Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2019, T. 36, № 5, стр. 373-380

ВВЕДЕНИЕ

Na⁺,K⁺-ATP-аза – трансмембранный белок состоящий из ~110 кДа α-субъединицы, ~35 кДа β-субъединицы и 8 кДа γ-субъединицы. Гидролиз АТР приводит к фосфорилированию Asp369 α-субъединицы, что обеспечивает электрогенный транспорт ионов (3Na⁺vs. 2K⁺) со скоростью 60–80 циклов в секунду. В дополнение к универсальной α1-изоформе нейроны обогащены α3-Na⁺,K⁺-ATP-азой, в то время как астроциты, кардиомиоциты и клетки скелетной мускулатуры содержат α2-изоформу этого фермента. Четыре изоформы β-субъединиц сильно гликозилированы и необходимы для ферментативной активности α-субъединицы и ее встраивания в плазматическую мембрану клеток. Функциональная значимость семи γ-субъединиц, содержащих мотив Pro-Phe-X-Tyr-Asp (FXYD), остается плохо изученной [1, 2].

Кардиотонические стероиды (КТС) известны как селективные ингибиторы Na⁺,K⁺-ATP-азы, обнаруженные как в растениях (карденолиды), так и у некоторых представителей животного царства (буфадиенолиды). Механизм ингибирования Na⁺,K⁺-ATP-азы кардиотоническими стероидами лучше всего изучен на примере водорастворимого карденолида уабаина, выделенного из Strophanthus gratus. Как и предполагалось, уабаин воздействует на большое количество клеточных функций, связанных с поддержанием трансмембранного градиента Na⁺ и K⁺, таких как электрический мембранный потенциал (E_m), клеточный объем, трансэпителиальное движение солей и осмотически связанной воды, обмен Na⁺/H⁺ и Na⁺(K⁺)/Ca²⁺, симпорт Na⁺ с неорганическим фосфатом, глюкозой, аминокислотами, нуклеотидами и т.д. За последние 20 лет показано, что вместе с ранее перечисленными каноническими [Na⁺]_i-, [K⁺]_i-, E_m-опосредуемыми клеточными ответами, кардиотонические стероиды могут воздействовать на экспрессию генов, мембранный транспорт, клеточную адгезию, пролиферацию и гибель клеток. Роль вклада ${\text{Na}}_{{\text{i}}}^{ + },{\text{K}}_{{\text{i}}}^{ + }$-зависимой и независимой сигнализации и этих неканонических клеточных ответах, запускаемых кардиотоническими стероидами, широко обсуждается [3–7].

В отличие от большинства других клеток пирамидные и зубчатые нейроны в коре головного мозга и в гиппокампе [8, 9], как и культивируемые гранулярные клетки [10, 11] обогащены α3-изоформой Na⁺,K⁺-ATP-азы. Munzer и соавт. показали, что при высокой внутриклеточной концентрации K⁺ и насыщающей концентрации внеклеточного K⁺ полумаксимальная активация уабаин-чувствительного входа ⁸⁶Rb α1-, α2- и α3-изоформами Na⁺,K⁺-ATP-азы наблюдалась при концентрации цитоплазматического Na⁺$\left( {{\text{Na}}_{{\text{i}}}^{{\text{ + }}}} \right)$ ~18, 20 и 64 мМ соответственно [12]. Более низкая аффинность α3-изоформы к Na⁺_i подтверждена в исследовании кинетики выхода Na⁺ из α1-α3-трансфицированных клеток HeLa, заполненных Na⁺-чувствительной флуоресцентной краской SBFI [13]. Исходя из этих данных предположили, что α1-Na⁺,K⁺-ATP-аза играет важную роль в поддержании низкого отношения [Na⁺]_i/[K⁺]_i в базальных условиях, в то время как α3-изоформы участвуют в нормализации прироста [Na⁺]_i, вызванного длительным возбуждением нейронов [13–15].

Несколько исследовательских команд [16–18] показали, что у грызунов сродство α3-Na⁺,K⁺-ATP-азы к КТС на 3 порядка выше, чем у α1-изоформы. Так, используя трансфицированные фибробласты NIH3T3, O’Brien и соавт. показали, что стандартная аффинность α3-, α2- и α1-изоформ крысы к уабаину, посчитанная по связыванию [³H]-уабаина, составляет ~2, 115 и 48 000 нМ соответственно [16]. В клетках BALB/c 3T3, трансфицированных α3- и α1-Na⁺,K⁺ATP-азами крысы, полумаксимальное ингибирование входа ⁸⁶Rb наблюдалась при концентрациях уабаина 8 × 10^–8 и 4.5 × 10^–5 M соответственно [17]. Эти резкие различия подтверждены сравнительным анализом дозозависимого действия уабаина на активность Na⁺,K⁺-ATP-азы в мозге крыс [18] и культивируемых нейронах из мозжечка крысы [19].

Ранее было установлено, что ингибирование α1-Na⁺,K⁺-ATP-азы сопровождается резкими изменениями транскриптома клеток ряда тканей, опосредованными диссипацией градиента одновалентных катионов и последующей активацией как Са²⁺-опосредованных, так и Са²⁺-независимых сигнальных систем [20]. В данном исследовании мы использовали резкое отличие сродства к уабаину α1- и α3-Na⁺,K⁺-ATP-азы для изучения участия α3-изоформы в регуляции внутриклеточной концентрации Na⁺ и K⁺ и экспрессии генов в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Первичное культивирование гранулярных клеток мозжечка. Для приготовления первичной культуры гранулярных клеток мозжечка использовали 5–7-дневных крыс линии Wistar Kyoto. Животных содержали в стандартных условиях в виварии при естественном световом режиме и свободном доступе к воде и еде. Для получения первичной культуры клеток мозжечка проводили декапитацию животных, далее в стерильных условиях извлекали мозжечок, как описано ранее [21]. Диссоциацию клеток мозжечка производили с помощью 0.25% раствора трипсин-EDТА (ПанЭко, Россия) в течение 15 мин при 37°C. После инкубации клетки на 2–3 мин помещали в 2–3 мл 10% бычьей сыворотки для остановки реакции (ПанЭко, Россия). Клетки культивировали в нейробазальной среде (Gibco, США) содержащей 2% Supplement B-27 (Gibco, США), 0.5 мM GlutaMax (Gibco, США), 100 ед./мл пенициллина/стрептомицина (ПанЭко, Россия) и 20 мM KCl и с плотностью 1.2 × 10⁵ клеток/см² в шестилуночных плашках, обработанных поли-L-орнитином (Sigma, CША). Клетки культивировали при 37°C, 90% влажности, 5% CO₂ в течение 7 дней. Цитозин β-D-арабинофуранозид (Sigma, CША) добавляли до конечной концентрации 10 мкМ после 24 ч нахождения клеток в культуральных плашках для ингибирования пролиферации астроцитов.

Количественный анализ содержания Na⁺ и K⁺ с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS). Клетки культивировали в 6‑луночных плашках с плотностью 1.2 × 10⁵ клеток/см². Через 3 ч после инкубации с уабаином, клетки дважды промывали холодным раствором 0.1 M MgCl₂ и лизировали в 200 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Лизаты переносили в микропробирки (0.5 мл) и инкубировали в течение 12 ч при 4°C. После инкубации образцы разбавляли до 500 мкл дважды деионизированной водой и проводили измерение на Varian 820-MS (США). Концентрации выбранных элементов (мг/л) измеряли методом внешней калибровки. Данные анализировали с помощью ICP-MS Expert, version 2.1 b-107 (США). Содержание Na⁺ и K⁺ выражали как миллионную долю (м.д.) на образец.

Измерение активности Na⁺,K⁺-ATP-азы. Клетки после инкубации с уабаином разрушали методом замораживания–оттаивания. Далее определение активности Na⁺,K⁺-ATP-азы проводили по накоплению неорганического фосфата, используя метод Ратбуна и Бетлах, основанный на применении хлористого олова в качестве восстановителя. Реакцию проводили в среде инкубации объемом 1 мл, содержащей 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 30 мМ имидазола, 3 мМ MgCl₂, 3 мМ ATP. Количество фермента и время инкубации подбирали экспериментально. Поскольку препараты белков содержали некоторое количество других ATP-аз, таких как Мg-ATP-аза, Ca²⁺-активируемая ATP-аза, H⁺-ATP-аза и ряд других, проводили две серии измерений: измеряли общую активность и уабаин-независимую активность в присутствии 1 мМ уабаина; активность Na⁺,K⁺-ATP-азы рассчитывали как разность этих активностей. Реакцию начинали добавлением ATP в пробу. Для остановки реакции использовали 3 M ацетатный буфер, содержащий 3.7% формальдегида с pH 4.3. Затем в пробы добавляли 0.1 мл 2% раствора молибдата аммония и 0.1 мл раствора хлорида олова, который готовили непосредственно перед определением (15 мг SnCl₂, 4–5 капель концентрированной уксусной кислоты, 5 мл воды). В контрольную пробу после смешивания с ацетатным буфером добавляли белок. Окраска развивалась в течение 15 мин при комнатной температуре. Оптическую плотность раствора регистрировали на приборе Ultrospec 1100 (660 нм).

Выделение суммарной РНК. Суммарную РНК выделяли с помощью набора PureLink® RNA Mini Kit (Ambion, США) по протоколу производителя. Образцы суммарной РНК для предотвращения заражения геномной ДНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с протоколом производителя.

Анализ транскриптома методом микрочипов. Для анализа транскриптома методом микрочипов использовали образцы c показателем целостности РНК больше 7.0 (RIN). Качество РНК оценивали с помощью 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, США). Для анализа транскриптомов контрольных и экспериментальных образцов использовали микрочипы GeneChip® Rat Gene 2.0 ST Array (Affymetrix, США). Суммарное количество транскриптов, определяемое данными микрочипами, составляет 28 407 (по базе RefSeq). Для пробоподготовки с помощью набора GeneChip® WT PLUS Reagent kits (Affymetrix, США) использовали 500 нг РНК. Данный набор проводит реакцию обратной транскрипции с использованием праймеров, связывающих нерибосомную РНК, с получением амплифицированной и биотинилированной ДНК. Далее кДНК (5.5 мг) фрагментировали и метили с помощью набора Affymetrix GeneChipH WT Terminal Labeling Kit (Affymetrix, США), и подвергали гибридизации кДНК (3.5 мг) на микрочипах, используя GeneChip® Hybridization, Wash and Stain Kit (Affymetrix, США). Совместную обработку CEL-файлов и оценку уровня экспрессии генов осуществляли в Affymetrix Expression Console (build 1.4.1.46) стандартным для используемых микрочипов методом RMA-Sketch. Статистический анализ проводили в Affymetrix Transcriptome Analysis Console 3.0. При сравнении групп применяли парный вариант анализа Repeated Measure (paired).

Вестерн-блотинг. Клетки после инкубации с уабаином промывали дважды холодным сбалансированным раствором Хенкса и лизировали в буфере RIPA (Sigma, США), содержащем коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз (Sigma, США). Общую концентрацию белка измеряли, используя набор DC Protein Assay Kit (Bio-Rad, США). Для разделения белков с помощью 15% SDS-PAGE использовали 15 мкг белка, а затем осуществляли электроперенос на PVDF-мембрану методом полусухого переноса. После электропереноса белков PVDF-мембраны блокировали и инкубировали с первичными антителами в течение ночи и с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP). В работе использовали первичные антитела: фосфо-CREB (Ser133) (87G3) mAb (Cell Signaling, США); β-актин (D6A8) mAb (Cell Signaling Technology, США) и вторичные антитела IgG-HRP (Cell Signaling Technology, США). Визуализацию белков осуществляли с помощью наборов SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate или SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с протоколом производителя. Хемилюминесценцию измеряли, используя систему ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad, США). Данные хемилюминесценции анализировали с помощью программного обеспечения Image Lab 3.0 (Bio-Rad, США). В каждом эксперименте контрольные значения были приняты за 100%. β-актин использовали как маркер равномерного нанесения белка.

Статистика. Данные анализировали с помощью программы GraphPad Prism4 с применением однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и критерия Даннета. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сложный характер зависимости активности АТР-азы гранулярных клеток мозжечка от концентрации уабаина (рис. 1) согласуется с данными других исследований [22, 23], и указывает на наличие двух ферментов с высоким и низким сродством к этому ингибитору: высокоаффинной (Ki ~ 10^–7 М) нейрон-специфической α3-Na⁺,K⁺-ATP-азы и низкоаффинной (Ki ~ 10^–4 М) универсальной α1-Na⁺,K⁺-ATP-азы соответственно. Рис. 2 показывает, что инкубация α1- и α3-Na⁺,K⁺-ATP-азы гранулярных клеток мозжечка в течение 3 ч в присутствии 1 мМ уабаина приводит к увеличению ${\text{Na}}_{{\text{i}}}^{ + }$ в 8 раз и снижению в 6 раз содержания внутриклеточного калия $\left( {{\text{K}}_{{\text{i}}}^{ + }} \right).$ Мы не наблюдали значительного изменения этих параметров при селективном ингибировании КТС-чувствительной α3-Na⁺,K⁺-ATP-азы в присутствии 100 нМ уабаина (рис. 2). Эти результаты предполагают, что в базальных условиях ингибирование α3-Na⁺,K⁺-ATP-азы не влияет на внутриклеточную концентрацию Na⁺ и K⁺. Эти выводы согласуются с данными, полученными с помощью Na⁺-чувствительного флуоресцентного зонда SBFI. В этой работе установлено незначительное влияние 10^–6 М уабаина на содержание натрия в культивируемых клетках гиппокампа крысы и нейронах стриатума в отличие от 7-кратного увеличения [Na⁺]_i при воздействии 10^–3 М уабаина [15].

Рис. 1.

Изменение активности Na⁺,K⁺-ATP-азы при действии разных концентраций уабаина. Представлены среднеарифметические значения и значения стандартной ошибки, полученные в трех независимых экспериментах. Исходное значение активности принято за 1.

Рис. 2.

Действие уабаина на внутриклеточное содержание Na⁺ и K⁺ в первичной культуре нейронов мозжечка крыc. Клетки инкубировали в присутствии и в отсутствие 100 нМ и 1 мМ уабаина в течение 3 ч. Внутриклеточное содержание ионов выражено в м.д. Представлены среднеарифметические значения и значения стандартной ошибки, полученные в трех независимых экспериментах.

Из представленных в табл. 1 данных видно, что ингибирование α3-Na⁺,K⁺-ATP-азы в присутствии 100 нМ уабаина в течение 3 ч сопровождалось изменением содержания мРНК 17 генов с максимальным уровнем активации и ингибирования в 1.87 и 1.54 раза соответственно. Ингибирование Na⁺,K⁺-ATP-азной активности 1 мМ уабаином вызывало (в отличие от низких доз) резкие изменения транскриптома, что выражалось в увеличении до 20 раз содержания транскриптов 295 генов и уменьшении до 3 раз содержания 378 генов (табл. 1).

Функциональная классификация генов, при экспрессии которых получаемые белки зачастую многофункциональны, всегда в той или иной степени искусственна. Учитывая это, мы ограничили наш анализ только основными функциональными категориями. Из табл. 2 и 3 видно, что список генов, чья экспрессия изменялась при добавлении 100 нМ уабаина, обогащен генами обонятельных рецепторов. Обонятельные рецепторы кодируются большим семейством генов, число которых в геноме крысы составляет почти 1200 [24]. Функции обонятельных рецепторов, как рецепторов, связанных с G-белками, хорошо изучена на примере эпителиальных клеток. В этих высокоспециализированных клетках связывание пахучих стимулов обонятельными рецепторами приводит к активации аденилатциклазы, увеличению внутриклеточной сАМР и активации сАМР-зависимых Ca²⁺-каналов [25, 26]. Недавно экспрессию обонятельных рецепторов выявили в клетках скелетной мускулатуры и других тканей, не чувствительных к запахам [27]. В скелетных мышцах мышей и крыс эктопические обонятельные рецепторы участвуют в миогенезе [28]. Нами показано что в культивируемых миотубулах C2C12 как уабаин, так и электростимуляция воздействуют на экспрессию обонятельных рецепторов через Ca²⁺-опосредованную передачу сигнала [29]. Функциональная значимость изменений экспрессии эктопических обонятельных рецепторов в нейронах, запускаемых уабаином в низких дозах через ${\text{Na}}_{{\text{i}}}^{{\text{ + }}}/{\text{K}}_{{\text{i}}}^{ + }$-независимые сигнальные пути, остается не изученной.

Резкие изменения транскриптома в гранулярных клетках мозжечка в ответ на воздействие 1 мМ уабаина охарактеризованы нами ранее [30]. Эти изменения, по-видимому, опосредованы увеличением соотношения [Na⁺]_i/[K⁺]_i как следствие полномасштабного ингибирования Na⁺,K⁺-ATP-азы (рис. 1, 2). Этот вывод подтверждается сравнительным анализом дозовой и временной зависимостей действия уабаина и другого кардиотонического стероида маринобуфагенина на внутриклеточное содержание Na⁺ и K⁺ и экспрессию генов в эндотелиальных клетках человека, обогащенных универсальной α1-изоформой Na⁺,K⁺-ATP-азы [31].

Изменения транскрипции небольшого числа генов, отмеченные при воздействии 100 нМ уабаина, предполагают участие α3-изоформы Na⁺,K⁺-ATP-азы как первоначального звена сигнального каскада. Важно отметить, что в этой концентрации, уабаин не оказывал достоверного влияния на внутриклеточное содержание одновалентных катионов (рис. 2). В большинстве типов клеток увеличение соотношения [Na⁺]_i/[K⁺]_i приводит к увеличению [Ca²⁺]_i через активацию Na⁺/Ca²⁺-обменника и/или потенциал-зависимых Ca²⁺-каналов, что, в свою очередь, приводит к фосфорилированию регулятора транскрипции CREB Са²⁺-кальмодулинзависимой киназой [20, 32–34]. В самом деле, инкубация гранулярных клетках мозжечка в течение 3 ч в присутствии 1 мМ уабаина сопровождалась 20-кратным увеличением фосфорилирования CREB (рис. 3). Однако нам не удалось обнаружить статистически значимого увеличения фосфорилирования этого белка в ответ на добавление 100 нМ уабаина. Таким образом, изменение экспрессии генов в нейронах головного мозга под действием уабаина в низких дозах, при которых ингибируется α3-Na⁺,K⁺-ATP-аза, вызвано активацией [Na⁺]_i/[K⁺]_i-независимого сигнального каскада, не связанного с известным Са²⁺-зависимым механизмом регуляции транскрипции.

Рис. 3.

а – Влияние уабаина на активацию CREB в клетках первичной культуры нейронов мозжечка крыс. К культуре клеток добавляли уабаин в концентрации 100 нМ или 1 мМ и инкубировали в течение 3 ч. Исходный уровень фосфорилирования CREB в клетках принят за 100%, данные представлены как среднеарифметические значения и значения стандартной ошибки, полученные в четырех независимых экспериментах. б – Вестерн-блот фосфо-CREB (Ser133) и β-актина в образцах после 3 ч инкубации нейронов с уабаином.

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (16-15-10026) и РФФИ (18-04-00063).