Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, 2020, T. 37, № 2, стр. 156-160

ВВЕДЕНИЕ

Семейство PI₃-киназ представляет собой группу киназ, способных фосфолилировать некоторые белковые, но преимущественно липидные субстраты, а именно фосфатидилинозитолы (phosphatidylinositols, PtdIns). У млекопитающих идентифицировано 8 изоформ PI₃-киназ, и на основе их функциональных и структурных свойств выделено 3 класса [1]. PI₃-киназы класса I (PI₃KI) катализируют фосфорилирование сигнального липида фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PtdIns(4,5)P2), продуцируя PtdIns(3,4,5)P3, также известный как PIP₃. PI₃-киназы класса II генерируют PtdIns(3,4)P2 и PtdIns3P из PtdIns. PI₃-киназы класса III синтезирует PtdIns3P из PtdIns. Связываясь с PH-доменами различных эффекторных белков, PIP₃ модулирует их локализацию и активность, регулируя широкий ряд биологических процессов, включая клеточный цикл, миграцию клеток и ряд других. Таким образом, PI₃KI действуют как классический посредник передачи сигнала от рецепторов плазматической мембраны внутрь клетки, они вовлечены в передачу сигналов от тирозинкиназных рецепторов, G-белок-связанных рецепторов и малых GTPаз. Представители II и III классов PI₃-киназ в основном регулируют мембранный транспорт и лишь косвенно влияют на сигнальные процессы [2].

У млекопитающих подсемейство PI₃KI представлено четырьмя членами: PI₃Kα, PI₃Kβ, PI₃Kγ и PI₃Kδ в соответствии с их каталитическими субъединицами p110α, β, γ, и δ [1]. Уровни экспрессии изоформ PI₃KI варьируют в различных тканях, p110α и p110β присутствуют в клетках многих тканей, тогда как p110γ и p110δ на высоком уровне экспрессируются в лейкоцитах, а в других тканях присутствуют в меньших количествах. Функции изоформ PI₃KI также различны, например, ключевую роль в инсулиновой сигнализации играет PI₃Kα [3], но не PI₃Kβ [4], в ангиогенезе – PI₃Kα, сперматогенезе – PI₃Kβ [5], в иммунных процессах – PI₃Kγ и PI₃Kδ [6].

Мезенхимные стромальные клетки (МСК) представляют собой гетерогенную популяцию, которая содержит стволовые клетки, способные дифференцироваться и давать начало костной, хрящевой и жировой тканям. МСК присутствуют практически во всех тканях взрослого организма, однако наиболее доступными для их выделения источниками являются костный мозг и жировая ткань. МСК обладают высоким потенциалом для использования в регенеративной и клеточной медицине, и изучение их рецепторных и сигнальных систем является важной задачей на пути к более глубокому пониманию физиологии этих клеток. Роль различных изоформ PI₃-киназ в физиологии МСК на сегодняшний день в целом не очерчена, и в литературе имеются лишь разрозненные сведения об их вкладе в функционирование МСК. Так, например, показано, что уровень экспрессии белков PI₃K/Akt каскада повышается в процессе адипогенной дифференцировки, а ингибиторы PI₃-киназ понижают ее эффективность, что свидетельствует о важной роли PI₃-киназного пути для адипогенеза [7, 8]. При этом PI₃K/Akt-путь также вовлечен и в остеогенную дифференцировку МСК [9].

Ранее нами было показано, что в МСК, выделенных из жировой ткани человека, присутствует субпопуляция клеток, в которых аппликации экстраклеточного ATP вызывают мобилизацию внутриклеточного Са²⁺. Ответы на ATP генерируются по принципу “все или ничего”, и механизм их генерации включает две стадии. На первой – активированный ATP P2Y-рецептор посредством G-белка стимулирует фосфолипазу С, которая гидролизует фосфолипид PIP₂ и продуцирует два вторичных медиатора – IP₃ и DAG. В свою очередь, PI₃ стимулирует IP₃-рецепторы, функционирующие в Са²⁺-депо, что приводит к выбросу депонированного Са²⁺, зависящему от концентрации агониста. Вторая стадия наблюдается, только если внешний стимул достигает некоторой пороговой величины, при которой первоначальный локальный внутриклеточный Са²⁺-сигнал достигает определенного уровня, достаточного, чтобы инициировать Са²⁺-индуцированный выброс депонированного Са²⁺ (Са²⁺-induced Са²⁺ release, CICR), развивающийся за счет стимуляции ионами Са²⁺ IP₃-рецепторов [10]. Механизм CICR продуцирует глобальный Са²⁺-ответ, не зависящий от концентрации агониста [11].

Одним из существенных вопросов, возникающих при изучении этой системы, является вопрос о том, какие внутриклеточные регуляторные системы определяют порог возникновения CICR как ключевого механизма усиления в каскаде трансдукции агонистов в МСК. Как было показано нами ранее, Са²⁺-ответы пуринергических МСК на нуклеотиды модулируются и подавляются в присутствии LY294002, являющегося ингибитором PI₃-киназы (phosphoinositide 3‑kinase) [12]. Хотя это свидетельствовало о том, что PI₃-киназа контролирует пуринергическую трансдукцию в МСК, механизмы этого явления остались невыясненными. Описанные ниже эксперименты представляют собой попытку очертить роль различных изоформ PI₃-киназы в этом процессе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение клеток. В данной работе исследовали МСК из жировой ткани человека, выделение и поддержание первичной культуры которых подробно описано ранее [13]. Выделенные МСК культивировали в 12-луночном планшете в среде Advance Stem (HyClone) с 10% Advance Stem Supplement (HyClone). При достижении 80% монослоя клетки пассировали. Клетки обрабатывали раствором Версена (Sigma) и HyQTase Cell Detachment Solution (HyClone), а затем рассаживали. В экспериментах использовали МСК 2–4 пассажей.

Микрофотометрия. Клетки прикрепляли с помощью адгезивного материала Cell Tak на дно фотометрической камеры и инкубировали при комнатной температуре (23–25°С) в присутствии проникающего через мембрану препарата Fluo-4AM (4 мкМ) и детергента Pluronic (0.02%) (оба Molecular Probes, США) в течение 20 мин, что обеспечивало загрузку клеток Са²⁺-зондом Fluo-4. Затем клетки отмывали внеклеточным раствором, в котором их выдерживали 40 мин при 4°С. Внеклеточный раствор содержал (мМ): NaCl – 110, KCl – 5.5, CaCl₂ – 2, MgCl₂ – 0.8, HEPES – 10, глюкозу – 10. Фотометрические эксперименты проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 135 (Zeiss, Германия), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20x/0.75 и цифровой ECCD камерой LucaR (Andor Technology, США). Флуоресценцию клеток, нагруженных Fluo-4, возбуждали при длине волны 480 ± 5 нм, а эмиссию регистрировали в области 535 ± 20 нм. Изменение концентрации цитозольного Са²⁺ в индивидуальных клетках оценивали по относительному изменению интенсивности флуоресценции целой клетки (ΔF/F₀), где ΔF = F₀ – F, F и F₀ – текущая интенсивность эмиссии Fluo-4 и его эмиссия в начале регистрации соответственно. Количественный фотометрический анализ изображений осуществлялся с использованием программы Imaging Workbench 6 (INDEC, США). Использованные в экспериментах соли, HEPES, глюкозу и ATP приобретали у Sigma–Aldrich (США); специфические ингибиторы PI₃Kα – GSK 1 059 615, PI₃Kβ – AZD 6482, PI₃Kγ – AS 605 240 были получены от Tocris (Великобритания), PI₃Kδ – IC 87 114 – Calbiochem (США).

Молекулярная биология. ОТ-ПЦР. Тотальная РНК выделялась из суспензии МСК, содержащей до 10⁶ клеток, с использованием набора GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (Sigma). Удаление остатков геномной ДНК из образцов РНК и реакция обратной транскрипции проводились с использованием набора SuperScript IV VILO Master Mix with ezDNAse enzyme в присутствии случайных, гексамерных праймеров по протоколу производителя (Invitrogene). Для ПЦР использовалась готовая смесь ScreenMix-HS (Евроген) и следующие ген-специфические праймеры, комплементарные всем возможным транскрипт-вариантам генов, кодирующих каталитические субъединицы PI3KI, включая p110α (5'-GACAAGAACAAAGGAGAAATATATG-3', 5'-AACACATCTCCTGAAACCTC-3'), P110β (5'-GTCAAAAAAACTGGCCAGCTC-3', 5'-TTCCCTAATGCAAGAGAGTCC-3'), P110δ (5'-ATCT-TTAAGAACGGGGATGAC-3', 5'-AAAATCAATGTGGAACAGCTG-3'), P110γ (5'-AATCCCCTA-CTGAAGAAAAGTTTC-3', 5'-TAAGCCTTAACA-CAGATGTCC-3'). Ожидаемый размер продуктов был 306, 316, 407 и 309 п.н. соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В данной работе проводились эксперименты с применением транскриптомного анализа и микрофотометрии, чтобы выявить изоформы PI₃KI, функционирующие в МСК. С этой целью в препаратах РНК, выделенной из суспензии МСК, осуществляли поиск транскриптов генов, кодирующих каталитические субъединицы PI₃KI, включая PI₃Kα, PI₃Kβ, PI₃Kδ и PI₃Kγ. Для этого использовали метод ОТ-ПЦР и ген-специфичные праймеры, которые были сконстрированы на основе имеющихся в базе данных последовательностей человеческих генов PI₃KI и были комплементарны всем возможным транскрипт-вариантам этих генов. Оказалось, что все три образца РНК, полученные независимо из трех препаратов МСК, содержали транскрипты генов PI₃Kα, PI₃Kβ, PI₃Kδ, в то время как транскрипты гена PI₃Kγ не были обнаружены (рис. 1а).

Рис. 1.

Функциональная экспрессия изоформ PI₃-киназы в МСК. а – Транскрипты генов PI₃Kα, PI₃Kβ и PI₃Kδ, идентифицированные в препаратах МСК (n = 3). Ампликоны ожидаемого размера 306, 316 и 407 п.н. соответствуют PI₃Kα, PI₃Kβ и PI₃Kδ. Транскрипты гена PI₃Kγ (309 п.н.) не детектировались. В качестве маркеров молекулярных весов (M) использовался GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas). Агарозный гель (1.3%) окрашивался бромидом этидия. б, в – Репрезентативные регистрации Са²⁺-ответов клетки на 2 мкМ АТР в контроле и в присутствии ингибиторов PI₃Kα GSK 1059615 (20 мкМ) и PI₃Kβ AZD 6482 (20 мкМ) (б, n = 52; в, n = 11). Моменты аппликации АТР и ингибиторов обозначены горизонтальными отрезками выше экспериментальной кривой. г – Репрезентативный (n = 27) ответ клетки на 2 мкМ АТР в контроле и в присутствии ингибитора PI₃Kγ AS 605 240 в концентрациях 20–100 мкМ. д – Репрезентативный (n = 33) ответ клетки на 2 мкМ АТР в контроле и присутствии ингибитора PI₃Kδ IC87114 в концентрациях 20–100 мкМ. Во всех случаях изменение внутриклеточного Са²⁺ характеризовали относительной флуоресценцией Fluo-4 ΔF/F₀, где ΔF=F – F₀, F – текущая интенсивность флуоресценции, F₀ – средняя интенсивность флуоресценции в начальный момент регистрации.

В дополнение к транскриптомному анализу проводили функциональные тесты. МСК нагружали Са²⁺-зондом Fluo-4, и их чувствительность к АТР оценивали по Са²⁺-сигналам, инициируемым этим нуклеотидом в цитоплазме клеток. В общей сложности в нами было проанализировано 398 МСК, из которых 124 (31%) были идентифицированы как пуринергические, поскольку в этих клетках регистрировалось повышение концентрации внутриклеточного Са²⁺ в ответ на аппликацию ATP (1–5 мкМ) (рис. 1б–1д). Как оказалось, ингибитор PI₃Kα (GSK 1 059 615) блокировал ответы МСК на АТР в 52 (69%) из 75 протестированных в данном типе эксперимента пуринергических МСК (рис. 1б), при этом в 11 клетках (15%) ингибитор PI₃Kβ (AZD 6482) также подавлял ответы на АТР (рис. 1в). В то же время ингибитор PI₃Kγ (AS 605 240) не влиял на способность МСК генерировать Са²⁺-ответы на ATP в широком диапазоне концентраций (20–100 мкМ) (n = 27) (рис. 1г). Этот факт вполне согласуется с данными экспрессионного анализа об отсутствии транскриптов PI₃Kγ в препаратах РНК, выделенных из популяции МСК (n = 3) (рис. 1а). Хотя транскрипты гена PI₃Kδ детектировались (рис. 1а), роль этой изоформы PI₃K в генерации ответов на АТР выявлена не была – в присутствии ингибитора PI₃Kδ (IC 87114, 20–100 мкМ) (n = 33) МСК генерировали полноценные Са²⁺-ответы на АТР (рис. 1д). Вероятно, PI₃Kδ проявляет свою регуляторную активность в других внутриклеточных процессах, не связанных с генерацией агонист-индуцированных Са²⁺-ответов.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в большинстве пуринергических МСК для полноценной генерации Са²⁺-ответов на АТР требуется активная PI₃Kα. При этом в небольшой субпопуляции этих клеток PI₃Kβ-изоформа также вовлечена в пуринергическую трансдукцию.

Хотя приведенные данные не позволяют в деталях определить роль выявленных изоформ PI₃K класса I, интересным является тот факт, что PI₃Kα, PI₃Kβ, PI₃Kδ принадлежат к подклассу А, представители которого, как правило, сопряжены с тирозинкиназными рецепторами. Изоформа PI₃Kγ, которая не была обнаружена нами в МСК, является единственным представителем PI₃K класса IВ, который преимущественно активируется βγ-субъединицей GPCR-рецепторов [1]. Эти факты указывают на потенциальную возможность того, что сигнальные процессы, инициируемые в МСК агонистами GPCR-рецепторов, могут модулироваться при участии тирозинкиназных рецепторов.

Работа поддержана Российским научным фондом (грант 17-75-10 127).