Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2019, T. 36, № 1, стр. 63-71

ВВЕДЕНИЕ

Диаденозиновые полифосфаты (ДАП) – семейство пуринергических соединений, которое рассматривается в настоящее время в качестве новой группы эндогенных сигнальных молекул. Молекулы ДАП состоят из двух аденозиновых оснований, соединенных несколькими остатками фосфорной кислоты, число которых может составлять от двух до семи [1, 2]. ДАП синтезируются с помощью специфических ферментативных систем в самых различных тканях организма, в том числе в периферической и центральной нервной системе, где функционируют в качестве нейромедиаторов [3]. Наиболее важным источником ДАП в организме млекопитающих являются активированные тромбоциты, что указывает на сердечно-сосудистую систему как на непосредственную мишень ДАП [4]. Из пресинаптических нервных окончаний может выделяться также NAD⁺ – структурно сходное с ДАП соединение пуринового ряда, обладающее определенным кардиотропным действием [5, 6]. Согласно последним данным ДАП и NAD⁺ являются потенциальными комедиаторами катехоламинов, регулирующих сердечную функцию [7].

Влияние ДАП на сердечно-сосудистую систему зависит от вида животного, его возраста, органа или ткани и используемого соединения. Так, в зависимости от числа остатков фосфорной кислоты ДАП может вызывать вазодилатацию или же вазоконстрикцию резистивных артерий [8], а в миокарде крысы как ДАП, так и NAD на разных стадиях онтогенеза действуют через различные подтипы пуриновых рецепторов, что обуславливает различие их эффектов у животных разного возраста [9, 10].

Ранее нами было показано, что воздействие ДАП и NAD⁺ снижает длительность потенциалов действия (ПД) в предсердном и желудочковом миокарде крысы [6, 11]. Подобные изменения биоэлектрической активности обусловлены, как правило, модуляцией трансмембранных ионных токов. Тем не менее исследования с применением фиксации потенциала методом пэтч-кламп не выявили четко выраженного влияния ДАП и NAD⁺ ни на реполяризующие калиевые токи, ни на кальциевый ток L-типа в изолированных кардиомиоцитах крысы [12, 13]. В связи с этим нами была выдвинута гипотеза о том, что действие ДАП и NAD⁺ в миокарде крысы может быть опосредовано их влиянием на ионный ток другой природы, а именно, на хлорный реполяризующий ток.

В настоящее время известно несколько реполяризующих хлорных токов, некоторые из них могут быть обнаружены в кардиомиоцитах млекопитающих. В наибольшей степени на паттерн электрической активности сердца влияют хлорный ток, активируемый протеинкиназой А (I_{Cl, PKA}), хлорный ток, активируемый растяжением (I_{Cl, SWELL}), а также кальцийзависимый хлорный ток (I_Cl,Ca, обозначаемый также как I_to2) [14, 15]. В нормальных условиях в отсутствие адренергической стимуляции наибольший вклад в биоэлектрическую активность миокарда может вносить транзиторный кальцийзависимый ток I_to2 [16]. Кальцийзависимый хлорный ток, описанный ранее в изолированных клетках рабочего миокарда таких животных, как кролик [17] и мышь [18], определяется как транзиторный ток выходящего направления, характеризующийся резистентностью к тетраэтиламмонию и 4-аминопиридину – блокаторам калиевых токов, но чувствительный к блокатору кальциевого тока L-типа нифедипину [17]. Тем не менее, ранее в миокарде крысы I_to2 не обнаруживали.

В нашей работе в желудочковом миокарде крысы впервые описан транзиторный ток I_to2, а также изучено действие соединений пуринового ряда P¹,P⁴-ди(аденозин-5')тетрафосфата (Ap4A), P¹,P⁴-ди(аденозин-5')пентафосфата (Ap5A) и NAD⁺ на данный ток в изолированных желудочковых кардиомиоцитах крысы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали самцов белых беспородных крыс массой 200–250 г. Изолированные желудочковые кардиомиоциты получали по описанной ранее методике [19]. Перед экспериментом крыс наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией раствора кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). В дополнение к анестетикам животным вводили гепарин (1000 МЕ/кг) для предотвращения свертывания крови. Животных декапитировали, вскрывали грудную клетку и быстро вырезали сердце. Сердце помещали на аппарат Лангендорфа и ретроградно перфузировали раствором следующего состава (мМ): NaCl 116; KCl 4; NH₂PO₄ 1.7; NaHCO₃ 25; MgCl₂ 0.5; таурин 20; Na-пируват 5; глюкоза 11; бычий сывороточный альбумин 1 мг/мл; pH 7.4 поддерживали аэрацией насыщенным карбогеном (95% O₂, 5% CO₂); перфузию проводили при температуре 37 ± ± 0.5°С. Далее сердце в течение 25–30 мин перфузировали раствором аналогичного состава с добавлением 0.5 мг/мл коллагеназы типа II (Worthington, США), 0.1 мг/мл протеазы типа XIV (Sigma, США) и 10^‒5 М CaCl₂. После завершения ферментативной обработки сердце снимали с аппарата Лангендорфа, отделяли и измельчали желудочки, затем механически выделяли их в раствор следующего состава (мМ): глутамат калия 50; KCl 30; KH₂PO₄ 30; MgSO₄ · 7H₂O 3; таурин 20; EGTA 0.5; HEPES 20; глюкоза 10; pH 7.2 (KOH). Этот раствор использовали для хранения клеток в ходе эксперимента в течение 6–7 ч. При проведении экспериментов были соблюдены актуальные требования отечественного законодательства по надлежащему обращению с лабораторными животными.

Ионные токи регистрировали методом фиксации потенциала пэтч-кламп в конфигурации whole-cell с помощью усилителя EPC 800 (HEKA Elektronik, Германия). Кардиомиоциты помещали в экспериментальную камеру RC-26 (Warner Instruments, Великобритания) объемом 150 мкл и постоянно перфузировали модифицированным физиологическим раствором следующего состава (мМ): NMDG-Cl 126; CsCl 5.4; MgCl₂ 1; CaCl₂ 2; HEPES 10; глюкоза 10; pH 7.4 (CsOH) при комнатной температуре (24 ± 1°С), с добавлением блокаторов калиевых токов 4-аминопиридина (4-АР, 5 мМ) и тетраэтиламмония (ТЭА, 15 мМ) [20]. Пипетки изготавливали из боросиликатного стекла без филамента (Sutter Instrument, США) с помощью пуллера PIP 6 (HEKA Elektronik, Германия) и заполняли пипеточным раствором (мМ): аспартат цезия 110; CsCl 20; MgCl₂ 1; EGTA 0.1; Mg-ATP 5; Na-GTP 0.03; HEPES 10; pH 7.4 (CsOH). Сопротивление заполненных раствором пипеток составляло 2–3 МОм. Внеклеточная концентрация хлорид-ионов составляла, таким образом, 137.4 мМ, а внутриклеточная – 20 мМ, что примерно соответствует физиологическим значениям [21]. Перед началом регистрации ионных токов компенсировали емкость клетки, емкость пипетки, а также сопротивление контакта. Данные регистрировали и обрабатывали с помощью специального программного обеспечения WinWCP 4.8.6 (University of Strathclyde, Великобритания) и ClampFit 10.3 (Molecular Devices, США). Амплитуду транзиторного тока I_to2 определяли как пиковую амплитуду тока, полученного после вычитания тока, зарегистрированного в присутствии блокатора (DIDS, 10^‒5 M; CaCCinh-A01, 10^‒5 M). Величину тока нормировали по электрической емкости клетки и выражали в пА/пФ.

ПД регистрировали в препаратах изолированного правого желудочка крысы с помощью острых стеклянных микроэлектродов по описанной ранее методике [22]. Сердце сразу после извлечения промывали физиологическим раствором следующего состава (мМ): NaCl 130; KCl 5.6; NaH₂PO₄ 0.6; MgCl₂ 1.1; CaCl₂ 1.8; NaHCO₃ 20; глюкоза 11; pH 7.4 поддерживали аэрацией насыщенным карбогеном. Выделяли препарат правого желудочка и закрепляли его на дне экспериментальной камеры эндокардиальной стороной вверх. Через камеру постоянно со скоростью 10 мл/мин протекал физиологический раствор (температура 37 ± ± 0.5°С). После адаптации препарата к экспериментальным условиям в течение 2 ч приступали непосредственно к регистрации трансмембранных потенциалов. Для регистрации использовали стеклянные микроэлектроды с сопротивлением 20–50 МОм, изготовленные из боросиликатного стекла (Sutter Instrument, США) с помощью пуллера P-30 (Sutter Instrument, США) и заполненные раствором KCl (3 М). Потенциалы регистрировали с помощью усилителя 1600 (A-M Systems, США) с использованием специального программного обеспечения PowerGraph Professional 3.0 (L-Card, Россия). При обработке зарегистрированных ПД определяли длительность ПД на уровнях реполяризации 50 и 90% (ДПД50 и ДПД90 соответственно).

В работе использовали следующие реактивы: аммониевую соль P¹,P⁴-ди(аденозин-5')тетра-фосфата (Ap4A, Sigma, США); аммониевую соль P¹,P ⁴-ди(аденозин-5')пентафосфата (Ap5A, Sigma, США); NAD⁺ (AppliChem, Германия); неселективный блокатор хлорных каналов и транспортеров 4,4'-диизотиоциано-2,2'-стильбендисульфоновую кислоту DIDS (Sigma, США); 4-аминопиридин (Santa Cruz Biotechnology, США); селективный блокатор кальцийзависимых хлорных каналов 6-(1,1-диметилэтилэтил)-2-[(2-фуранилкарбонил)амино]-4,5,6,7-тетрагидробензо[b]тиофен-3-карбоновую кислоту CaCCinh-A01 (Tocris Bioscience, Великобритания); неселективный блокатор хлорных каналов нифлюмовую кислоту (Sigma, США); хлорид тетраэтиламмония (MERCK, Германия).

Все результаты представлены как среднее ± ± стандартная ошибка среднего для n экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, США). Нормальность распределения выборок оценивали по критерию Пирсона. Статистическую значимость эффектов ДАП, NAD⁺ и блокаторов хлорных токов выявляли с использованием однофакторного дисперсионного анализа для связанных выборок (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони. Различия между сравниваемыми группами считали статистически значимыми при p ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В желудочковых кардиомиоцитах крысы при потенциалах положительнее ‒40 мВ обнаруживается транзиторный выходящий ток I_to, имеющий большую амплитуду и определяющий быструю фазу реполяризации ПД. Однако при замене ионов Na⁺ на NMDG, а ионов K⁺ ‒ на Cs⁺ и в присутствии ТЭА (15 мМ) и 4-AP (5 мМ) транзиторный выходящий ток, индуцируемый деполяризацией клетки, исчезает не полностью. Поскольку в таких экспериментальных условиях незаблокированными остаются только кальциевые и хлорные токи, можно предположить наличие в желудочковом миокарде крысы транзиторного реполяризующего хлорного тока, обозначаемого как I_to2 (рис. 1а).

Рис. 1.

Транзиторный хлорный ток I_to2 в желудочковых кардиомиоцитах крысы. а – Оригинальные записи суммарного выходящего транзиторного тока в контроле и его 4-АР-резистентной компоненты, являющейся током I_to2. б – Оригинальные записи тока I_to2 в контроле и в присутствии неселективного блокатора хлорных каналов DIDS (10^‒5 М). в – Оригинальные записи тока I_to2 в контроле и в присутствии блокатора кальциевого тока L-типа нифедипина (10^‒5 М). г – Оригинальные записи тока I_to2 в контроле и в присутствии селективного блокатора кальцийзависимых хлорных каналов CaCCinh-A01 (10^‒5 М). Соответствующие протоколы стимуляции приведены здесь же.

Согласно результатам более ранних исследований, хлорный ток I_to2 является кальцийзависимым: его амплитуда зависит от концентрации свободного Ca²⁺ в цитозоле. Исходя из этого, ток I_to2 индуцировали с использованием ступенчатого протокола изменения мембранного потенциала с первой деполяризующей ступенью до ‒10 мВ длительностью 20 мс для активации кальциевого тока L-типа I_CaL. Это позволяло достигнуть относительно высокой концентрации Ca²⁺ в цитоплазме, а затем активировать ток I_to2 на второй ступени протокола [18]. Нами показано, что резистентная к 4-AP компонента тока I_to полностью подавляется неселективным блокатором хлорных каналов и транспортеров DIDS (10^‒4 М), блокатором кальциевого тока L-типа нифедипином (10^‒5 М) и селективным блокатором кальцийзависимых хлорных каналов CaCCinh-A01 (10^‒5 М), что подтверждает хлорную природу данного тока, его кальцийзависимость и позволяет идентифицировать его как ток I_to2 (рис. 1б, 1в, 1г). Нифлюмовая кислота в концентрации 10^‒5 М не блокировала регистрируемый ток.

На рис. 2 представлена вольт-амперная характеристика тока I_to2, зарегистрированного в изолированных желудочковых кардиомиоцитах крысы. Несмотря на значительно более низкую амплитуду данного тока в желудочковом миокарде крысы по сравнению с желудочковым миокардом мыши, форма вольт-амперной кривой полностью соответствует полученной ранее в опытах на изолированных желудочковых кардиомиоцитах мыши [18]. При потенциалах положительнее ‒40 мВ ток имел входящее направление; его амплитуда увеличивалась по мере деполяризации мембраны клетки. При потенциалах отрицательнее ‒50 мВ ток имел выходящее направление, но значительно меньшую амплитуду. Однако при таких значениях мембранного потенциала ток I_to2, по всей видимости, не вносит значительного вклада в формирование электрической активности сердца ввиду низкой цитоплазматической концентрации Ca²⁺.

Рис. 2.

Вольт-амперная характеристика транзиторного хлорного тока I_to2 в желудочковых кардиомиоцитах крысы. а – Оригинальные записи тока I_to2, полученные при различных поддерживаемых потенциалах. б – Кривая вольт-амперной зависимости тока I_to2. Амплитуду транзиторного тока I_to2 определяли как пиковую амплитуду тока, полученного после вычитания тока, зарегистрированного в присутствии блокатора (DIDS, 10^‒5 M; CaCCinh-A01, 10^‒5 M).

Для исследования влияния ДАП и NAD⁺ на хлорный ток I_to2 в изолированных желудочковых кардиомиоцитах крысы во внеклеточный раствор добавляли Ap4A, Ap5A и NAD⁺ в концентрации 10^‒4 М, одновременно регистрируя ток при +40 мВ. Согласно опубликованным данным, при таком мембранном потенциале ток I_to2 имеет большую амплитуду, а ток I_CaL практически отсутствует. Величину тока оценивали по амплитуде его пика после вычитания тока, зарегистрированного в присутствии блокатора. Значения амплитуды тока нормировали по емкости клетки. Аппликация Ap4A приводила к статистически значимому увеличению амплитуды тока на 44 ± 11% (p = 0.0065, n = 7). Действие Ap4A на I_to2 было обратимым. Ap5A (n = 6) и NAD⁺ (n = 6) не вызывали статистически значимых изменений тока I_to2 (рис. 3а, 3б). Таким образом, из всех использованных в данном исследовании агонистов пуринергических P2Y только Ap4A оказывал значительное влияние на I_to2.

Рис. 3.

Влияние ДАП и NAD⁺ на транзиторный хлорный ток I_to2 в желудочковых кардиомиоцитах крысы. а – Оригинальные записи тока I_to2 в контроле и в присутствии Ap4A (10^‒4 М). б – Амплитуда тока I_to2 в контроле и в присутствии Ap4A (10^‒4 М, n = 7), Ap4A (10^‒4 М, n = 6) или NAD⁺ (10^‒4 М, n = 6); ** – p < 0.01, **** – p < 0.0001, однофакторный дисперсионный анализ для связанных выборок (ANOVA). в – ПД в препарате изолированного правого желудочка крысы в контроле и в присутствии DIDS (10^‒4 М, n = 6) или DIDS (10^‒4 М) и Ap4A (10^‒5 М, n = 6). г – ПД в препарате изолированного правого желудочка крысы в контроле и в присутствии CaCCinh-A01 (10^‒5 М, n = 7) или CaCCinh-A01 (10^‒5 М) и Ap4A (10^‒5 М, n = 7).

Для оценки вклада усиления Ap4A тока I_to2 в индуцируемое им изменение электрической активности миокарда проведена серия экспериментов с внутриклеточной регистрацией ПД в препарате миокарда с помощью острых стеклянных микроэлектродов (рис. 3в, 3г). В ходе эксперимента препарат изолированного правого желудочка крысы перфузировали физиологическим раствором с добавлением DIDS (10^‒5 М) или CaCCinh-A01 (10^‒5 М) в течение 5 мин для полной блокады кальцийзависимых хлорных каналов. После этого в присутствии блокатора в экспериментальную камеру подавали раствор Ap4A (10^‒5 М). Проведенные ранее исследования показали, что перфузия ДАП в данной концентрации в течение 5 мин вызывает заметные обратимые изменения электрической активности изолированного препарата миокарда крысы [11]. В этой работе Ap4A не вызывал статистически значимых изменений длительности ПД в препарате изолированного правого желудочка крысы в присутствии DIDS (n = 6) или CaCCinh-А01 (n = 7) в растворе. Таким образом, можно утверждать, что эффекты Ap4A в желудочковом миокарде крысы опосредованы, по крайней мере отчасти, его влиянием на амплитуду хлорного тока I_to2.

Ранее мы показали, что ДАП и NAD⁺ способны не только снижать длительность ПД в изолированных препаратах миокарда крысы; они подавляют сократительную способность изолированного сердца, а также снижают кальциевые транзиенты в изолированных кардиомиоцитах крысы [6, 11, 23]. В желудочковых кардиомиоцитах крысы Ap4A не оказывал ярко выраженного ингибирующего влияния на кальциевый ток L-типа, амплитуда которого благодаря особенностям механизма электромеханического сопряжения в значительной степени определяет силу сокращения миокарда. Принимая во внимание обнаруженное нами усиление кальцийзависимого хлорного тока I_to2 в присутствии Ap4A, можно предположить, что поскольку данный ток вносит вклад в раннюю реполяризацию кардиомиоцитов в процессе генерации ПД, его усиление может приводить к снижению длительности ПД на уровнях реполяризации 25 и 50% и, соответственно к уменьшению длительности фазы плато и сократимости миокарда в результате снижения входа ионов Ca²⁺ [24].

Главными претендентами на роль каналов, переносящих кальцийзависимый хлорный ток, считаются аноктамины (Ano, известные также как каналы TMEM16A) и бестрофины, а также семейство белков CLCA [25, 26].

Маловероятно, что обнаруженный нами ток опосредуется белками семейства CLCA, поскольку данные каналы отличаются от классического кальцийзависимого хлорного тока по своим биофизическим свойствам (так, каналы CLCA способны активироваться при деполяризации без увеличения внутриклеточной концентрации Ca²⁺ и обладают линейной вольт-амперной характеристикой) и паттернам экспрессии [27].

Семейство Ano включает 10 различных белков, однако только Ano1 и Ano2 могут опосредовать кальцийзависимый хлорный ток в физиологических условиях, функция прочих членов не вполне ясна [28, 29]. Аnо1 экспрессируется в сердечной ткани мыши и переносит кальцийзависимый хлорный ток в изолированных желудочковых кардиомиоцитах мыши [20]. Данные об аналогичных исследованиях, проведенных на миокарде крысы, на сегодняшний день отсутствуют. Ano2 экспрессируется в обонятельном эпителии, однако нет данных о его экспрессии в миокарде млекопитающих [28]. Бестрофины экспрессируются в миокарде человека, собаки и мыши и формируют в клетках сердца функциональные ионные каналы [30–32]. Аno и бестрофины различаются чувствительностью к неселективным блокаторам хлорных токов. Tак, концентрация полумаксимального ингибирования (IC₅₀) каналов Ano1 нифлюмовой кислотой составляет порядка 7.5 × 10^‒6 М, тогда как у бестрофина 1 (Best1) она значительно выше – более 10^‒4М. Напротив, бестрофины гораздо более эффективно ингибируются DIDS (IC₅₀ около 4 × 10^‒6 М) по сравнению с Ano (IC₅₀ около 5.5 × 10^‒4 М) [25]. Таким образом, на основании чувствительности исследуемого тока к DIDS и нифлюмовой кислоте можно предположить, что его молекулярным коррелятом являются скорее каналы семейства бестрофинов, нежели Ano.

Возможность того, что описываемый нами ток переносится не ионами Cl^‒, а катионами Cs⁺ через кальцийзависимые неселективные катионные каналы семейства TRP, исключается в силу чувствительности тока к селективному блокатору CaCCinh-A01.

Что касается рецепторного механизма, опосредующего эффекты ДАП в миокарде млекопитающих, то показано, что в этом принимают участие пуриновые рецепторы типа P2Y, но не P1 и P2X [33]. Из пуриновых P2Y-рецепторов в сердце млекопитающих на наиболее высоком уровне экспрессируются рецепторы подтипов P2Y1, P2Y2, P2Y6, P2Y11, сопряженные с G_q-белками [34]. Известно, что сопряженные с G_q P2Y-рецепторы могут как запускать сигнальный каскад, связанный с протеинкиназой C, так и активировать сигнальный путь, зависимый от оксида азота (NO) [35, 36]. В исследовании, выполненном ранее нашей группой, показано, что применение блокаторов, действующих на компоненты NO-зависимого сигнального пути, не влияет на эффекты Ap4A и Ap5A в изолированном сердце крысы, тогда как блокатор протеинкиназы C и неселективный блокатор фосфодиэстераз предотвращали развитие данных эффектов [23]. Это позволяет сделать вывод о том, что эффекты ДАП в миокарде крысы опосредуются P2Y-рецепторами, сопряженными с G_q-белками, и сигнальным каскадом, включающим протеинкиназу C и некоторые фосфодиэстеразы.

Примечательно, что в экспериментах на клетках других органов млекопитающих (гладкомышечные клетки бронхов, клетки эпителия почечных канальцев) также показано, что активация пуринергических P2Y-рецепторов (в том числе и P2Y2, обнаруженных в миокарде крысы) приводит к увеличению кальцийзависимого хлорного тока, опосредованного каналами семейства Ano [37, 38]. Однако в этих случаях увеличение амплитуды хлорного тока происходит из-за повышения внутриклеточного уровня Ca²⁺, активирующего переносящие его каналы. В желудочковом миокарде крысы активация P2Y-рецепторов при аппликации ДАП сопровождалась отрицательным инотропным эффектом, уменьшением кальциевых транзиентов и, соответственно, снижением внутриклеточного уровня Ca²⁺ [23]. Таким образом, пуринергическая активация кальцийзависимого хлорного тока в кардиомиоцитах крысы опосредуется иным сигнальным механизмом.

Полученные результаты свидетельствуют о вкладе хлорного тока I_to2 в биоэлектрическую активность желудочкового миокарда крысы в норме, а также о возможности его модуляции агонистами пуринергических рецепторов. Это позволяет дополнить имеющуюся модель формирования и регуляции ПД в рабочем миокарде крысы. Тем не менее, для уточнения молекулярной природы и возможных путей регуляции обнаруженного нами тока I_to2 требуются дальнейшие исследования с использованием молекулярно-биологических методов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-15-00268).