Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2019, T. 36, № 4, стр. 301-304

ВВЕДЕНИЕ

Резкое изменение условий окружающей среды вызывает развитие стресса у растений. Такие воздействия, как засуха, засоление почвы, низкие температуры, повышенный уровень радиации, загрязнение почвы солями тяжелых металлов, чрезмерное освещение и высокая температура, существенно влияют на жизнедеятельность растений и создают осмотический стресс [1]. Стресс, в зависимости от того, чем он вызван – недостатком воды или его избытком, подразделяют на гипер- и гипоосмотический соответственно. При стрессе происходят перестройки метаболизма, в том числе, на уровне клеточных мембран и мембранных липидов. Одна из основных групп мембранных липидов, обеспечивающая целостность мембраны – стерины [2]. Также известно, что стерины составляют основу рафтов – динамичных мембранных наноструктур, которые играют важную роль в механизмах передачи сигналов в клетке и в регуляции различных белков, включая аквапорины, участвующие в транспорте воды через мембраны [3]. При осмотическом стрессе содержание несвязанной воды в клетке меняется. Поступление и удержание воды внутри клетки во многом зависит от вакуолярной мембраны [4]. Тонопласт, как и другие клеточные мембраны, участвует в защите клетки от стрессовых воздействий, но до настоящего времени его роль в этом процессе недостаточно изучена. Изменение состава стеринов вакуолярной мембраны при осмотическом стрессе может быть одним из адаптационных механизмов растительной клетки. Нами изучено изменение в содержании стеринов тонопласта при гипо- и гиперосмотическом стрессовом воздействии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили корнеплоды столовой свеклы (Beta vulgaris L.) сорт Модана. В экспериментах были использованы корнеплоды в период покоя, хранящиеся в течение нескольких месяцев при температуре 4–5°C. Корнеплоды подвергали гипо- и гиперосмотическому стрессу. Для создания гиперосмотического стресса корнеплоды в течение 3 суток выдерживали (подсушивали) на открытом воздухе при комнатной температуре, что приводило к снижению массы корнеплодов и увеличению осмоляльности клеточного сока. Для создания гипоосмотического стресса корнеплоды выдерживали в течение 1 суток в дистиллированной воде при комнатной температуре, из-за чего происходило насыщение клеток водой, и уменьшалась осмоляльность клеточного сока. Осмоляльность оценивали на осмометре ОМКА 1Ц-01 (Россия). В контрольном варианте использовали корнеплоды, не подвергнутые воздействию стресса.

Стрессовое воздействие на корнеплоды оценивали с использованием кондуктометрического метода [5]. Содержание диеновых конъюгатов определяли по методу [6]. Влияние осмотического стресса на барьерные свойства мембран (стабильность мембран) изучали с использованием цейтраферной видеосъемки [7]. Вакуолярные мембраны получали согласно [8]. Чистоту использованных в экспериментах изолированных мембран оценивали по наличию ферментов-маркеров [9]. Из вакуолярных мембран, выделенных из контрольных и подвергнутых разным видам стрессового воздействия корнеплодов, экстрагировали суммарные липиды по методу [10]. Стерины анализировали с помощью одномерной ТСХ с использованием системы растворителей для нейтральных липидов: гексан–диэтиловый эфир–уксусная кислота (80 : 20 : 1). Стерины, элюированные с пластинок хлороформом и этилацетатом, подвергали силилированию гексаметилдисилазаном и N,O-бис(тиметилсилил)ацетамидом. Образовавшиеся триметилсилильные производные стеринов анализировали с помощью хромато-масс-спектрометра GC–MS 7000/7890A TripleQuad, Agilent Technologies (США). Идентификацию стеринов проводили, сравнивая времена их удержания со стандартами, а также использовали библиотеки масс-спектров NIST08 и WILEY7. Количественный анализ проведен с использованием калибровочной кривой по холестерину, кампестерину, стигмастерину и β-ситостерину с помощью внутреннего стандарта, которым служил эргостерин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследования были подобраны условия эффективного стрессового воздействия. При осмотическом стрессе происходили существенные изменения массы корнеплода столовой свеклы и осмотической концентрации клеточного сока. Так, при гиперосмотическом стрессе масса корнеплода снижалась на 20%, осмотическая концентрация клеточного сока увеличивалась на 13%, а при гипоосмотическом стрессе, наоборот, масса увеличивалась на 20%, а осмотическая концентрация снижалась на 12%. В 2 раза увеличивалось количество диеновых конъюгатов и при гипоосмотическом (209% от контроля), и при гиперосмотическом стрессе (185% от контроля). О нарушении проницаемости мембран судили по выходу электролитов из тканей корнеплодов, подвергнутых осмотическому стрессу, который увеличился почти в 1.5 раза по сравнению с контролем. При гипоосмотическом стрессе выход электролитов составил 161% от контроля, а при гиперосмотическом – 153%. Стабильность вакуолярных мембран по-разному снижалась при разных видах осмотического стресса. Более интенсивное разрушение вакуолей происходило при гипоосмотическом стрессе. Период полураспада составил 22% от контроля, тогда как при гиперосмотическом стрессе он составил 72% от контроля.

Содержание общих стеринов и отдельных видов стеринов в вакуолярной мембране при гипо- и гиперосмотическом стрессе представлено на рис. 1. Общее количество стеринов снижалось при гипоосмотическом стрессе и не изменялось при гиперосмотическом. Ранее неоднократно наблюдали снижение содержания стеринов в плазмалемме при холодовом стрессе [11, 12]. Среди мембранных липидов именно стерины наиболее существенно влияют на такие свойства мембраны, как текучесть и проницаемость [13]. Кроме того, стерины могут воздействовать на упаковку мембранных бислоев, взаимодействуя с другими мембранными липидами. Так, стерины могут взаимодействовать с насыщенными алкильными цепями фосфолипидов и сфинголипидов, ограничивая их подвижность [14]. Обнаруженное в наших экспериментах снижение содержания стеринов при гипоосмотическом стрессе может обеспечивать уменьшение микровязкости и повышение проницаемости тонопласта. Кроме этого очевидного адаптационного механизма, нужно учитывать, что стерины являются основой рафтовых структур, присутствующих в тонопласте. Рафты, например, участвуют в регуляции аквапоринов – белков, осуществляющих водную проницаемость мембран [15].

Рис. 1.

Суммарное содержание стеринов и их отдельных видов в тонопласте, выделенном из корнеплодов столовой свеклы в контроле, при гипо- и гиперосмотическом стрессе (мкг/г сухого веса (M ± SD, n = 5)). Содержание стеринов определяли методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии.

Уменьшение содержания общих стеринов в вакуолярной мембране при гипоосмотическом стрессе связано со снижением содержания преобладающего среди стеринов β-ситостерина. Содержание всех остальных стеринов увеличивалось. Особенно интересно значительное увеличение содержания таких стеринов, как кампестерин и стигмастерин, которые, как отмечено другими исследователями, являются “антистрессовыми” [16, 17]. Содержание общих стеринов достоверно не изменилось при гиперосмотическом стрессе, несмотря на существенные изменения в соотношении разных видов стеринов (табл. 1). Так, содержание β-ситостерина уменьшалось даже более заметно, чем при гипоосмотическом стрессе (с 88 до 79% от всех стеринов) и, соответственно, увеличилось содержание “антистрессовых” стеринов кампестерина и стигмастерина.

Во всех вариантах опыта наблюдали также увеличение соотношения стигмастерин/β-ситостерин, вызывающее, по мнению ряда исследователей, активацию защитных механизмов растительной клетки [18, 19]. Увеличение содержания стигмастерина и снижение содержания β-ситостерина связано, вероятно, с тем, что β-ситостерин является предшественником стигмастерина. Оба этих стерина относятся к 24-этилстеринам, тогда как кампестерин это 24-метилстерин. Его молекула имеет меньшую свободу вращения С-17 углеводородной цепи благодаря более короткому размеру цепи, что позволяет плотнее упаковывать липидный бислой, и это приводит к снижению проницаемости мембраны для заряженных ионов [20]. Следует отметить, что стигмастерин способствует образованию рафтов [13], и эта его особенность тоже может быть связана с защитными механизмами.

Закономерности изменения в содержании стеринов тонопласта при разных видах осмотического стресса имеют черты сходства и отличия. Главное отличие состоит в содержании общих стеринов, которое уменьшается только при гипоосмотическом стрессе. С другой стороны, при обоих стрессах существенно уменьшается содержание β-ситостерина и значительно увеличивается содержание кампестерина и стигмастерина, а также увеличивается соотношение стигмастерин/β-ситостерин.

Таким образом, полученные данные показывают, что осмотический стресс приводит к изменению содержания стеринов тонопласта, и позволяют предположить, что стерины вакуолярной мембраны принимают участие в защите растительной клетки от стресса.

Работа выполнена с частичным использованием средств гранта РФФИ № 19-04-00013 на оборудовании ЦКП “Биоаналитика” Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).