезе и метаболизме полиаминов, с помощью антиметаболитов-миметиков, замедляет пролиферацию клеток. Так, ингибирование орнитиндекарбоксилазы добавлением α-дифторметилорнитина вдвое уменьшает уровень внутриклеточного спермина и снижает скорость пролиферации клеток [71].

Таким образом, использование полиаминов и их производных в качестве положительно заряженных заместителей в глицеролипидах перспективно для поиска новых противоопухолевых соединений [72]. Модифицированные полиамины исследуются в качестве ингибиторов систем транспорта полиаминов [73] и ферментов их биосинтеза [74–76]. В данном обзоре рассматриваются алкильные поликатионные глицеролипиды (рис. 4в), в которых катионный домен представлен остатком незащищенного или терминально алкилированного тетраамина.

Глицерополиамины (XVIIa–XVIIi) оказывают сильное цитотоксическое действие (IC₅₀ < 6 мкМ) на опухолевые клетки различного тканевого происхождения, включая сублинию хронического миелоидного лейкоза K562/4, устойчивую к доксорубицину и другим препаратам, транспортируемым Р-гликопротеином (табл. 1), а также на неопухолевые эмбриональные фибробласты человека [77].

Анализируя влияние длины алкильного заместителя при C1 глицерина у глицерополиаминов (табл. 1), можно отметить, что для клеточных линий К562, НСТ116, SKOV-3 и MCF-7 удлинение цепи с 10 (XVIIc) до 16 (XVIIf) атомов углерода незначительно влияет на изменение цитотоксичности (IC₅₀ = 1.82–4.88 мкМ). Дальнейшее удлинение цепи до 18 углеродных атомов (XVIIg) уменьшает цитотоксичность (для линии SKOV-3 данные отсутствуют). Наличие этильной группы при терминальном атоме азота полиамина несколько уменьшает значение IC₅₀, т.е. повышает эффективность соединений (XVIIc–XVIIg, XVIIi). Этот эффект может быть связан с тем, что терминальная этильная группа предотвращает потенциальное ацилирование и дальнейшее окисление соединения, что повышает его устойчивость в клетках [78].

БЕСФОСФОРНЫЕ НЕЙТРАЛЬНЫЕ ГЛИКОГЛИЦЕРОЛИПИДЫ

Нейтральные гликоглицеролипиды не содержат катионной “головки”, однако сохраняют амфифильность за счет наличия гидрофильного углеводного звена. Этот хемотип представляет интерес для адресной доставки лекарств. Например, D-галактоза и D-манноза служат углеводными лигандами, распознаваемыми рецепторами печени и дендритных клеток [79–81].

Нейтральные гликоглицеролипиды содержат как алкильные, так и ацильные остатки, по-разному локализованные в глицериновом остове и углеводном фрагменте. Структурные домены –гликозильное звено и длинноцепные алкильные и ацильные остатки, размещенные на глицериновом скелете или на углеводном звене. Классификация этих липидов основывается на природе длинноцепных заместителей, их локализации на гликозилглицериновой матрице и удаленности углеводного звена от глицеринового остова. Таким образом, синтетические гликоглицеролипиды подразделяется на:

1) алкильные гликоглицеролипиды:

а) алкильные гликоглицеролипиды с углеводным фрагментом, непосредственно присоединенным к глицериновому остову;

б) алкильные гликоглицеролипиды с углеводным фрагментом, присоединенным через спейсерную группу;

2) ацильные гликоглицеролипиды;

3) комбинированные гликоглицеролипиды (содержат алкильные и ацильные остатки).

Алкильные гликоглицеролипиды. Нейтральные гликоглицеролипиды (GAELs) – ближайшие аналоги природных гликоглицеролипидов, обладающие высокой биодоступностью, что увеличивает их клиническую значимость. Было показано [55], что гибель клеток при действии GAELs не задействует классический апоптоз, что отличает их от бесфосфорных алкильных глицеролипидов. Кроме того, важное преимущество нейтральных GAELs – практически полное отсутствие гемолитической активности [82].

Алкильные гликоглицеролипиды с углеводным фрагментом, непосредственно присоединенным к глицериновому остову. Соединения (XVIIIa–XVIIIf) содержат в качестве углеводного фрагмента остатки D-маннозы, D-галактозы, D-глюкозамина, N-ацетил-D-глюкозамина, D-галактозамина и N-ацетил-D-галактозамина, присоединенные к С3-атому глицерина (рис. 5а). Соединения (XVIIIа, XVIIIb) продемонстрировали схожую цитотоксичность и избирательность к линии лейкоза K562 (табл. 2 [82]): у обоих соединений значения IC₅₀ ниже в сравнении со значениями, полученными для других линий клеток, и ниже, чем соответствующие значения для эдельфозина (V) (см. табл. 1).

Рис. 5.

Бесфосфорные нейтральные глицеролипиды.

Соединения (XVIIIc–XVIIIf) – алкильные аминогликоглицеролипиды, содержащие остатки D-глюкозамина и D-галактозамина (XVIIIc, XVIIIe) или N-ацетил-D-глюкозамина и N-ацетил-D-галактозамина (XVIIId, XVIIIf) (для соединений (XVIIId, XVIIIf) приведены наши неопубликованные данные).

Глицеролипиды (XVIIIc–XVIIIf) оказывают схожее цитотоксическое действие на клетки линии К562 (IC₅₀ находятся в диапазоне 4–8 мкМ). Наиболее активно соединение (XVIIIe) с остатком D-галактозамина, в то время как его ацетилированное производное (XVIIIf) проявляет меньшую активность. Ацетилирование аминогруппы и для глюко- (XVIIId), и для галактопроизводных (XVIIIf) приводит к снижению токсичности соединений. Соединения (XVIIIс) и (XVIIIe) оказались активнее для клеток MCF-7, чем остальные представители данной группы. На клеточных линиях HCT116 и SKOV-3 глицеролипиды (XVIIIc–XVIIIf) были менее активны, однако также показали схожие результаты (IC₅₀ находятся в диапазоне 9–16 мкМ).

Алкильные гликоглицеролипиды с углеводным фрагментом, присоединенным через спейсерную группу. В соединениях (XIXa–XIXf) (рис. 5a) углеводный остаток присоединен к глицериновому звену с помощью спейсерных групп различной длины, что дает возможность проанализировать влияние удаленности углеводного фрагмента от диглицеридного остова на цитотоксические свойства нейтральных алкильных гликоглицеролипидов.

В сравнении с соединениями (XVIIIa, XVIIIb) [82] гликоглицеролипиды, содержащие спейсерную группу, оказались менее активны для линии K562 и не проявили избирательности. Соединение (XIXa) с остатком D-маннозы, присоединенным через диметиленовый спейсер, показало более высокую токсичность для неопухолевых клеток (IC₅₀ = 12.5 ± 5.2 мкМ на фибробластах), чем его аналог с тетраметиленовым спейсером (XIXe) (IC₅₀ > 50 мкМ).

Наилучшие результаты показало соединение (XIXс) с остатком D-маннозы, присоединенным через триметиленовый спейсер, на клеточных линиях HL60, HCT116 и B16. В ряду соединений, содержащих остаток D-галактозы (XIXb, XIXd, XIXf), самыми активными были гликоглицеролипиды, соединенные с галактозой через ди- или триметиленовый спейсер (XIXb, XIXd), в отношении клеток HCT116, B16 и K562 (только для соединения (XIXd)). Гликоглицеролипиды с тетраметиленовым спейсером (XIXe, XIXf) показали наихудшие результаты на исследуемых клеточных линиях вне зависимости от типа углеводного остатка.

Обобщая данные о нейтральных GAELs, можно сделать вывод, что высокую активность проявляли GAELs, в которых остаток D-маннозы присоединен либо непосредственно к глицериновому скелету (XVIIIa) (для клеток К562), либо через триметиленовую спейсерную группу (XIXc) (табл. 2). Соединения с диметиленовым спейсером (XIXa, XIXb) показали умеренную активность на исследуемых клеточных линиях. Средние значения IC₅₀ для группы соединений (XVIII) были ниже, чем для группы соединений (XIX), что свидетельствует об отрицательном влиянии наличия спейсера на цитотоксические свойства рассмотренных гликоглицеролипидов.

Ацильные гликоглицеролипиды. Соединения (XXa) и (XXb) – нейтральные гликозилированные глицеролипиды, содержащие в качестве углеводного фрагмента остаток D-галактозы и отличающиеся степенью ненасыщенности ацильных заместителей в положениях С1 и С2 глицерина (остатки линолевой и олеиновой кислот) (рис. 5б). По ацильным гликоглицеролипидам представлены наши данные.

Цитотоксичность гликозилированного ацильного глицеролипида с остатком линолевой кислоты (XXb) на линии K562 была незначительно выше цитотоксичности эдельфозина (V) (см. табл. 1). Соединение с остатком олеиновой кислоты (XXa) проявило ярко выраженную избирательность для линии рака яичника SKOV-3 и IC₅₀, схожую с таковой для эдельфозина (V). На клетках HCT116 оба соединения были менее активны, однако на сублинии с нокаутом гена p53 соединение (XXb) с двумя ненасыщенными двойными связями оказалось существенно активнее (IC₅₀ = = 13.6 ± 0.21), чем соединение (XXa), содержащее одну ненасыщенную двойную связь (IC₅₀ > 50 мкМ). Белок p53 играет важную роль в механизме апоптоза [83], следовательно, можно предположить, что механизм действия соединения (XXb) благодаря наличию полиненасыщенного ацильного остатка связан с апоптозом, что отличает его от остальных GAELs, вызывающих неапоптотическую гибель клеток.

Комбинированные гликоглицеролипиды, содержащие алкильные и ацильные остатки. Комбинированные препараты (пролекарства) – соединения с невысокой фармакологической активностью или без таковой, однако приобретают ее, превращаясь в активное лекарство in vivo в результате метаболических реакций [84]. Используя физико-химические свойства липосом, включающих пролекарства, и патофизиологические характеристики опухолей, можно инициировать высвобождение и активацию липидов с простой эфирной связью (AELs) в опухоли. Для этого используют покрытые полимерами липосомы, включающие пролипиды с простой эфирной связью (proAELs) [85]. Пролипиды превращаются в активные препараты при гидролизе фосфолипазой A2 (sPLA2) в опухоли [86–88]. Фосфолипиды гидролизуются sPLA2 с образованием лизофосфолипидов и свободных жирных кислот [86]. Одна из наиболее привлекательных – лизофосфатидная кислота (LPA, (XXIII), рис. 6) – природный фосфолипид, функционирующий как биоактивный липидный медиатор и вторичный мессенджер. Соединение (XXIII) регулирует пролиферацию, миграцию и выживание опухолевых клеток.

Рис. 6.

Лизофосфатидная кислота (XXIII).

Способность опухолевых клеток приобретать устойчивость к клинически применяемым препаратам снижает эффективность противоопухолевой терапии [2]. Устойчивость, как правило, множественная, делает клетки нечувствительными одновременно к нескольким агентам [3]. Преодоление лекарственной устойчивости возможно при создании препаратов, компоненты которых индуцируют различные механизмы гибели [50, 89].

Как указано выше, GAELs активируют неапоптотическую гибель опухолевых клеток, а наличие в структуре глицеролипидов гликозильного остатка может влиять на амфифильность молекул, что необходимо для улучшения биологической активности и фармакокинетики.

При сочетании противоопухолевых механизмов возможен аддитивный или синергический эффект [89]. Модификация противоопухолевых агентов путем конъюгирования с жирной кислотой способна увеличить селективность и привести к появлению новых гибридных структур с оптимизированной биологической активностью. Модифицированные жирные кислоты могут сделать химиотерапию более эффективной и менее токсичной [90]. В связи с этим перспективным представляется создание комбинированных гликоглицеролипидов, содержащих в диглицеридном или углеводном доменах алкильные и ацильные остатки, различающиеся насыщенностью и длиной.

Соединения (XXIa–XXIc) – алкильные гликоглицеролипиды, дополненные остатками жирных кислот, локализованными по С6-положению углеводного домена (рис. 5в). Концепция такой молекулярной инженерии основана на ожидаемом разрушении клеточными эстеразами сложноэфирной связи в клетке и возникновением двух противоопухолевых агентов, индуцирующих различные механизмы гибели.

Цитотоксичность гликоглицеролипидов (XXIa–XXIc) на всех исследуемых линиях оказалась неудовлетворительной (IC₅₀ > 50 мкМ) (табл. 2). Это свидетельствует о том, что данная комбинация структурных элементов значительно уступает соединениям (XVIIIa, XVIIIb) без ацильного остатка по С6-положению.

Полиненасыщенные жирные кислоты ω3 также используются в химиотерапии [91]. Ключевой механизм, предложенный для преодоления множественной лекарственной устойчивости, основан на влиянии ω3-кислот на структуру плазматической мембраны и трансмембранный транспорт [93] и на наличии тканеспецифичности в зависимости от структуры [90, 92, 93]. Кроме того, они могут замедлять рост опухолей, вызывая апоптоз или ингибируя ангиогенез [91, 94].

Комбинированные противоопухолевые липиды при внутриклеточном расщеплении могут проявлять аддитивность за счет сочетания следующих свойств: 1) лизолипиды цитотоксичны в микромолярных концентрациях; 2) жирные кислоты могут ингибировать пролиферацию опухолевых клеток и повышать их чувствительность к противоопухолевым препаратам; 3) жирные кислоты и лизолипиды могут снижать барьер проницаемости липидных мембран [88].

Были синтезированы лизоглицеролипид (XXIIа) и его производные с моно- (XXIIb) и диненасыщенными (XXIIс) жирными кислотами по С2-положению глицерина и изучена их цитотоксичность (рис. 5в, табл. 2). Исследуемые соединения показали наибольший эффект на линиях лейкозов K562 и HL60 (наши неопубликованные данные). На линиях опухолевых клеток A375, MCF-7, HBL100, MDA-MB-231 и HCT116, а также на неопухолевых фибробластах значения IC₅₀ превышали 50 мкМ. Наличие и степень ненасыщенности жирных кислот при С2-положении глицерина влияют на цитотоксичность, но обе модификации важны для избирательности к клеткам лейкозов. Замена остатка мононенасыщенной олеиновой кислоты на диненасыщенную линолевую вызывает больший цитотоксический эффект на клетках K562, а отсутствие заместителя при С2 или наличие более насыщенного заместителя увеличивает цитотоксичность для линии HL60.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На первоначальном этапе исследования противоопухолевых липидов основными соединениями были фосфорсодержащие глицеролипиды. Эталоном остается эдельфозин из-за его высокой активности. Однако трактовка эдельфозина как “золотого стандарта” противоопухолевых липидов требует пересмотра, поскольку токсичность в отношении нормальных клеток и низкая избирательность не позволяют получить для него приемлемое “терапевтическое окно” – различие цитотоксических концентраций для опухолевых и неопухолевых клеток. Кроме того, он обладает низкой биодоступностью, нестабильностью, медленным выведением из организма и высоким гемолитическим эффектом.

Среди бесфосфорных липидов имеются отдельные хемотипы (например, положительно заряженные глицеролипиды), которые при сопоставимой с эдельфозином антинеопластической активности вызывают минимальные повреждения неопухолевых клеток. Для некоторых соединений (катионные гликолипиды, нейтральные гликоглицеролипиды и др.) наблюдалась специфичность в отношении лейкозов, что может открыть новые перспективы при разработке препаратов для лечения данного заболевания. Несмотря на относительно невысокий противоопухолевый эффект бесфосфорных липидов, их преимущество заключается в низкой токсичности для неопухолевых клеток; отдельные соединения (катионные глицеролипиды) активнее эдельфозина при меньшем повреждении эритроцитов.

Разработка бесфосфорных аналогов эдельфозина и дальнейшие модификации дизайна бесфосфорных липидов – перспективное направление поиска новых кандидатов в противоопухолевые агенты среди представителей этого класса химических соединений.