Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2019, T. 36, № 6, стр. 409-416

ВВЕДЕНИЕ

Исследованиями последних десятилетий убедительно показано, что экзогенный NO, а также NO, продуцируемый цитоплазматическими NO-синтазами (NOS), приводят к подавлению дыхания митохондрий, ингибируя цитохром-с-оксидазу (COX) и комплексы I и II цепи переноса электронов [1–6]. Ингибирование COX посредством NO обратимо и конкурентно по отношению к кислороду [1]. В экспериментах, выполненных на клетках НЕК в условиях сверхэкспрессии индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS), показано, что увеличение концентрации L-аргинина в среде от 1 до 10 мкМ приводит к восстановлению цитохромов, накоплению NO и подавлению потребления кислорода [6]. Еще одним источником NO является локализованная на внутренней мембране митохондрий изоформа mtNOS, которая согласно данным, полученным на митохондриях печени и сердца, образуется в результате сплайсинга мРНК нейрональной nNOSa [7–9]. Активация кальций-зависимой mtNOS ее субстратом L-аргинином и Са²⁺ также вызывает ингибирование дыхания митохондрий, сопряженное с резким ростом NO [10]. Как и цитоплазматические формы, mtNOS, является кислород- и NADPH-зависимым ферментом, поэтому продукция митохондриального NO максимальна при высоких значениях мембранного потенциала ΔΨ_m и низких скоростях дыхания митохондрий (в состоянии покоя – в состоянии 4) [10]. NO является источником нитрозотиолов, пероксинитрита, АФК и др., мишенями которых являются многочисленные белки митохондриального метаболизма. Поэтому митохондрия зачастую рассматривается как генератор и мишень действия NO [11] вне связи с регуляторным действием Са²⁺. Глобальный характер действия Са²⁺ на метаболизм митохондрий, включающий активацию белков дыхательной цепи и цикла Кребса [12], активацию синтеза NO, индукцию митохондриальной поры [13, 14], свидетельствует о наличии регуляторного процесса, основанного на взаимном влиянии NO и Са²⁺, который в настоящее время недостаточно изучен.

Учитывая сложный и малоисследованный характер взаимодействия NO и Са²⁺, нами проанализировано влияние доноров NO и L-аргинина на регуляцию дыхания митохондрий. Мы предполагаем, что регуляция дыхания митохондрий с участием Са²⁺-зависимой mtNOS не исчерпывается только нитрозилированием белков митохондрий или ингибированием ферментов дыхательной цепи посредством NO, но может включать также функционирование митохондриальной сигнальной системы с участием mtNOS , гуанилатциклазы (GC) и протеинкиназы G (PKG). Влияние этой системы на метаболизм и дыхание митохондрий недостаточно изучено. Задача настоящей работы заключалась в том, чтобы с помощью ингибиторного анализа показать, что L-аргинин и доноры NO, активируя митохондриальную Ca²⁺→mtNOS→NO→mtGC→cGMP→mtPKG–сигнальную систему (mtNOS/GC/PKG–SS), могут участвовать в регуляции скорости дыхания митохондрий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все процедуры на животных выполнялись в соответствии с директивой ЕС 86/609/EEC и были одобрены комитетом по этике Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Самцов крыс линии Вистар 6–8 недель содержали в одинаковых условиях в кондиционированных и проветриваемых помещениях при температуре 20–22°С (свет/темнота = 12 ч/12 ч). Эксперименты проводили при 26°С. Митохондрии печени выделяли с использованием стандартных методик дифференциального центрифугирования в среде, содержащей 300 мМ сахарозы, 1 мМ EGTA и 10 мМ Трис-HCl (рН 7.4). Митохондриальные препараты дважды промывали средой выделения, не содержащей EGTA, ресуспендировали в среде того же состава и хранили на льду. Инкубационная среда для митохондрий содержала: 125 мМ KCl, 3 мМ KH₂PO4, 10 мМ HEPES (pH 7.4), 1 мМ MgCl₂. Содержание митохондриального белка определяли методом Лоури с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта. Потребление кислорода в митохондриальной суспензии определяли полярографическим методом с помощью O₂-электрода Кларка в закрытой камере объемом 1 мл, содержащей 1.0 мг белка, при постоянном перемешивании. В качестве субстратов дыхания использовали L‑глутамат (10 мМ) и пируват (0.5–1 мМ) для поддержания полного оборота цикла Кребса и сохранения субстратного фосфорилирования в цикле. В некоторых экспериментах дыхание поддерживалось сукцинатом (5 мМ) в присутствии ротенона (1–2 мкМ) или пируватом (1 мМ) и L‑малатом (5 мМ). Все эксперименты выполняли в присутствии 10 ед. гексокиназы, 5 мМ глюкозы и 1 мМ MgCl. Последующие добавки 0.75 мМ ADP обеспечивали высокую стационарную скорость дыхания (VO₂ss = d[O₂]/dt), близкую к максимальной скорости дыхания в состоянии 3 (80–85% от VO₂max). Чтобы оценить статистическую значимость результатов, VO₂ss измеряли в стационарном состоянии при [O₂] = 270‒300 нг-атом О/мл на линейных участках соответствующих полярографических кривых в серии из пяти‒шести экспериментов. Разность электрических потенциалов (ΔΨ_m) на внутренней мембране митохондрий определяли по распределению липофильного катиона тетрафенилфосфония (ТРР⁺), концентрацию которого во внешней среде [ТРР⁺]_out регистрировали с помощью ТРР⁺–селективного электрода. В работе использованы реактивы фирмы Sigma (США). Статистический анализ экспериментальных данных проводили с использованием t-критерия Сигма-Плот 11 для сравнения пар величин. Данные представлены как среднее значение ± S.E.M. n = 4‒6 независимых экспериментов. За уровень значимости принято p <0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Активация и ингибирование дыхания митохондрий SNP и L-аргинином. На рис. 1 представлены полярографические кривые, характеризующие потребление кислорода митохондриями печени крыс при активации скорости дыхания добавками 0.75 мМ АDP в среду. В качестве субстратов окисления использованы пируват (1 мМ) и L-глутамат (10 мМ). Стационарную скорость дыхания поддерживали добавлением гексокиназы и глюкозы в среду инкубации. На рис. 1 представлена также соответствующая динамика митохондриального потециала ΔΨ_m (TPP⁺). Преинкубация митохондрий с низкими концентрациями SNP (20 мкМ; пунктирная кривая на рис. 1а) или L-аргинина (20 мкМ; пунктирная кривая на рис. 1б) вызывает увеличение скорости дыхания митохондрий, что характеризуется увеличением наклона соответствующих кривых.

Рис. 1.

Влияние SNP (слева) и L-аргинина (справа) на потребление кислорода (линии O₂) и митохондриальный потециал ΔΨ_m (линии TPP+) зависит от концентраций этих источников NO в среде. Представлены репрезентативные эксперименты. Черные кривые соответствуют контрольным экспериментам. Пунктирные кривые соответствуют низким концентрациям SNP (рис. 1а, 10 мкМ) и L-аргинина (рис. 1б, 100 мкМ) в инкубационной среде. Серые линии соответствуют высоким концентрациям SNP (рис. 1а, 500 мкМ) и L-аргинина (рис. 1б, 1000 мкМ). Митохондрии инкубировали в закрытой камере объемом 1 мл. Среда инкубации включала 1 мМ пирувата, 10 мМ L-глутамата, а также глюкозу и гексокиназу. в, г – Зависимости средней скорости дыхания в стационарном состоянии VO₂ss от концентраций SNP (в) и L-аргинина (г) в среде. Количество независимых экспериментов n = 5. Данные представляют собой среднее ± S.E.M.

Высокие концентрации SNP (400 мкМ; серая кривая на рис. 1а) и L-аргинина (1000 мкМ; серая кривая на рис. 1б), наоборот, вызывают ингибирование митохондриального дыхания до значений ниже контрольных величин. Наблюдаемое ингибирование дыхания SNP и L-аргинином хорошо известно [1–6].

Такое подавление дыхания может быть вызвано известным ингибированием COX и других белков дыхательной цепи избытком NO, выделяющегося из SNP или продуцируемого mtNOS из L-аргинина [1, 4, 6]. В отличие от ингибирующего эффекта, активация дыхания малыми концентрациями доноров NO^.или L-аргинина обнаружена впервые и наблюдается при разных комбинациях субстратов на разных типах митохондрий. На рис. 2а, 2б (серые линии) показано, что преинкубация митохондрий печени крыс с малыми концентрациями SNP и L-аргинина (20 мкМ) при окислении сукцината (5 мМ) в присутствии ротенона (2 мкМ) также вызывает увеличение стационарной скорости дыхания в сравнении с контролем.

Рис. 2.

Активация потребления кислорода при инкубации митохондрий с малыми концентрациями SNP (а, 5 мкМ) и L-аргинина (б, 20 мкМ). Устранение этой активации ингибитором PKG KT5823 (KT). Представлены репрезентативные эксперименты. Митохондрии (1.0–1.2 мг) инкубировали в закрытой камере объемом 1 мл. Инкубационная среда включала 5 мМ сукцината, 2 мкМ ротенона и гексокиназу. Остальные условия как на рис. 1. Черные линии соответствуют контрольным экспериментам. Серые линии соответствуют низким (активирующим) концентрациям SNP (рис. 2а, 5 мкМ) и L-аргинина (рис. 2б, 20 мкМ). Пунктирные линии показывают устранение активирующего действия SNP и L-аргинина ингибитором PKG KT (1.2 мкМ).

Сходный эффект наблюдается и на митохондриях сердца крыс, преинкубированных с малыми концентрациями SNP и L-аргинина (2–10 мкМ) в присутствии субстратов пирувата (1 мМ) и L-глутамата (10 мМ). Добавление в среду инкубации 5 мкМ L-аргинина вызывало увеличение скорости митохондриального дыхания на 20–25% по сравнению с контролем. Высокие концентрации SNP и L-аргинина также вызывали ингибирование дыхания (не показано).

Влияние ингибиторов mtNOS/GC/PKG–SS на активацию дыхания SNP и L-аргинином. Обнаруженная активация дыхания SNP и L-аргинином (рис. 1, 2) может указывать на вовлечение новых сигнальных механизмов, не связанных с прямым действием NO, нитрозотиолов, пероксинитрита и др. Мы предположили, что сигнальная система mtNOS/GC/PKG–SS может участвовать в регуляции дыхания митохондрий, подобно тому, как это имеет место для митохондриальной сигнальной системы с участием аденилатциклазы и протеинкиназы А (AC/PKA) [15–17]. Результаты, представленные на рис. 2, показывают, что активирующие эффекты 5 мкМ SNP или 20 мкМ L-аргинина (серые кривые) устраняются при наличии в среде инкубации 1.2 мкМ ингибитора PKG KT5823 (КТ). Этот результат свидетельствует об участии mtNOS/GC/PKG–SS и ее финального медиатора PKG в регуляции скорости дыхания митохондрий.

Влияние ингибиторов mtNOS/GC/PKG–SS на торможение дыхания высокими концентрациями SNP и L-аргинина. На рис. 3 показано, что ингибирование дыхания и потребления кислорода, вызываемое преинкубацией митохондрий с большими концентрациями L-аргинина (1 мМ), наоборот, усиливается в присутствии ингибиторов GC (пунктирная кривая [ODQ] = 50 мкМ) и PKG (пунктирная кривая [KT] = 1.2 мкМ). В контроле в состоянии дыхания 4 скорость дыхания митохондрий составляет 14–15 нг-атом О/мин/мг/белка. При достижении максимальной стационарной скорости дыхания, задаваемой ADP-гексокиназной системой, скорость дыхания повышается до 56 нг-атом О/мин/мг/белка В присутствии 1 мМ L-аргинина скорость дыхания уменьшается до 46 нг-атом О/мин/мг/белка. При преинкубации митохондрий с ингибиторами GC (ODQ) и PKG (KТ), происходит дальнейшее торможение дыхания до 28 и 16 нг-атом О/мин/мг/белка, соответственно. На основании этих результатов можно предположить, что защитный эффект сигнальной цепочки mtNOS/GC/PKG–SS, связанный с активацией белков дыхательной цепи посредством PKG, устраняется в присутствии ингибиторов ODQ или KT и доминирующим становится ингибирование дыхания избытком NO, продуцируемого mtNOS.

Рис. 3.

Усиление ингибирования потребления кислорода ингибиторами сигнальной цепочки mtNOS/GC/PKG–SS при инкубации митохондрий с большими концентрациями L-аргинина (1 мМ). Представлены репрезентативные данные. Условия экспериментов такие же, как и на рис. 1. Концентрации ингибиторов ODQ и KT приведены в мкМ.

Влияние модуляции активности mtNOS/GC/PKG–SS на скорость дыхания митохондрий. В сериях из четырех–шести экспериментов были измерены значения стационарной скорости митохондриального дыхания (VO₂ss) при [O] = = 300–320 нг-атом О/мл на линейных участках соответствующих полярографических кривых. Рассчитанные средние значения VO₂ss изображены на рис. 4 в виде столбиков. Левые серые столбики соответствуют контрольным экспериментам с VO₂ss = 91.8 ± 2.7 нг-атом О/мин /мг/белка. Три следующих набора столбиков характеризуют влияние различных концентраций SNP (рис. 4а) и L-аргинина (рис. 4в) на средние значения VO₂ss. Представленные данные показывают, что введение в среду инкубации 5–50 мкМ SNP вызывает увеличение скорости митохондриального дыхания (VO₂ss) в сравнении с контролем. Максимальный эффект 27–28% наблюдается при 10 мкМ SNP (рис. 4а, первый и третий столбики; р < 0.05). Преинкубация митохондрий с ингибиторами ODQ и KT устраняет активацию дыхания, вызываемую 10 мкМ SNP (рис. 4а, столбики 6 и 7; р <0.05).

Рис. 4.

Влияние SNP, L-аргинина и ингибиторов mtNOS/GC/PKG–SS на стационарную скорость потребления кислорода (VO₂ss) при инкубации митохондрий с сукцинатом (5 мМ) и ротеноном (2 мкМ). Все остальные условия, как на рис. 1. Влияние SNP (а) и L-аргинина (б) на величины VO₂ss. Левые столбики представляют контрольные величины. Последующие четыре и три столбика на рис. 4а и 4б, соответственно, характеризуют дозозависимые эффекты SNP (а) и L-аргинина (б) на VO₂ss. Правые столбики описывают влияние ингибиторов 7-NI, ODQ, KT5823 (KT) и 1400W сигнальной системы mtNOS/GC/PKG–SS на VO₂ss. Видно, что преинкубация митохондрий с ингибиторами 7-NI, ODQ и KT приводит к устранению активации дыхания SNP и L-аргинином. Преинкубация митохондрий с 50–100 нМ специфического ингибитора индуцибельной iNOS 1400W не влияет на исследуемые эффекты (рис. 4б, правый столбик). Все концентрации приведены в мкМ. Данные представлены, как средние ± S.E.M. На рис. 4а n = 4 для столбиков 1–5 и n = 6 для столбиков 6 и 7. На рис. 4б: n = 4 для столбиков 1–4 и n = 5 для столбиков 5–8. Символы *^, ** указывают на статистически значимую разницу между сравниваемыми величинами VO₂ss; *^, ** p < 0.05.

Подобно действию SNP, L-аргинин (20 мкМ) увеличивает VO₂ss в сравнении с контролем на 15–16% (рис. 4б, первый и второй столбики; р < 0.05). Ингибиторы NOS (7-NI), GC (ODQ) и PKG (KT) устраняют активацию дыхания, вызываемую L-аргинином (рис. 4б, 5–7 столбики; р < 0.05), что указывает на функционирование всех трех белков сигнальной цепочки mtNOS/GC/PKG-SS. Отсутствие влияния специфического ингибитора 1400W (100 нМ) кальций-независимой iNOS на величину скорости дыхания митохондрий (рис. 4в, столбик 8; р < 0.05) свидетельствует о том, что этот фермент не участвует в продукции NO митохондриальной сигнальной системой mtNOS/GC/PKG-SS в условиях данного эксперимента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты показывают, что PKG может участвовать в регуляции окислительного фосфорилирования. Возможно, это происходит за счет фосфорилирования некоторых митохондрильных белков, подобно механизму, обеспечиваемому каскадом митохондриальной AC/PKA [15–17]. Как следует из наших данных, активация mtNOS/GC/PKG–SS L-аргинином может обеспечить двунаправленный контроль дыхания, который включает активацию дыхания с участием PKG и прямое ингибирование цитохромов избытком NO. Известно, что цитоплазматические изоформы GC имеют примерно в 10 раз более высокое сродство к NO, чем COX [18]. Допуская сопоставимую чувствительность к NO митохондриальной и цитозольных GC, мы можем предположить, что при низких концентрациях L-аргинина (или NO) активация дыхания с помощью PKG, реализуемая при активации mtNOS/GC/PKG–SS L‑аргинином и кальцием, будет доминировать над хорошо известным ингибирующим эффектом NO [1–6].

Функционирование сигнальной цепочки mtNOS/GC/PKG–SS возможно только при наличии и постоянном ресинтезе коферментов NADPH и GTP в матриксе митохондрий, осуществляемом с участием нескольких ферментов. Отсутствие NADPH и GTP в среде инкубации митоходрий исключает возможность функционирования внемитохордриальной цепочки, например, при загрязнении митохондриальной фракции цитоплазматическими белками, включая GC, PKG, дикиназу и др.

Известно, что существуют специальные механизмы, обеспечивающие импорт десятков различных киназ и фосфатаз в митохондрии, включая протеинкиназу В [19, 20]. Можно предполагать, что GC и PKG транспортируются в митохондрии с использованием таких механизмов. Однако прямые экспериментальные данные, свидетельствующие о транслокации PKG и GC в митохондрии, в настоящее время отсутствуют. Это может быть задачей последующих исследований. Тем не менее, представленные результаты, полученные с использованием специфических ингибиторов белков сигнальной системы mtNOS/GC/PKG–SS, указывают на ее возможное функционирование в митохондриях.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (проекты № 14-04-01695 ВД; №14-04-01597 ЕГ). Авторы благодарят М.А. Симонову, М.Х. Галимову и А.И. Сергеева за техническую поддержку.