Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2019, T. 36, № 1, стр. 72-76

ВВЕДЕНИЕ

Плазмодий миксомицета Physarum polycephalum является классическим объектом для изучения немышечных форм подвижности. Предполагалось, что существенную роль в регуляции процесса движения плазмодия играют секретируемый в окружающую среду медиатор сAMP и внеклеточная циклонуклеотидспецифичная фосфодиэстераза [EC 3.1.4.17] (PDE) [1, 2]. В согласии с этой точкой зрения нами показано, что плазмодий продуцирует внеклеточный сAMP в субмикромолярных концентрациях [3]. Кроме того, в среде инкубации плазмодия P. polycephalum обнаружена также фосфодиэстеразная активность, ассоциирующаяся с гидролизом циклических нуклеотидов [4]. В физиологических экспериментах показано [5], что ингибирование активности внеклеточной фосфодиэстеразы (Pp-PDE) дитиотреитолом (DTT) приводит к изменению характера подвижности плазмодия (подавление распластывания и пеpеxод в фазу мигpации). Это дополнительно указывало на важную роль этого фермента в контроле двигательного поведения плазмодия P. polycephalum [5].

По ряду свойств (например, термостабильности и чувствительности к ряду ингибиторов [4, 6]) этот фермент принципиально отличается от хорошо изученных ранее PDE млекопитающих, составляющих основу семейства ферментов класса I [7, 8]. Он также отличался от членов недавно обнаруженного семейства PDE класса III [9] и поэтому был предположительно отнесен нами к относительно небольшому и малоисследованному семейству PDE класса II, идентифицированному у низших эукариот [10]. Детальный анализ этого предположения до недавнего времени был затруднен, поскольку (1) данные о физико-химических и ферментативных свойствах членов семейства PDE класса II были ограничены и (2) характеристики внеклеточной Pp-PDE были получены на препарате, не свободном от ряда эндогенных примесей, взаимодействие с которыми, возможно, и определяет уникальные физико-химические и ферментативные свойства Pp-PDE.

Недавно выполнили рентгеноструктурный анализ одного из типичных членов семейства PDE класса II – PDE-1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Sc-PDE), а также определили ряд физико-химических и ферментативных характеристик этого белка [11]. Это позволило провести более полное сравнение внеклеточной Pp-PDE P. polycephalum и PDE-1 S. cerevisiae. Кроме того, в отличие от предыдуших исследований [4, 6], выполненных нами на препарате, содержащем значительное количество продуцируемых плазмодием высокомолекулярных (30–70 кДа) полисахаридов [12], существенно затрудняющих очистку фермента, в настоящей работе мы использовали препарат фермента, в значительной степени свободный от полисахаридов. Это удалось достичь благодаря использованию экзогенной агаразы и удаления продуктов гидролиза полисахаридов ультрафильтрацией.

Результаты сравнительного анализа подтверждают точку зрения, согласно которой внеклеточная Рр-PDE является представителем семейства циклонуклеотидспецифичных PDE класса II. Ферменты этого класса значительно отличаются от внутриклеточных PDE класса I (PDE1–PDE11 [7]) и, согласно данным об их первичной структуре, представляют собой отдельную эволюционную ветвь [10, 11, 13, 14].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование плазмодия миксомицета P. polycephalum, приготовление материала для экстракции и получение экстрактов внеклеточной Рр-PDE выполняли как описано ранее [4].

Ионообменная хроматография. Ионообменную хроматографию препаратов Pp-PDE проводили на колонке (1.5 × 15 см) с DEAE-целлюлозой (Whatman, США), предварительно уравновешенной буфером А (20 мM HEPES-NaOH, pH 8.0, 1 мM MgCl₂) при скорости элюции 20 мл/ч и температуре 20°С [4]. Препарат наносили на колонку в этом буфере, а затем этим буфером промывали колонку до получения минимальных значений поглощения элюата при 280 нм. Элюцию осуществляли с помощью линейного градиента концентрации NaCl (0–500 мМ). Общий объем растворов, используемых для формирования градиента, составлял 250–300 мл. Фракции объемом 2 мл собирали и измеряли в них активность PDE.

Очистка препаратов Pp-PDE от эндогенных высокомолекулярных полисахаридов. Фракции, полученные путем ионообменной хроматографии и обладающие активностью PDE, собирали (общий объем 40–50 мл) и инкубировали в течение 3–5 ч с 10 мкл агаразы Pseudomonas atlantica (Fermentas, США) c удельной активностью 0.5 ед./мкл. Инкубированный препарат концентрировали в концентраторах Ultracel-10k (Millipore, США), центрифугируя в течение 30 мин при 2000 g. Концентрат разбавляли буфером А и подвергали дополнительному концентрированию. Обработка препарата агаразой позволяла избежать снижения пропускной способности фильтра при проведении ультрафильтрации.

Определение кажущейся молекулярной массы PDE. Для определения кажущейся молекулярной массы PDE использовали метод гель-фильтрации. Гель-фильтрацию очищенных от примеси полисахаридов препаратов PDE проводили на предварительно калиброванной колонке (1.5 × 80 см) с Sephacryl S-200 HR, уравновешенной буфером А с добавлением 100 мM NaCl, как описано ранее [4]. Для калибровки колонки использовали гексамеры рекомбинантной альфа-изоформы нуклеозиддифосфаткиназы крысы (~110 кДa) [15], овальбумин (мол. масса мономеров и димеров 45 и 90 кДa соответственно), бычий сывороточный альбумин (мол. масса мономеров и димеров 67 и 134 кДa соответственно), бычий бета-лактальбумин (17.6 кДa), миоглобин кашалота (17 кДa), цитохром С лошади (11 кДa) и голубой декстран (2000 кДa).

Определение активности PDE. Активность PDE в большом количестве образцов определяли с использованием методов, детально описанных ранее [4, 6, 16]: 1) полуколичественного метода, основанного на разделении субстрата и продукта реакции методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) [4, 6], и 2) рН-метрического метода [16], позволяющего регистрировать закисление среды, обусловленное высвобождением протонов в ходе реакции гидролиза циклических нуклеотидов (cAMP или cGMP). Для численного анализа активности PDE использовали уравнение Бриггса–Холдейна:

где V – скорость гидролиза при данной концентрации субстрата С, V_max – максимальная скорость, K_m – константа Михаэлиса. В координатах 1/С; 1/V уравнение (1) описывает прямую линию с наклоном K_m/V_max, которая отсекает отрезок 1/V_max на оси ординат.

Исследование термостабильности частично очищенных препаратов PDE. Температурную стабильность частично очищенных препаратов PDE определяли, как и препаратов PDE наружных сегментов фоторецепторов сетчатки быка и суслика [16] и рекомбинантных изоформ нуклеозиддифосфаткиназы крысы [17], измеряя ферментативную активность образцов после их инкубации в течение 15–30 мин при температуре в диапазоне 20–100°С. Образцы (20–50 мкл) находились в тонкостенных стеклянных капиллярах и содержали частично очищенный фермент в буфере А.

Дополнительные методы. Спектральные измерения выполняли на спектрофотометрах Specord UV-VIS (Carl Zeiss, Германия) и Cary 50 (Varian, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярная масса и субъединичный состав. Обработка препарата фермента, полученного в результате очистки с использованием ионообменной хроматографии агаразой, как описано в методической части работы, в течение 1–10 ч не влияла на его общую активность и значительно упрощала процедуру его концентрирования в 50–100 раз без изменения пропускной способности фильтров. Разбавление препарата буфером А и последующее повторное концентрирование, проводимое с целью удаления следов гидролизованных полисахаридов и понижения концентрации солей, также практически не влияло на общую активность препарата.

Анализ такого препарата методом гель-фильтрации на Sephacryl S-200 HR показал, что компонент, обладающий активностью PDE, элюируется как глобулярный белок с к.м.м. 85–90 кДа. Практически такую же величину мы получили ранее при анализе препарата фермента, содержащего эндогенные полисахариды P. polycephalum в виде примесей.

Недавно методом рентгеноструктурного анализа было впервые показано [11], что PDE-1 S. cerevisiae (Sc-PDE) является гомодимером двух субъединиц с молекулярной массой около 42 кДa (369 аминокислотных остатков). Отметим, что субъединицы PDE класса II патогенных грибов Сandida albicans (Ca-PDE) состоят из 426 остатков [13, 14] и имеют вычисленную молекулярную массу 48 кДа. Это означает, что при димерной структуре эти ферменты должны иметь молекулярную массу 84 и 96 кДa соответственно, что близко к полученному нами методом гель-фильтрации значению 85–90 кДа для Pp-PDE.

Кинетические характеристики. Ранее мы показали [4], что Pp-PDE гидролизует сAMP и сGMP с практически одинаковой максимальной скоростью и характеризуется аномально низким сродством к субстратам: значения K_m составляли 0.9 и 7.7 мМ для сAMP и сGMP соответственно. Близкие результаты получены в настоящей работе. Значения K_m составляли 1.2 и 6.5 мМ для сAMP и сGMP, соответственно, при практически равных значениях V_m (рис. 1).

Сходными характеристиками обладает Sc-PDE-1: ее сродство к субстратам невысоко (значения K_m составляют около 100 мкМ как для сAMP, так и для сGMP), причем данные субстраты гидролизуются с практически одинаковой скоростью [11]. Типичный представитель PDE класса II – фермент C. albicans также имеет низкое сродство к сAMP и сGMP (значения K_m равны примерно 500 и 250 мкМ для сAMP и сGMP соответственно) [14].

Важно, что несмотря на значительные различия в значениях K_m перечисленных ферментов, все они имеют заметно более низкое сродство к субстратам, чем PDE класса I. Подавляющее большинство ферментов этого класса характеризуется значениями K_m в диапазоне 0.1–10 мкМ (см., например, табл. 1 в обзоре Бендера и Биво [7]).

Влияние ионов Mg²⁺ на ферментативную активность. Неожиданными оказались результаты, полученные нами при исследовании влияния ионов Mg²⁺ на активность внеклеточной Рр-PDE. Активность фермента была практически постоянной при понижении концентрации ионов Mg²⁺ от 10 до 0.5 мМ [4]. Более того, дальнейшее понижение концентрации ионов Mg²⁺ вплоть до величин < 1 мкМ введением 2 мM EDTA также не меняло его активность [6]. Аналогичные результаты получены нами в настоящей работе на препарате, свободном от полисахаридов: введение в реакционную среду 2 мМ EDTA не влияло на величину активности. Эти результаты согласуются с недавними данными Тиан и соавт. [11], согласно которым активность Sc-PDE-1 можно измерять в среде, не содержащей ионов Mg²⁺. Более того, каталитическая активность фермента остается постоянной даже после его длительного (12–24 ч) диализа против 1 мM EDTA.

Все это указывало на принципиальное различие регуляторных характеристик PDE класса II (том числе и внеклеточной Рр-PDE) и PDE класса I, необходимым условием функционированием которых, как хорошо известно [7], является присутствие ионов Mg²⁺ в миллимолярных концентрациях. Данные рентгеноструктурных исследований Sc-PDE указывают на то, что в активном центре PDE класса II роль каталитических ионов магния играют два плотно связанных иона цинка, не удаляемых в результате длительной процедуры диализа в присутствии EDTA [11].

Влияние дитиотреитола (DTT) и β-меркаптоэтанола на ферментативную активность. Нами показано [4], что добавление DТТ или β-меркаптоэтанола полностью (и необратимо) ингибирует активность фермента P. polycephalum. Аналогичный результат получен и в настоящей работе при использовании свободного от эндогенных полисахаридов препарата плазмодия P. polycephalum. Это согласуется с результатами Хойера и соавт. [14], в которой показано, что 10 мМ DTT значительно (~10 раз) ингибирует активность относящегося к PDE класса II фермента патогенных грибов C. albicans.

Влияние температуры и додецилсульфата натрия (SDS) на ферментативную активность Pp-PDE. Ранее мы показали, что Pp-PDE обладает аномально высокой температурной стабильностью. Нагревание раствора белка до 100°С в течение 30 мин и последующее его охлаждение не влияло на ферментативную активность (по-видимому, это означает, что либо нагревание не ведет к денатурации Pp-PDE, либо процесс денатурации полностью обратим). Кроме того, Pp-PDE сохранял активность в присутствии 1% SDS. В настоящее время нет данных о стабильности PDE класса II при высоких температурах и воздействии SDS. Однако необходимо отметить, что высокая стабильность к действию высоких температур и денатурирующих агентов (SDS) не характерна для PDE класса I [7, 8, 16].

Чувствительность к ингибиторам циклонуклеотидспецифичных PDE. PDE класса II характеризуются низким сродством к широко известным ингибиторам PDE класса I [9]. Мы показали, что внеклеточная Рр-PDE проявляет аномально низкую чувствительность к этому ряду ингибиторов фосфодиэстеразной активности [6]. Этот результат подтверждает, что изучаемая Pp-PDE принципиально отличается от PDE класса I.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, по большинству доступных для сравнения физико-химических и ферментативных характеристик термостабильная внеклеточная Pр-PDE принципиально отличается от ферментов класса I и напоминает ферменты класса II. Возможно, что вопрос о классификации фермента P. polycephalum будет прояснен в дальнейшем в результате его анализа методами масс-спектроскопии.