Биоорганическая химия, 2022, T. 48, № 3, стр. 375-378

ВВЕДЕНИЕ

Синтетические аналоги хромофоров флуоресцентных белков – бензилиденимидазолоны – высокоперспективны в качестве основы для новых флуоресцентных меток. Благодаря большому количеству существующих синтетических методов модификаций этих соединений можно легко получить вещества разного строения и с разными заместителями, что потенциально позволяет значительно варьировать их оптические свойства [1, 2]. В частности, для флуоресцентных красителей важна способность поглощать и испускать свет длинноволнового диапазона – менее токсичный для биологических тканей. Эффективный подход к батохромному смещению максимумов абсорбции и эмиссии красителей – увеличение системы сопряженных π-связей. Например, флуоресцентные белки Kaede и DsRed, хромофоры которых содержат во 2-м положении имидазолона заместители с кратными связями, имеют максимум флуоресценции 580–585 нм [3], в то время как флуоресцентный белок GFP (Green Fluorescent Protein), хромофор которого имеет алкильную группу в этом положении, характеризуется флуоресценцией с максимумом 510 нм [3]. Аналогично показано, что синтетические аналоги хромофора GFP, имеющие во 2-м положении иные стирольные заместители, испускают свет в области ~600 нм [4–8]. Схожими свойствами обладают конденсированные производные [9, 10], у которых данный фрагмент циклически замкнут на атом азота имидазолонового цикла. Ранее на примере пары синтетических аналогов хромофора Kaede нами была изучена зависимость оптических свойств от подвижности кратной связи во 2-м положении имидазолона (рис. 1) [11]. Было установлено, что фиксация двойной связи для конденсированного производного (I) приводит к батохромному сдвигу максимумов абсорбции на 79 нм и эмиссии на 19 нм (рис. 1).

Рис. 1.

Производные хромофора белка Kaede и их оптические свойства в ацетонитриле.

Цель настоящей работы – изучение влияния положения фенильного заместителя в имидазопиридиноновом фрагменте на оптические свойства производных хромофора белка Kaede.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы нами из бромопиридин-2-аминов были получены пиридиновые производные глицина (II) и (III). Затем с помощью конденсации с анисовым альдегидом были синтезированы соответствующие имидазопиридиноны (IV). На заключительной стадии синтеза с помощью реакции арилирования бромпроизводных (IV) были получены целевые соединения (V).

Установлено, что оптические свойства полученных соединений (V) (схема 1 ) не отличаются от свойств ранее описанного аналога (I) (рис. 1). Все производные характеризуются абсорбцией с максимумом 500–505 нм и эмиссией с максимумом 555–560 нм в ацетонитриле (рис. 2). Вероятно, что отсутствие влияния положения фенильного заместителя связано с неполным сопряжением с π‑системой молекулы из-за его подвижности. В связи с этим перспективное направление для дальнейших исследований – создание производных с жестко фиксированными ароматическими заместителями.

Схема 1 . Схема синтеза целевых соединений (V).

Рис. 2.

Нормализованные спектры абсорбции и эмиссии соединений (I), (Vа) и (Vb) в ацетонитриле.

Также мы установили, что новые производные (V) обладают слабой флуоресценцией с квантовым выходом 1.5–2.0% (в ацетонитриле). Многие производные хромофоров флуоресцентных белков с подобными свойствами могут быть использованы в качестве флуорогенных красителей [10, 12]. Поэтому можно предположить, что производные (V) и родственные им соединения также перспективны для применения во флуоресцентной микроскопии в данной роли.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Оборудование. Спектры ЯМР (δ, м.д.; J, Гц) регистрировали на спектрометре Fourier 300 (300 МГц; Bruker, США) при 303 K в DMSO-d₆ (внутренний стандарт – Me₄Si), спектры поглощения – на спектрофотометре Cary 100 Bio (Varian, США), спектры флуоресценции – на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian, США). Температуры плавления определяли на приборе SMP 30 (Stuart Scientific, Великобритания) и не исправляли. Масс-спектры высокого разрешения регистрировали на приборе micrOTOF II (Bruker, Германия), ионизация электрораспылением.

Синтез этил(бромопиридин-2-ил)глицината (II). Бромопиридин-2-амин (10 г, 58 ммоль) растворяли в смеси HClO₄ (50%, 24.0 мл) и EtOH (50 мл), добавляли водный раствор глиоксаля (40%, 8.00 мл, 64 ммоль). Полученную смесь кипятили в течение 40 ч. Затем реакционную смесь охлаждали до 0°С, разбавляли насыщенным раствором NaHCO₃ до рН 7, экстрагировали CHCl₃ (4 × 160 мл), сушили над безводным Na₂SO₄ и упаривали. Продукт очищали методом флеш-хроматографии (элюент – этилацетат и гексан, 1 : 1).

Синтез гидрохлорида (бромопиридин-2-ил)глицина (III). Этил-2-((бромопиридин-2-ил)амино)ацетат (32 ммоль) растворяли в HCl (5 М, 32 мл) и кипятили 6 ч. Затем смесь упаривали, остаток промывали Et₂O (2 × 50 мл) и сушили в вакууме.

Синтез (Z)-бромо-2-(4-метоксибензилиден)ими-дазо[1,2-a]пиридин-3(2H)-она (IV). 2-((3-Бромопиридин-2-ил)амино)уксусной кислоты гидрохлорид (800 мг, 3.0 ммоль) помещали в колбу Шленка, вакуумировали, заполняли аргоном и добавляли 4.5 мл PCl₃ (51 ммоль). Полученную смесь кипятили в течение 5 ч и упаривали. К остатку в токе аргона добавляли анисовый альдегид (0.330 мл, 2.7 ммоль), пиридин (3.0 мл) и триэтиламин (0.50 мл). Реакционную смесь выдерживали при 70°С в течение 12 ч, а затем упаривали. Полученный остаток растворяли в EtOAc (50 мл), промывали насыщенным раствором NaHCO₃ (10 мл) и насыщенным раствором NaCl (3 × 15 мл), сушили над безводным Na₂SO₄ и упаривали. Полученный продукт очищали методом флеш-хроматографии (элюент – этилацетат и гексан, 1 : 3).

Синтез (Z)-2-(4-метоксибензилиден)-фенилимидазо[1,2-a]пиридин-3(2H)-она (V). В колбу Шленка помещали (Z)-бромо-2-(4-метоксибензилиден)имидазо[1,2-a]пиридин-3(2H)-он (33 мг, 0.1 ммоль), фенилбороновой кислоты пинаколовый эфир (54 мг, 0.26 ммоль) и CsCO₃ (163 мг, 0.5 ммоль). Колбу вакуумировали, заполнили аргоном и добавляли PhMe (2 мл) и Pd(Ph₃P)₄ (12 мг, 0.01 ммоль). Смесь выдерживали 4 ч при 75°С, затем добавляли CH₂Cl₂ (50 мл) и промывали водой (2 × 80 мл). Органическую фазу сушили над безводным Na₂SO₄ и упаривали. Продукт очищали флеш-хроматографией (элюент – хлороформ).

Выходы реакций, температуры плавления и спектральные характеристики синтезированных соединений (II–V) приведены в дополнительных материалах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синтезированы новые производные хромофора белка Kaede – (Z)-2-(4-метоксибензилиден)-6/8-фенилимидазо[1,2-a]пиридин-3(2H)-оны. Установлено, что оптические свойства этих соединений не зависят от положения фенильного заместителя в имидазопиридиноновом фрагменте, что, вероятно, объясняется неполным сопряжением с π-системой молекулы.

Новые соединения могут быть использованы в качестве флуорогенных красителей, поскольку они, как и многие производные хромофоров флуоресцентных белков, обладают слабой флуоресценцией.